公共科学图书馆一号。2011; 6（1）：e15861。
在抗炎症环境中诱导增强黏膜HIV-1抗体反应的新策略
,1,* ,1 ,2 ,1 ,三 ,三 ,4和1
弗兰克·韦格曼
1英国牛津大学威廉·邓恩爵士病理学院
乔治·克拉希亚斯
1英国牛津大学威廉·邓恩爵士病理学院
科尔斯汀·吕恩
2英国牛津大学威瑟尔分子医学研究所
卡罗琳娜·拉马宁
1英国牛津大学威廉·邓恩爵士病理学院
苏埃利·维埃拉
三英国伦敦帝国理工学院医学院杰弗里斯信托研究实验室
西蒙·杰夫斯
三英国伦敦帝国理工学院医学院杰弗里斯信托研究实验室
昆廷·J·萨滕托
1英国牛津大学威廉·邓恩爵士病理学院
鲁珀特·考尔，编辑器
1英国牛津大学威廉·邓恩爵士病理学院
2英国牛津大学威瑟尔分子医学研究所
三英国伦敦帝国理工学院医学院杰弗里斯信托研究实验室
4英国伦敦大学圣乔治感染中心
加拿大多伦多大学
构思并设计了实验：QJS RJS FW。执行实验：GK K.Luhn K.Laamanen。分析数据：FW RJS QJS K.Luhn。贡献的试剂/材料/分析工具：SAJ SV。撰写论文：QJS FW。
收到日期：2010年8月18日；2010年11月25日接受。
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- 补充资料
图S1：
免疫原的生化特性。(A类)HIV-1 gp140的抗原分析中国核54使用表位定义的单克隆抗体和可溶性CD4与HIV-1 IIIB gp140进行比较。在基于表面等离子体共振的结合分析中，分析物的相对结合以响应单位（RU）-范围给出：-=0-150RU；+ = 151-500俄罗斯卢布；++ = 501-1500俄罗斯卢布；+++ = 1501 RU以上。显示了两个独立实验的平均值(B类)抗原的蓝色天然PAGE分析。gp140标准54元人民币表观天然分子量约为480 kDa。（畅通节能法）
GUID:EFE46A42-A32B-4B9C-9A7C-7FD391314788
图S2：
阴道灌洗液样本的总免疫球蛋白含量以及兔抗原特异性阴道和血清IgG的相关性。兔总IgA(A类)和IgG(B类)阴道灌洗液样本含量与皮尔逊相关性(C类)实验第11周的家兔阴道和血清IgG反应.（畅通节能法）
GUID:47A7184A-BFE3-47B6-A3CF-43FACDEBDA10
摘要
预防HIV-1性传播的疫苗接种可能需要在生殖器粘膜表面激发抗体。然而，基于HIV-1包膜糖蛋白（Env）的抗原具有弱免疫原性，特别是当以粘膜方式应用时。聚阴离子PRO 2000对人类阴道用药是安全的，因此可能是阴道给药实验疫苗免疫原的潜在制剂。基于其生化特性，我们假设PRO 2000可能增强HIV-1包膜糖蛋白（Env）抗原的粘膜免疫原性，促进局部和全身免疫反应。与单独使用Env相比，Env-PRO 2000阴道免疫导致小鼠和兔子的Env特异性粘膜IgA和IgG滴度显著增加，表明PRO 2000的粘膜佐剂活性适中但显著。在体外，PRO 2000与Env相关，保护糖蛋白在人类阴道灌洗中免受蛋白水解降解。出乎意料的是，PRO 2000拮抗TLR4激活，抑制局部炎性细胞因子的产生。由于炎症介导的病毒靶细胞募集是HIV-1传播的主要风险因素，PRO 2000的免疫调节和抗炎活性及其阴道内安全性特征表明其有望成为HIV-1粘膜疫苗的配制剂。
介绍
尽管发展中国家越来越多地获得抗逆转录病毒药物，但仍需要预防或减少HIV-1的性传播，以遏制疫情的持续增长[1]预防接种是预防多种传染病最有效的策略之一。然而，有效的HIV-1疫苗仍然不可用。HIV-1疫苗设计的一个主要要素是通过免疫重组HIV-1包膜糖蛋白（Env）或其工程片段来诱导中和抗体[2],[3]由于HIV-1主要通过性传播，引发抗体屏障的最合适部位是生殖器粘膜[4],[5]目前，我们不知道如何通过常规免疫策略诱导对HIV-1的长期粘膜免疫，粘膜表面获得高抗体滴度似乎受不同于系统免疫系统的机制调节[6],[7]因此，诱导长期粘膜免疫可能需要直接向粘膜接种疫苗，尤其是在需要有效诱导抗原特异性IgA分泌的情况下[8]然而，HIV-1环境抗原通常缺乏强大的固有免疫原性，目前还没有许可的粘膜佐剂。此外，考虑在粘膜环境中使用佐剂时必须谨慎，因为在粘膜中应用佐剂配方可能会诱发局部炎症，通过招募活化的CD4+T细胞（这是HIV-1体内复制的主要靶细胞）可能增加HIV-1传播风险[9],[10],[11]因此，用于粘膜HIV-1免疫的佐剂将理想地促进免疫应答，同时维持非炎症环境。
在缺乏疫苗的情况下，目前正在制定的另一项减少HIV-1传播的战略是使用局部杀微生物剂[12].PRO 2000是一种阴离子聚合物，目前正在作为候选杀微生物剂进行研究，但最近被证明在预防HIV-1传播方面无效[13]然而，PRO 2000在阴道用药方面有着良好的安全记录，没有证据表明存在局部毒性或刺激性[14],[15],[16]并且已经证明可以抑制女性阴道炎症介质的生成[17]此外，作为凝胶PRO 2000在阴道道中的停留时间相对较长[16]基于这些原因，PRO 2000可能是阴道应用的HIV-1疫苗抗原的有效配方制剂。另一点是与其他多阴离子类似[18],[19]PRO 2000可逆结合病毒HIV-1 gp120[20]因此可能与基于Env的可溶性重组候选疫苗抗原相互作用，从而改变其抗原性。与gp120结合的聚阴离子选择性地可逆地遮蔽含有正电荷的抗原表面，包括V3环和CD4诱导的（CD4i）表面[18],[19]大多数V3回路被认为变量太大，无法作为广泛的中和目标[21]和CD4i表位很难获得完整病毒尖峰上的抗体，因此是较差的中和抗体靶点[22]因此，我们假设在疫苗配方中形成可逆的gp140-PRO 2000复合物可能通过重新定向免疫反应到更保守的中和相关表面来提高gp140的抗原性，还可能作为一个仓库，增加抗原驻留时间，从而提高免疫原性。因为碱性氨基酸形成了大多数蛋白酶的裂解位点[23]，我们还假设Env与多阴离子的络合可能保护糖蛋白不被蛋白水解消化，从而进一步提高完整抗原在粘膜表面的驻留时间。这对糖蛋白（如HIV-1 gp120）尤其重要，其中许多保守的中和表位高度构象且不连续[24],[25].
在这里，我们提供了原理证明，来自分支B/C HIV-1分离物的重组三聚体gp140与聚阴离子PRO 2000的联合制剂，由于TLR4拮抗作用，导致抗原性得到良好的修饰，免疫原性增加，并且意外地减少了粘膜炎症反应。因此，我们得出结论，PRO 2000可能是阴道接种疫苗的有效制剂。
结果
阴道应用gp140-PRO2000复合物在小鼠体内的免疫原性
三种形式的HIV-1 Env可能在诱导中和抗体反应方面更优越[26],[27],[28]Clade C在全球HIV-1大流行中占据主导地位[29]因此，我们使用了一种可溶性三聚体形式的HIV-1 Env，它包含来自分支B/C重组CCR5-tropic（R5）中国病毒分离物96CN54的膜外Env序列（gp140），作为抗原，这里称为gp14054元人民币该抗原是按照良好的生产实践标准生产的，并且含有检测不到的内毒素污染水平。分别通过表面等离子共振（SPR）分析和蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）评估抗原性和三聚性。抗原结合了几个构象依赖性配体，包括可溶性CD4（sCD4）和中和单克隆抗体（NmAb）IgG1b12[30],[31]sCD4结合后，与CD4诱导的（CD4i）表面结合的单抗增加(图S1). 综上所述，这些数据表明该抗原采用适当的折叠构象，并呈现至少一个保守的中和表位。
阴道通常被认为是免疫诱导的不良部位[32]这表明，在没有佐剂的情况下施用抗原不太可能引发强烈的适应性免疫反应，而且确实可能引发耐受性反应[33]为了测试PRO 2000是否调节阴道应用的Env抗原的免疫原性，用12.5µg gp140对两组小鼠进行四次阴道内免疫54元人民币在单独的对照凝胶中或在补充有1%PRO 2000的对照凝胶中。此处使用的PRO 2000被证实含有<0.05 U/mL的内毒素。阴道灌洗分析显示，只有接受PRO 2000凝胶中gp140的组，而不是仅接受抗原的组，其阴道IgA反应显著高于免疫前样本(). 在PRO 2000中注射gp140引起的gp140特异性IgA反应在第59天的最终增强时间到第210天的实验结束之间保持稳定，这意味着这些反应具有出乎意料的良好耐久性。在第210天，抗原+PRO 200组的终点IgA滴度比单独接受抗原的组高约5倍。此外，当通过集体分析第一次免疫后的所有时间点来直接比较两组时，发现有显著差异(第页 = 0.0286，Mann-Whitney试验）。仅在一个时间点接受抗原的动物的阴道IgG滴度显著高于基线水平，但在PRO 2000中接受gp140的小鼠的三个时间点显著增加()尽管滴度相对较低且迅速下降。首次免疫后，通过对所有时间点的集体分析，直接比较两组的阴道IgG滴度，未发现显著差异。此外，我们无法检测到血清中的任何系统反应（数据未显示）。综上所述，这些数据表明PRO 2000主要增强小鼠的分隔粘膜IgA反应。
PRO 2000联合应用可提高小鼠的粘膜抗体反应。用12.5µg gp140+/-1%PRO 2000阴道免疫BALB/c小鼠（n=7）四次；阴道灌洗IgA的时间进程(A类)和IgG(B类)终点滴定。gp140+专业表示gp140和PRO 2000的组合。滴定数据经过对数转换，显示为平均值±SEM。灰色虚线表示ELISA检测限*第页<0.05**第页<0.01.
阴道应用gp140-PRO2000复合物对家兔的免疫原性
为了评估PRO 2000在第二个物种中的免疫调节活性，我们用单独载体凝胶或PRO 2000凝胶中配制的抗原对兔子进行阴道免疫。我们观察到，在第二系列增强后，在PRO 2000存在的情况下，兔子的全身和阴道IgG反应显著增加(). 阴道灌洗液中抗原特异性IgA的检测结果显示，与免疫前血清相比，其抗体滴度有所增加，但gp140单独组和gp140-PRO 2000组的抗体滴度在统计学上相当，表明PRO 2000在该物种中没有显著增加IgA应答(). 为了测试阴道免疫是否在阴道粘膜诱导中和活性，在假病毒中和试验中分析了12周的兔阴道灌洗液样品。显著中和敏感的1级异源C类假病毒（MW965）[34]两组均观察到（Wilcoxon符号秩检验第页 = 分别为0.0313），与gp140单独组相比，gp140+PRO 2000免疫兔的中和作用显著增加(,第页 = 0.0278，未配对t吨-测试）。不幸的是，阴道灌洗的产量有限，无法进一步分析环境价值来自其他病毒克隆。中和能力的增加也可能由PRO 2000诱导的抗病毒介质或免疫球蛋白分泌介导，但最近的临床研究表明，PRO 2000抑制了免疫介质的分泌，而不是诱导其分泌[17]阴道和全身IgG滴度显著相关(图S2C)和阴道灌洗样本的中和能力()而阴道总免疫球蛋白水平在研究组之间无明显差异(图S2A–B). 这强烈表明中和作用是由于兔子的局部免疫合法抗体反应。
PRO 2000联合应用可提高家兔的全身和粘膜抗体反应。新西兰白兔（n=6）在有或无1%PRO 2000的情况下，接受了6次阴道免疫，每次剂量使用50 mg抗原。(A类)兔血清IgG终点滴度的时间过程。(B类)第12周阴道灌洗样品的终点IgG滴度。(C类)第12周阴道灌洗样品的终点IgA滴度。(D类)第12周阴道灌洗样本的MW965伪病毒中和。水平条表示几何平均值。样品以1∶8的稀释度进行测试；100%感染水平由免疫前样本确定。(E类)兔血清和阴道gp140特异性IgG反应与MW965假病毒中和的相关性(D类)第12周的样本。红色符号表示用gp140+PRO 2000免疫的动物的数据。预通讯表示首次免疫前采集的样本；gp140+专业表示gp140和PRO 2000的组合。滴定数据经过对数转换，显示为平均值±SEM。灰色虚线表示ELISA检测限*第页<0.05**第页<0.01.
抗原+PRO 2000配方的第二种佐剂
为了进一步提高阴道Env免疫的免疫反应，我们将抗原-PRO 2000与鼻内初步免疫相结合，这是一种公认的阴道粘膜免疫诱导剂[35],[36],[37]由于鼻腔免疫不太可能引发生殖器粘膜炎症，因此与生殖器HIV-1传播风险增加无关，因此我们通过鼻内途径使用更有效的佐剂进行免疫。这种粘膜引发佐剂是一种聚阳离子剂()[38],[39]它具有内在的佐剂活性，并诱导平衡的Th反应（我们未发表的数据）。与之前的实验相比，接受初次免疫和三次阴道免疫的小鼠具有容易检测到的gp140特异性血清和阴道IgG反应，在gp140+PRO2000强化组中显著高于gp140单独组(,第页 = 分别为0.0195和0.0305，未配对t吨-测试）。此外，与单独使用gp140相比，gp140+PRO2000组的阴道IgA反应增加了3倍()尽管这一趋势没有达到显著水平。因此，在第二个部位用异源佐剂进行粘膜启动可增强局部和全身抗体反应。
在PRO 2000存在的情况下进行第二次免疫可增加全身和粘膜抗体反应。BALB/c小鼠（n=7）经鼻内注射聚阳离子中每只动物10µg gp140，并在阴道内注射gp140+/−PRO 2000三次。在最后一次阴道免疫后14天收集样本。血清IgG终点滴度(A类)或阴道灌洗IgG(B类)和IgA(C类)显示分别归一化为总IgG或IgA含量或每个样品的终点滴度。gp140+专业gp140和PRO 2000的组合*第页<0.05。
PRO 2000诱导辅助性T细胞2型（Th2）免疫偏倚
最近已经证明，病毒靶细胞的募集，主要是T辅助型1（Th1）激活的CD4+T细胞是粘膜HIV-1复制的主要焦点，是影响阴道慢病毒感染结局的重要因素[11]由于Th1偏倚和T细胞募集主要由促炎症环境驱动，我们希望确定pro 2000是否影响粘膜Th偏倚。IgG1/IgG2a比率表明Th2/Th1适应性免疫偏倚。年报告的血清样本中抗原特异性IgG1/IgG2a比率分析研究表明，与单独使用gp140增强的小鼠相比，使用gp140+PRO 2000联合增强的小鼠的IgG1/IgG2a比率明显更高(
第页 = 0.0055，Mann-Whitney试验），暗示Th2-偏向反应。为了进一步研究PRO 2000、gp140+PRO 2000或gp140单独用于弗氏完全佐剂（FCA）的Th2偏向活性，弗氏完全辅剂是一种特性良好且有效的Th1佐剂[40].血清样本显示出统计上无法区分的gp140特异性IgG1反应()，但IgG2a滴度显著降低(,第页 = 0.0181，未配对t吨-试验）并显著增加IgG1/IgG2a滴度比(,第页 = 0.0379，Mann-Whitney试验）。对T细胞细胞因子谱的分析证实了PRO 2000诱导的局部Th2偏倚。来自阴道免疫小鼠阴道训练腹股沟淋巴结的细胞（来自)分别于第1天和第3天用gp140培养上清进行多重细胞因子/趋化因子分析。在用gp140+pro 2000免疫的小鼠中，观察到Th2-细胞因子IL-4水平显著升高，而促炎细胞因子TNF-α和IL-1α水平降低()诊断Th2偏倚并证明PRO 2000的抗炎活性。此外，在gp140+PRO 2000免疫动物的培养物中，趋化因子CCL2（MCP-1）显著降低(). CCL2已被证明增加HIV-1进入静止CD4+T细胞[41]并触发HIV-1敏感靶细胞的招募[42]因此，CCL2分泌减少可能会阻碍HIV-1在阴道粘膜内的复制。
PRO 2000联合给药对T辅助细胞反应类型的影响。血清特异性IgG1-和IgG2a滴度分别作为Th2或Th1型反应的指标。(A类)阴道免疫小鼠的血清IgG1/IgG2a终点滴度比（如). (B–D类)BALB/c小鼠（n=7）用FCA中的gp140+/−PRO 2000进行皮下注射，并使用相同的路线和配方（不含FCA）进行增强。(B类)血清IgG1终点滴度；(C类)IgG2a终点滴度；(D类)IgG1/IgG2a终点滴定比。gp+专业，gp140和PRO 2000的组合*第页<0.05**第页<0.01.
PRO 2000的免疫调节活性。来源于阴道免疫小鼠阴道训练腹股沟淋巴结的单核细胞（如)在有15µg/ml gp140存在的情况下进行培养，并在培养的第1天和第3天通过多重分析测定上清液中细胞因子/趋化因子的浓度。(A类)白细胞介素-4(B类)肿瘤坏死因子-α(C类)IL-1α(D类)CCL2。显示单个小鼠的结果。普通合伙人，gp140；赞成的意见gp140和PRO 2000的组合*第页<0.05。
PRO 2000干扰TLR4信号
诱导Th2偏向性免疫反应的一种机制可能是PRO 2000对抗由常驻菌群带来的默认阴道Th1环境。PRO 2000在结构上与硫酸右旋糖酐有关，最近研究表明，硫酸右旋糖通过未知机制抑制TLR4诱导的树突状细胞成熟[43]因此，我们研究了PRO 2000是否通过干扰TLR4介导的信号来影响Th偏倚。我们用超纯刺激小鼠TLR报告细胞系明尼苏达州南部在没有或存在PRO 2000的情况下进行LPS。PRO 2000以剂量依赖的方式阻断LPS对细胞的刺激()而Pam3CSK4（TLR2激动剂）介导的对同一细胞系的刺激不受PRO 2000的影响(). 为了评估PRO 2000是否可以直接结合TLR4并阻断LPS结合，我们使用SPR量化PRO 2000与TLR4和MD-2的LPS结合复合物的相互作用。PRO 2000与固定化人TLR4:MD-2强烈相互作用(). 由于LPS通过其脂质A部分与TLR4:MD-2相互作用，我们分析了PRO 2000是否与TLR4：MD-2复合物上的脂质A相互作用位点特异结合。可溶性TLR4:MD-2（含或不含PRO 2000）以不同摩尔比流过固定化脂质A。我们证实了先前的观察结果，即可溶性TLR4:MD-2与固定化脂质A直接相互作用，而PRO 2000没有检测到脂质A结合(). 当联合注射PRO 2000时，脂质A-TLR4:MD-2的相互作用以剂量依赖性的方式被抑制，并被PRO 2000的10倍摩尔过量所抵消。这些数据表明，PRO 2000结合TLR4:MD-2，从而抑制LPS与受体的结合。
PRO 2000抑制LPS信号传导并抑制TLR4-MD2-lipid A相互作用。用超纯LPS激活小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）TLR报告细胞(A类，对应于B）中的图例或与合成TLR2激动剂Pam3CSK4(B类)在存在10、30或90µM PRO 2000或仅在介质中。显示了三倍±SD的平均值。用于表面等离子体共振结合分析(C–D类)，TLR4:MD2复合物固定在CM5芯片上(C类)，并观察到100µM PRO 2000或低分子右旋糖酐的结合，或脂质A固定在HPA芯片上(D类)并观察到155 nM TLR4:MD2、1.54µM或77 nM PRO 2000或其组合的结合。
gp140-PRO2000复合物的抗原性和稳定性
先前的一项研究报告了来自MN和YU2分离株的HIV-1 gp120与PRO 2000之间的可逆相互作用[20]由于这种相互作用可能通过掩蔽某些抗原表面在体外和体内暂时改变抗原性，我们测试了PRO 2000是否与gp140相互作用54元人民币使用SPR.PRO 2000在固定化的gp140上流动54元人民币并显示出快速结合和缓慢解离速率(). 为了探测结合特异性，我们分析了PRO 2000对已知表位特异性单克隆抗体与gp140结合的干扰(). CD4i表面（E51、X5）和V3环（19b）特异的单克隆抗体被有效抑制，这与多阴离子结合这些表面的概念相一致[18],[19]相比之下，广泛中和的单抗b12的表位没有被PRO 2000所掩盖，但在PRO 2000结合后，其表位略微暴露（～40%）()这可能有助于诱导这种特异性抗体。
PRO 2000绑定gp14054元人民币协同受体结合位点，防止阴道灌洗介导的降解。(A类)gp140标准54元人民币控制蛋白BSA固定在CM5传感器芯片上，100µM PRO 2000流过芯片。显示了三个独立实验的平均曲线（实线）±SD（虚线）。(B类)使用固定化gp140通过ELISA测定PRO 2000与单克隆抗体结合（在50%结合浓度下使用的单克隆抗体）的竞争54元人民币; 显示了三倍±SD的平均值。(C类)gp140的Western blot54元人民币在37°C下单独培养或在100µM PRO 2000存在下培养指定时间段的人阴道灌洗液中。未分离的gp140显示160 kDa的表观摩尔重量。(D类)四个独立稳定性实验的量化±SD*第页<0.05。
由于大多数蛋白酶识别含有基本氨基酸的序列，并且由于PRO 2000结合带正电荷的表面，我们假设PRO 2000可能掩盖蛋白水解裂解位点并保护抗原不被降解。为了验证这一假设，我们通过蛋白质印迹监测了人类阴道灌洗液中的抗原降解(). 在没有PRO 2000的情况下，gp140迅速降解为半衰期约为2小时的肽片段，而在有PRO 2000存在的情况下半衰期显著延长至约24小时。因此，PRO 2000与保护其免受蛋白水解降解的抗原可逆相互作用，从而可能增加其在粘膜表面的停留时间。
讨论
这里描述的小动物阴道免疫模型为两个重要概念提供了原理证明：1）阴道应用PRO 2000，一种在人类阴道环境中耐受性良好的凝胶，可以作为B细胞佐剂，增加和维持局部和系统特异性抗体反应；2） PRO 2000是一种TLR4拮抗剂，可减少粘膜促炎反应，从而导致Th2免疫偏倚。潜在益处的进一步观察与gp140表位的选择性抗原掩蔽有关，这可能会增强生成更保守的抗体反应，并保护gp140免受蛋白水解降解，从而增加粘膜停留时间。
由于阴道粘膜被认为是诱导适应性免疫的一个困难部位，PRO 2000中的gp140可引起特异性粘膜和全身B、T细胞反应，这一发现令人鼓舞[32],[33]然而，最近的一项分析表明，当频繁使用高剂量抗原时，兔子阴道穹窿可能是一个免疫诱导部位[44]尽管我们的实验并不是专门设计来评估阴道免疫的粘膜免疫反应的持续时间，但我们仍然观察到，用PRO 2000中的抗原免疫的小鼠在最后一次增强后保持特异性IgA反应长达150天。尽管滴度相对较低，但这是有希望的，因为它表明可以诱导长寿的局部浆细胞逃避耐受性抑制机制。在兔子中，我们观察到在有或无PRO 2000的情况下诱导等效IgA反应，但在PRO 2000中接受gp140的动物中，阴道和全身IgG显著增加。这证实了PRO 2000在第二个物种中的免疫刺激活性，但表明抗体反应的类型是物种特异性的。特异性血清IgG和阴道IgG滴度相互关联，并与阴道灌洗样品的伪病毒中和能力相关，这一观察支持了阴道IgG主要来源于血清渗出液的观点[45],[46]这里证明的中和抗体滴度是针对异源分支C Env假型病毒的，证明了一定的活性范围。我们承认滴度很低，这种假病毒Env对中和异常敏感[47]，但这一结果应鼓励进一步发展这一免疫概念，使用新一代基于环境的抗原。在阴道粘膜诱导抗原特异性IgG和IgA的作用不大，但令人鼓舞的是，在使用gp140-PRO 2000增强抗体反应之前，先用实验佐剂鼻内注射。虽然我们观察到的粘膜抗原特异性抗体反应滴度相对较低，但可以通过增加抗原剂量、增加增强数量或添加异源佐剂引物来进一步优化，如此外，最近的一项研究表明，低于先前建议水平的中和抗体可能足以减少低剂量激发模型中的传播，并且抗体效应器功能可能发挥不同于中和或附加于中和的作用[48].
由于局部炎症的潜在风险导致对HIV-1感染的敏感性增加，PRO 2000驱动抗炎Th2偏倚环境的发现值得关注。促炎环境可能导致局部组织损伤，并可能导致HIV-1敏感靶细胞向粘膜募集[11]此外，CCL2可能增加HIV-1进入静止CD4+T细胞[41]并触发HIV-1敏感靶细胞的招募[42]因此，CCL2分泌减少可能会减轻HIV-1对阴道粘膜的感染体内我们假设PRO 2000可能通过抑制可能由细菌菌群诱导的局部Th1稳态，将免疫反应转向Th2型。事实上，我们发现PRO 2000竞争性地抑制了细菌LPS与其同源受体TLR4之间的相互作用，TLR4是Th1型免疫反应的有效诱导剂。有趣的是，PRO 2000最近被证明可以阻断LPS诱导的人类树突状细胞的细胞因子反应[49]支持我们的发现。这一结果与我们在PRO 2000免疫小鼠中发现的细胞因子谱一致，因为LPS刺激后会产生TNF-α和IL-1α。阴道LPS的可能来源是当地的细菌菌群。因此，患有细菌性阴道病（自然发生的细菌菌群失衡）的女性洗液显示TNF-α分泌和TLR4 mRNA表达增加[50]说明了这些菌群触发免疫反应的能力。
这些结果，加上PRO 2000在阴道环境中保持抗原完整性的能力，以及之前发表的证据，即阴道用PRO 2000进行临床试验是安全的，没有证据表明局部毒性和良好的阴道滞留[14],[15],[16]，为进一步探索PRO 2000作为局部疫苗制剂提供案例。尽管PRO 2000在第三阶段临床试验中未能阻止HIV-1性传播[51]，我们的数据支持进一步探索其作为一种粘膜疫苗形成剂的潜在用途，该疫苗形成剂能够促进抗原特异性免疫反应，同时抑制局部炎症。这种阴道疫苗的概念也可能为掺入下一代杀微生物剂（如抗逆转录病毒药物）提供理想的平台，这将结合频繁增强的粘膜抗体反应提供的潜在长期保护和使用杀微生物剂提供的短期保护。
方法
道德声明
所有动物研究均按照英国国家指南（《1986年动物（科学程序）法案》）进行，并得到英国内政部和牛津当地机构伦理审查委员会的授权（项目许可证编号30/2390）。
动物和免疫
使用6-12周龄雌性BALB/c小鼠进行小鼠免疫原性研究。用聚阳离子（Sigma-Aldrich，Gillingham，UK）辅助鼻内免疫。通过将载体凝胶中配制的20µl抗原和/或1%PRO 2000（Indevus，现为Endo Pharmaceuticals，Newark，DE）注入小鼠阴道进行阴道内免疫。在阴道免疫前三天，每只小鼠注射1.5 mg水溶性孕酮（Sigma-Aldrich），同步小鼠的发情周期。对于皮下免疫，将0.1 ml PBS和FCA（Sigma-Aldrich）中的1∶1抗原混合物注射到小鼠的侧面。随后在第3周进行无佐剂皮下强化免疫，并在第5周采集血清样本。阴道免疫后不到1周，使用无菌钝微移液管尖端，将2×50µl无菌PBS从阴道内外移液数次，收集阴道灌洗液样本。
在兔子实验中，选用8-10周龄的雌性新西兰白兔。所有兔子共接受了6次阴道内免疫，其中200µl 5%羟乙基纤维素（HEC）凝胶含有50µg gp140和/或1%PRO 2000。每组实验臂3只兔子在第0周接受500µg poly（I:C）和50µg gp140的鼻腔初次免疫54元人民币在100µl生理盐水中或仅在100¦Μl生理盐中加入500µg聚（I:C）。在实验的任何时间点，这些亚组之间的抗体滴度在统计学上没有差异，因此，假设滴鼻剂对兔子无效，并将结果汇总。阴道免疫后一周，使用无菌导管多次注射和抽出0.5ml无菌PBS，收集阴道灌洗样本。最佳gp14054元人民币在以前的实验中，抗原剂量是根据经验确定的，以区分有佐剂和无佐剂的粘膜免疫。
中和分析
在前面描述的改良伪病毒中和试验中评估了C支链MW965伪病毒的中和作用[54]免疫前和6次阴道内免疫后第12周收集的兔阴道灌洗液样品以1∶8的稀释度进行测试。使用免疫前样本观察到的平均感染水平作为100%感染水平，并相应计算第12周阴道灌洗样本的相对中和度。至少在两次独立分析中测定了两次中和作用。
人阴道灌洗液中gp140的稳定性
用无菌移液管收集HVL，在H中稀释1∶12通过离心法除去不溶性成分后，将其储存在−80°C。对于稳定性测定，0.5µg gp14054元人民币在37°C下，在有或无100µM PRO 2000的HVL中培养，并在−80°C下保存，直到分析。样品进行SDS-PAGE并通过Western blotting进行分析。
样品制备和ELISA
阴道灌洗液和血清样本通过4°C下20000×g的离心进行清除，并在−20°C下保存，直至分析。用ELISA测定抗原特异性和总抗体水平。用gp140包被高蛋白结合ELISA板54元人民币在PBS中，用2%脱脂奶粉在洗涤缓冲液中封闭（WB，0.05%吐温-20在PBS中）用于小鼠实验，2%BSA在WB中用于兔IgG，10%山羊血清在WB中用于兔IgA，并与一系列稀释的样品一起孵育。对于兔总IgG和IgA检测，平板涂有捕获抗体（分别为Serotec 403001和Abcam ab2758），并用WB中10%的山羊血清封闭。用适当的二级试剂检测结合抗体：抗鼠IgG-HRP（STAR120P，Serotec，Oxford，UK）；生物素偶联的抗鼠IgA（STAR85，Serotec）；抗鼠IgG1-HRP和IgG2a-HRP（BD Biosciences，Oxford，UK）；抗兔IgG HRP（Sigma-Aldrich）；与生物素结合的抗兔IgA（A120-109A，Bethyl，Montgomery，TX）；TMB基板（伊利诺伊州罗克福德赛默飞世尔科技公司）；在450 nm处读取OD值。
使用固定化gp140进行竞争ELISA54元人民币并使用HRP偶联的山羊抗人IgG Fcγ检测表位定义的人单克隆抗体的结合。CD4诱导位点特异性单克隆抗体与2µg/ml sCD4共同孵育。
通过从所有读数中减去平板背景值，并使用Prism软件（Graphpad，San Diego，CA）将每个样本的数据拟合为乙状剂量反应曲线，对ELISA数据进行分析。终点滴定度根据OD下样品的最大稀释度确定450信号大于阈值（0.01），始终大于背景以上的两个标准偏差。
腹股沟淋巴结细胞培养及细胞因子测定
在分离细胞前一周接受与之前相同配方的最终阴道免疫。分离来自这些小鼠阴道引流腹股沟淋巴结的细胞，并在有或无15µg/mL gp140的条件下培养三天。根据制造商的说明，通过Bio-Plex细胞因子分析（Bio-Rad，Hercules，CA）进行细胞因子分析。
TLR报告细胞分析
采用永生小鼠胚胎成纤维细胞（C3H/WT MEF，Invivogen，San Diego，CA）作为TLR报告细胞系。简单地说，细胞在第0天1×10时接种4每孔96周培养皿，隔夜培养。第1天，用含有适当浓度TLR-激动剂（Invivogen）和/或PRO 2000的培养基替换130µL培养基。第2天，去除20µL培养上清液，并通过比色底物反应（P5994，Sigma-Aldrich）定量磷酸酶含量。
表面等离子体共振（SPR）
通过耦合gp140在BIAcore 2000生物传感器（GE-Healthcare）上进行SPR分析国际投资银行和gp14054元人民币使用不同的HIV-1环境特异性单克隆抗体（50µg/mL）、sCD4（25µg/mL）或其组合分析gp140的抗原性。重组人TLR4-MD2复合物（R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州）固定在约8000 RU的CM5传感器芯片上。如前所述，将脂质a（Sigma-Aldrich）固定在HPA生物传感器芯片上[55]样品以20µL/min的流速注入2 min。
多重免疫分析法测定总Ig
按照制造商的说明，使用多重小鼠免疫球蛋白同种分型试剂盒（马萨诸塞州比勒里卡Millipore）测定小鼠阴道灌洗液的总IgG和IgA浓度。在Bio-Plex系统（Bio-Rad）上读取分析结果。以µg/ml为单位的总IgG和IgA浓度用于使粘膜IgG和IgA终点滴度正常化。
蓝色本地页面
蓝色本地PAGE基本上按照其他地方的描述执行[56]简单地说，蛋白质在50 mM Bis-Tris缓冲液（pH 7.0）中稀释，并在最终浓度为0.05%Triton x-100的情况下，在3-12%Bis-Tris凝胶（英维特罗根，佩斯利，英国）上分离。电泳后，凝胶被银染，以显示不太丰富的蛋白质组分。
统计分析
使用Kolmogorov-Smirnov正态性检验对终点滴度进行对数转换和分析。如果数据在每个比较组内显示正态分布，则未配对t吨-置信区间为95%的检验用于评估定义为第页<0.05. 如果数据不是正态分布的，则使用具有相同置信区间和显著性极限的Mann-Whitney检验进行分析。对于抗体滴度，结果以几何群平均值或对数转换表示，并以平均值±SEM表示；所有其他数据均以平均值±SD表示。
支持信息
图S1
免疫原的生化特性。(A类)HIV-1 gp140的抗原分析54元人民币使用表位定义的单克隆抗体和可溶性CD4与HIV-1 IIIB gp140进行比较。在基于表面等离子体共振的结合分析中，分析物的相对结合以响应单位（RU）-范围给出：-=0-150RU；+ = 151-500俄罗斯卢布；++ = 501-1500俄罗斯卢布；+++ = 1501 RU以上。显示了两个独立实验的平均值(B类)抗原的蓝色天然PAGE分析。gp140标准54元人民币表观天然分子量约为480 kDa。
（畅通节能法）
图S2
阴道灌洗液样本的总免疫球蛋白含量以及兔抗原特异性阴道和血清IgG的相关性。兔总IgA(A类)和IgG(B类)阴道灌洗液样本含量与皮尔逊相关性(C类)第11周的兔阴道和血清IgG反应.
（畅通节能法）
致谢
我们感谢Al-Profy和Indevus提供PRO 2000、雷根斯堡大学的Ralf Wagner和Hans Wolf，以及GENEART AG提供p97CN54质粒，感谢Tom Cole作为项目经理所做的贡献，感谢Kerrie Griffiths和Stacy Barclay提供的卓越技术援助。我们感谢萨巴·侯赛因在gp140克隆和表达方面所做的工作。我们衷心感谢多尔米尔投资服务有限公司的支持。
脚注
竞争利益：提交人声明不存在相互竞争的利益。
基金：这项工作的资金主要来自比尔和梅琳达·盖茨基金会（参考号37872）和威康信托基金（参考号077384）通过全球卫生重大挑战倡议向伦敦大学圣乔治分校提供的赠款。作者还感谢欧盟卓越网络“EUROPRISE”、国际艾滋病疫苗倡议（IAVI）中和抗体联盟、Dormeur基金会和杀菌剂开发计划（MDP）的支持。QJS是Jenner研究所的研究员，GK得到了Bodossaki基金会的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
工具书类
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