钙调素与HIV-1基质蛋白的结合触发肉豆蔻酸盐暴露^*

摘要

介绍

Gag是HIV-1编码的主要结构蛋白，包含驱动病毒组装所需的所有病毒元件(1,–三). 靶向质膜（PM）的HIV-1 Gag²是正确有效组装产生子代病毒的关键(1,三,–9). 在病毒成熟过程中，Gag被切割成肉豆蔻酰化基质（myr（+）MA）、衣壳和核衣壳蛋白，诱导病毒的主要形态重组(1,2,4,5,10). 在许多细胞类型中，HIV-1缝隙萌芽和组装主要发生在PM上(4,–9,11,–18). Gag与PM的结合由MA结构域介导，并通过多重聚合增强。Gag与PM的正确组装和有效结合需要一个肉豆蔻酰（myr）基团作为膜锚和一簇位于N末端结构域的碱性残基，以促进与酸性磷脂的相互作用(1,2,19,20).

在确定HIV-1组装和释放的病毒和细胞决定因素方面取得了稳步进展(6). 然而，Gag用于到达受感染细胞中装配点的贩运途径尚不清楚。Freed、Ono和同事的研究(21,–23)证明HIV-1 Gag在病毒组装位点的最终定位依赖于磷脂酰肌醇-（4,5）-二磷酸（PI（4,5P）₂)，一种定位于PM内叶的细胞因子(24,–26). 我们的结构研究表明PI（4,5）P₂直接与HIV-1 MA结合，诱导构象变化，触发myr暴露(27). 除PI（4,5）P外₂越来越多的证据表明，HIV-1 Gag在病毒复制周期中与多种细胞蛋白相互作用，并且这些相互作用是由MA结构域介导的。这些因素包括钙调素（CaM）(28)，人类衔接蛋白-3复合物（AP-3）(11)，尾相关蛋白（TIP47）(29)和细胞因子信号转导抑制因子1（SOCS1）(30,31). 然而，Gag和任何这些细胞蛋白之间直接相互作用的证据要么不存在，要么非常有限。

CaM是一种普遍存在且高度保守的钙结合蛋白，在所有真核细胞中表达，与多种细胞功能有关(32,–37). 它可以定位于各种亚细胞位置，包括细胞质、细胞器内或与血浆或细胞器膜相关(32,–37). CaM及其与细胞蛋白的相互作用已被广泛研究(32,38,–40). 结构上，钙离子的结合（Ca²⁺)到CaM触发构象变化，使其能够结合到特定蛋白质以产生特定反应(33,36,37). CaM已被证明能与100多种不同的靶蛋白特异相互作用并激活它们(32,41,42).

钙的结合已被证实²⁺到CaM引发N端和C端叶的螺旋重排，导致每个结构域表面的大的结合囊打开，这些结构域由疏水残基组成，这些疏水残基基本上埋藏在载脂蛋白（Ca²⁺-免费）(33,36,37). 因此，当Ca²⁺绑定，允许蜂窝目标对接。CaM蛋白呈高度酸性，被描述为具有“哑铃状”结构，其N端和C端叶由称为中心连接器的柔性螺旋连接。N端和C端叶各有两个螺旋-环-螺旋基序，称为“EF手”(43).

一些研究小组提出了CaM在HIV复制周期中的潜在作用。以下各项的组合体内和在体外研究表明，除Gag外，CaM还与HIV-1 Nef和包膜糖蛋白（Env）相互作用(44,–47). Gag和CaM之间的相互作用是Ca²⁺-从属的(28). Gag和CaM也被发现以扩散模式共存于细胞质中。最近的研究表明，myr（−）MA和来自MA蛋白的短肽直接与CaM相互作用(48,49). 然而，已经证实，一些肉豆蔻酰化蛋白，如肉豆蔻酰化丙氨酸丰富C激酶底物（MARCKS）、脑特异性蛋白激酶C底物（CAP-23/NAP-22）和HIV-1 Nef通过myr基团与CaM相互作用，以促进其胞内定位和膜靶向(44,45,50,51). 因此，我们试图确定MA的myr基团对CaM结合是否重要，和/或CaM与MA的结合是否改变了myr开关机制在体外肉豆蔻酰化蛋白的膜结合和解离通常受细胞内钙的调节²⁺通过“Ca”发出信号²⁺-myr开关。”一些示例包括Ca²⁺传感器蛋白恢复素(52)，神经钙素(53)和S-模蛋白(54)通过钙改变细胞内从胞浆到膜的定位²⁺绑定(55). 在本报告中，我们提供了myr（+）MA和CaM之间相互作用的结构、生物化学和生物物理数据。我们的数据显示，CaM以钙依赖的方式和1:1的化学计量比直接与myr（+）MA结合。我们还证明，CaM与myr（+）MA结合会导致myr基团的挤出，这可能表明在HIV复制后期Gag的贩运和/或靶向中发挥了潜在作用。

实验程序

结果

体内和在体外研究表明，Gag与CaM的相互作用由MA结构域介导，并依赖于钙(28). 最近的研究表明，myr（−）MA和源自MA蛋白的短肽直接与CaM相互作用(48,49). 然而，由于尚不清楚CaM如何与天然myr（+）MA蛋白相互作用，以及结合是否影响myr开关机制在体外，我们对CaM和myr（+）MA之间的相互作用进行了结构、生物化学和生物物理研究。

凝胶流动性测定

在有或无钙的情况下，用尺寸排除色谱法初步分析了未结合CaM、MA及其复合物的溶液性质。在相同的实验条件下，在凝胶过滤柱（Superdex 75和Sephacryl S-200 HR）上分别运行三个样品。如所示图1(顶部面板)未结合CaM和myr（+）MA的洗脱体积分别为66和77 ml。用1:1化学计量比制备的myr（+）MA·CaM络合物样品在57 ml洗脱。络合物的色谱图显示在77 ml处有一个额外的小峰，表明myr（+MA）略有过量。用已知蛋白质标准进行凝胶过滤流动性测定(图1,底部面板)结果表明，尽管这两种蛋白质具有相似的分子量（～17 kDa），但CaM的表观分子量与MA相比显著较高（27 kDa。CaM的迁移行为归因于其拉长的哑铃形(72). myr（+）MA·CaM复合体以～45–50-kDa物种迁移，显著高于1:1复合体(图1B类和补充图S1).

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图1。

凝胶过滤色谱法表征MA·CaM复合物。 顶部，在钙存在下色谱分离myr（+）MA、CaM和myr（＋）MA·CaM。底部凝胶过滤校准分析显示CaM、MA和CaM·MA复合物的流动性。

为了确定myr（+）MA是否能够与载脂蛋白CaM结合，在没有Ca的情况下制备myr（＋）MA·CaM复合物²⁺分别在67和74 ml洗脱CaM和myr（+）MA的两个独立峰(补充图S2). 在～57 ml时未观察到峰，表明复合物的形成。载脂蛋白CaM的洗脱体积与存在Ca时观察到的洗脱容量非常相似²⁺表明迁移行为为Ca²⁺-独立。与早期研究一致，我们的结果表明CaM与myr（+）MA的相互作用是Ca⁺²-依赖。

myr（+）MA·CaM相互作用的沉降研究

尽管上述结果提供了关于myr（+）MA和CaM蛋白及其复合物的迁移率的见解，但低聚和平衡性质以及化学计量尚未确定。为此，我们对以100–250μ米用于myr（+）MA、CaM及其复合体。用于这些实验的myr（+）MA·CaM样品首先经过凝胶过滤色谱柱，以确保样品的均匀性。如所示图2，myr（+）MA、CaM和myr（+）MA·CaM复合体的沉积速度剖面显示出单一的沉积边界。使用SEDFIT分析数据(67,–70)myr（+）MA、CaM和myr（＋）MA·CaM的峰值分别为～1.5、1.7和2.9 S。使用分子质量分布对沉降速度数据进行的进一步分析表明，myr（+）MA和CaM的近似分子质量分别为16和17 kDa，而myr（＋）MA·CaM络合物的表观分子质量计算为～35 kDa。myr（+）MA在当前缓冲条件（pH 7.2）下的单体特征与我们最近的研究一致，这表明MA的齐聚反应依赖于pH(73). 总的来说，沉积速度结果表明形成了1:1 myr（+）MA·CaM复合物。

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图2。

沉降系数分布(C类(秒))从CaM、myr（+）MA和myr（+）MA·CaM复合物的沉积剖面中获得。

ITC表征CaM与myr（+）MA的结合

如上所述，钙对细胞活性至关重要²⁺-与靶蛋白结合的结合CaM是定位在N端和C端叶上的两个疏水批次(36). 额外的静电相互作用也能稳定CaM-蛋白质相互作用(44,45,50,51). 然而，疏水性的重要性和相对贡献与myr（+）MA·CaM相互作用中的静电因素尚不清楚，特别是疏水性myr基团可能在其他CaM-蛋白质相互作用中发挥作用(44,45,50,51). ITC用于确定CaM与myr（+）MA结合的亲和力和热力学参数。ITC测量结合时吸收或产生的热量，并提供离解常数的值(K_d日)，化学计量(n个)和焓变化（Δ小时°). 这个K_d日然后使用该值计算吉布斯能量的变化（Δ克°），与Δ一起小时°允许计算熵项T型ΔS公司°. 结合自由能分离为熵和焓分量，揭示了驱动结合反应的力的性质。

如所示图3，ITC数据的单点拟合得出以下热力学参数：n个= 1.08,K_d日= 1.9 ± 0.1 μ米, Δ小时°=11.3±0.1 kcal/mol和ΔS公司°=62.6 cal/mol/deg。如焓热符号所示，CaM与myr（+）MA的结合是强吸热的，这证实了相互作用的熵驱动性质。然而，我们并不排除存在静电相互作用来进一步稳定结合。特别值得注意的是，CaM与myr（−）MA的结合表现出盐依赖性，表明静电相互作用的作用(48). 为了研究盐对myr（+）MA·CaM相互作用的影响，在0–500 m盐浓度下进行了色氨酸荧光光谱实验米MA蛋白在16和36位含有两个Trp残基，而CaM缺乏任何Trp残基团。在结合CaM时，Trp发射光谱的强度发生变化。我们的数据表明，当盐浓度从0增加到500 m时，结合亲和力仅降低约6倍米(补充表S1和图S3)表明myr（+）MA·CaM结合中的静电因素无关紧要。

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图3。

上部面板，滴定CaM（402μ米)转化为myr（+）MA（20μ米). 数据最适合单站点绑定模式，并提供了K_d日1.9μ米(下部面板).

CaM结合不需要MA的肉豆蔻酸酯基团

一些肉豆蔻酰化蛋白，包括MARCKS、CAP-23/NAP-22和HIV-1 Nef被发现与CaM结合，以促进其细胞内定位和膜靶向(44,45,50,51). 我们上面描述的ITC数据表明，CaM与myr（+）MA的结合是由熵驱动的，这表明疏水接触的主要贡献。为了检测myr基团是否参与CaM结合，对用CaM滴定的myr（−）MA蛋白进行了ITC实验(补充图S4). 有趣的是，热力学参数(K_d日= 2.1 ± 0.2 μ米, Δ小时°=12.90±0.02 kcal/mol，以及ΔS公司°=67.5 cal/mol/deg）与myr（+）MA·CaM络合物所得结果几乎相同。综上所述，这些结果表明myr基团不参与CaM结合。

核磁共振检测到CaM与myr（+）MA的结合

核磁共振方法已用于确定CaM如何与myr（+）MA相互作用，并确定这两种蛋白质的相互作用区域。化学位移扰动不仅提供了对相互作用区域的见解，还可以用于识别远离结合位点的变构构象变化。所有核磁共振研究都是在钙存在的情况下进行的。我们首先对myr（+）MA作为添加CaM的函数进行了核磁共振结合研究。二维¹H（H）-¹⁵N均匀采集的HSQC光谱¹⁵100μm时N标记的myr（+）MA米主要表示myr隔离构象(57,73). 添加亚化学计量量的未标记CaM导致显著的化学位移变化和信号展宽/丢失(图4). 有趣的是，在0.25:1 myr（+）MA:CaM时¹H（H）-¹⁵对应于N末端结构域（Gly-2到Arg-20）残基的N信号变得广泛而无法检测，而Leu-21到Glu-45残基要么消失，要么强度显著下降(图4). 这些结果表明MA的N端区域受到CaM结合的扰动。大多数¹H（H）-¹⁵HSQC光谱中的N信号明显是添加CaM的函数。在1:1 myr（+）MA:CaM时¹H（H）-¹⁵N个信号严重变宽，但出现了许多新的信号(图4).

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图4。

顶部面板，二维叠加¹H（H）-¹⁵获得的N个均匀HSQC光谱¹⁵用未标记的CaM滴定时标记为N的myr（+）MA。黑色，myr（+）MA·CaM比值为0:1；蓝色，myr（+）MA·CaM比值为0.25:1；红色，myr（+）MA·CaM比值为1:1。底部面板，已选择¹小时-¹⁵N HSQC信号来自顶部面板结果表明，在0.25:1的化学计量比下，当CaM结合时，MA的N端域中的信号强度显著损失。

信号严重展宽或丢失可由以下一个或多个事件解释。首先，CaM的结合引起了巨大的构象变化，导致MA的三级和/或二级结构发生改变。Chow最近提出了这种可能性等。(48)研究了CaM和myr（−）MA的相互作用。第二，在1:1的化学计量比下，自由形式和束缚形式在NMR尺度上的缓慢交换。由于进一步添加CaM（高达3:1 CaM:MA）未检测到光谱变化，因此排除了这种情况。第三，信号线宽的增加是由于myr（+）MA·CaM复合物分子尺寸的增加。这种可能性已经通过收集二维数据进行了测试¹H（H）-¹⁵N横向弛豫优化光谱数据¹⁵N标记的myr（+）MA与CaM络合（数据未显示）。虽然有一些¹H（H）-¹⁵N信号更清晰，横向弛豫优化光谱和HSQC光谱基本相似。第四，结合动力学在核磁共振时间尺度上处于中间交换状态。为了确定是否是这种情况，我们收集了一组二维HSQC数据¹⁵N标记的myr（+）MA与CaM络合，作为温度的函数（15–35°C；补充图S5). 改变温度并没有导致信号强度的任何重大改善。然而，在25°C下收集的光谱中，在10–11 ppm下出现了两个新信号(¹H） ●●●●。这两个信号可能对应于侧链Trp-16和Trp-36，从其原始位置大幅偏移，表明这些残基可能参与CaM结合或在CaM结合时发生构象变化。

CaM与myr（+）MA结合触发myr暴露

以前的研究表明¹H（H）-¹⁵对应于残基Gly-2到Arg-20的N共振通常对myr基团的定位敏感(27,57). 发现在亚化学计量添加CaM时，这些信号完全消失(图4)可能表明myr开关机制发生了扰动。为了检验这个假设，我们设计了三种方法。首先，我们收集了myr（−）MA的二维HSQC光谱，作为添加CaM的函数。有趣的是¹H（H）-¹⁵残基Gly-2到Arg-20的N信号在亚化学计量CaM处未表现出明显的强度损失或展宽(补充图S6). 然而，当以等摩尔比与CaM络合时，观察到myr（+）MA的HSQC光谱变得非常宽，并且出现了几个新的峰。因此，myr（+）MA的HSQC光谱中残基Gly-2到Arg-20的信号丢失(图4)表明两种构象之间在核磁共振尺度上的缓慢交换，很可能是myr隔离和暴露状态。

在第二种方法中，我们收集了二维数据¹H（H）-¹³C myr（+）MA的HMQC数据，包含¹³C-标记myr组。预计光谱中只会出现myr基团的亚甲基和甲基共振。如所示图5，的¹H（H）-¹³游离myr（+）MA蛋白中myr基团的C信号(黑色)与之前报告的myr隔离表相同(57)与观察到的游离肉豆蔻酸非常不同(绿色) (74). 有趣的是，对于1:1化学计量比的myr（+）MA·CaM络合物¹H（H）-¹³myr组的C信号(红色)向自由配体的值偏移，表明在CaM结合时myr基团被挤出。在亚化学计量量的CaM（0.25:1 myr（+）MA:CaM）下，HMQC光谱(补充图S7)显示了两组独立的¹H（H）-¹³C表示自由形式和束缚形式，证实了由CaM结合引起的myr隔离形式和暴露形式之间的缓慢交换。

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图5。

二维叠加¹H（H）-¹³C获得的myr（+）MA HMQC光谱中含有¹³C标记的未结合myr组(黑色)和CaM-bound(红色)状态。为了进行比较，显示了游离肉豆蔻酸的光谱(绿色). 一个星号表示突破¹H（H）-¹³来自CaM的C信号。

在第三种方法中，为了确认CaM的结合触发myr暴露¹³C编辑和¹³C编辑/¹²获得了含有¹³自由态或CaM-束缚态的C-标记myr基团。先前的研究表明，myr基团占据一个疏水空腔，并与许多疏水和芳香残基接触，包括Val-7、Leu-8、Leu-16、Ile-34、Leu-51和Ile-85(27,57,58,73). 对于游离myr（+）MA，在这些残基的侧链与myr基团的亚甲基（H5–H11）和末端甲基（H14）信号之间观察到几个NOE交叉峰，证实了myr基群的隔离(补充图S8). 然而，在myr基团和CaM-结合光谱中的任何这些残基之间均未观察到NOE交叉峰。这些结果通过三维成像得到了证实¹³C编辑的HMQC-NOESY光谱(补充图S8)，证明CaM与myr（+）MA的结合导致myr基团的挤出(补充图S8). 此外，在myr基团和CaM之间未观察到新的NOE交叉峰，这表明myr基群不与CaM相互作用，而是暴露于溶剂中。

CaM与MA结合的核磁共振研究

上述所有核磁共振数据均为¹⁵N-或¹³用未标记的CaM滴定C-标记的MA蛋白。为了绘制CaM蛋白上作为MA结合功能的相互作用区域，对¹⁵N-或¹³C标记的CaM样品作为添加MA的函数。

完成的作业¹H、，¹⁵N、 和¹³通过使用二维、三维和四维核磁共振方法的组合实现了CaM的C信号（详见“实验程序”）。代表¹H（H）-¹⁵获得的N个HSQC光谱¹⁵未结合形式的N标记CaM和与myr（+）MA的络合物如所示图6A类。在1.4:1 MA:CaM时，大多数信号显示出显著的化学位移变化。进一步添加myr（+）MA后，未观察到光谱变化。有趣的是，显示出显著化学位移变化的残基并未定位在CaM蛋白的明确区域，而是分布在N端和C端叶以及中央螺旋。CaM蛋白质的表面表示（蛋白质数据库代码3CLN公司)如所示图6B类突出显示了myr（+）MA结合后出现化学位移变化的残基。显示了实质性化学位移变化（Δδ_海南((Δδ¹_小时)²+（Δδ¹⁵_N个)²)½）>0.1 ppm）红色，而那些变化不大的则是彩色的橙色(Δδ_海南<0.1）。绝大多数酰胺信号的扰动可能表明与MA结合时，CaM中存在广泛的相互作用界面或诱导显著的构象变化。

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图6。

A类，二维叠加¹H（H）-¹⁵获得的N个HSQC光谱¹⁵处于未结合状态的N标记CaM(黑色)与未标记的myr（+）MA在1。4:1（马萨诸塞州：加利福尼亚州）(红色).B类，蛋白质数据库代码的CaM结构的表面表示3CLN公司). 显示出显著化学位移变化（>0.1 ppm）或信号损失的残留物被着色为红色，而那些适度扰动的（<0.1 ppm）被着色为橙色钙离子在绿色.

由于部分分配（～70%）¹H（H）-¹⁵Chow CaM HSQC谱中的N个信号等。(48)最近提出，CaM与myr（−）MA结合后仅发生轻微的结构变化。为了评估myr基团是否对HSQC谱中观察到的显著变化负责，如图6，还收集了二维HSQC数据¹⁵用myr（−）MA滴定的N标记CaM(补充图S9). CaM与myr（−）MA结合后，HSQC光谱中的光谱变化几乎与与myr（+）MA结合时在相应光谱中观察到的光谱变化相同(图6)这表明实质性的化学位移变化不是由myr基团引起的，而是由蛋白质接触引起的。

CaM中的疏水区对MA结合很重要

有助于CaM灵活性的一个显著特征是N端和C端叶上存在两个疏水表面。这些区域仅在钙结合时形成²⁺(37). 这些疏水批次形成的核心是八个Met残基的暴露，这些残基对这两个区域的溶剂可及表面积贡献了约46%(75,76). 蛋氨酸残基被认为是CaM与靶蛋白独特的混杂结合行为的关键(76). 这种新颖的结构特征使甲基甲基苯丙胺成为优秀的“NMR报告者”。靶蛋白或CaM拮抗剂的相互作用通常会导致细胞内的显著扰动¹H（H）-¹³C Met侧链的化学位移(77). 为了评估这两个疏水批次是否参与MA的结合，我们收集了二维数据¹H（H）-¹³C统一上的HMQC数据¹³用myr（+）MA滴定的C-标记CaM样品。选定区域显示¹H（H）-¹³蛋氨酸甲基（Cϵ）的C信号如所示图7在该光谱中¹H（H）-¹³观察到所有九个蛋氨酸残基的C信号。这个¹H（H）-¹³在滴定myr（+）MA时，Met-51、Met-71、Met.72、Met-144和Met-145的C信号表现出显著的化学位移变化，而对应于Met-36、Met-76、Met-109和Met-124的C信号则不太明显。位于36、51、71和72位的蛋氨酸残基位于N端疏水批次中，而位于109、124、144和145位的蛋黄嘌呤残基位于C端叶的疏水斑块中(图7). 我们的二维HMQC数据表明，CaM的N端和C端叶都可能参与myr（+）MA结合，因为这两个基序的蛋氨酸基团都表现出显著的化学位移变化。在用myr（−）MA蛋白滴定CaM时，也对其进行了类似的二维HMQC实验（数据未显示）。观察到的化学位移变化¹小时-¹³Met残留物的C信号与图7.在¹H（H）-¹³当myr基团存在时，C发出信号，确认myr基群不参与CaM结合。

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图7。

A类，二维叠加¹H（H）-¹³C HMQC光谱¹³C标记的CaM是添加的未标记myr（+）MA的函数。黑色，myr（+）MA·CaM比值为0:1；蓝色，myr（+）MA·CaM比值为0.25:1；洋红，myr（+）MA·CaM比值为0.5:1；绿色，myr（+）MA·CaM比值为1:1。B类，CaM结构的表面表示（蛋白质数据库代码3CLN公司)显示了N端和C端叶上的九个Met残基(红色). 钙离子在绿色.

讨论

CaM是一种普遍存在于所有真核细胞中的蛋白质，与多种细胞功能有关(32,–37). 它可以定位于各种亚细胞位置，包括细胞质、细胞器内或与血浆或细胞器膜相关(32,–37). 早期的研究试图确定CaM在病毒复制和感染性中的特定作用。研究表明，CaM通过与病毒基质蛋白VP40的相互作用，在埃博拉病毒样颗粒的出芽过程中发挥作用(78). 其他人提出CaM在HIV和猿猴免疫缺陷病毒复制周期中的潜在作用(28,44,–47,79). 以下各项的组合体内和在体外研究表明，CaM与HIV-1 Gag、Nef和Env蛋白相互作用(28,44,–47). 研究还表明，HIV感染的细胞表达的CaM水平升高(80). HIV-1 Gag与CaM共同定位，呈弥漫型分布于细胞质中(28). 这些发现可能表明CaM细胞信号通路与HIV复制和感染性之间存在联系。

Gag和CaM之间的相互作用由myr（+）MA蛋白介导，是Ca²⁺-从属的(28). 尽管最近的研究为CaM和myr（−）MA之间的直接相互作用提供了证据(48)或来自MA蛋白的短肽(49)CaM与myr（+）MA结合的分子机制以及随后对myr开关机制的影响尚不清楚。在本报告中，我们确定：（i）CaM在Ca中以1:1的化学计量比与myr（+）MA结合²⁺-依赖方式，（ii）CaM与myr（+）MA的结合诱导了触发myr暴露的结构变化，（iii）myr基团不参与CaM结合，（iv）CaM-MA相互作用是疏水和熵驱动的，而静电相互作用似乎无关紧要。

已知包括MARCKS、CAP-23/NAP-22和HIV-1 Nef在内的几种肉豆蔻酰化蛋白结合CaM以促进其细胞内定位和膜靶向(44,45,50,51). CaM与这些蛋白质或从内衍生的短肽复合的结构、生物化学和生物物理特征表明，myr基团参与CaM结合，表明myr基群不仅对膜靶向重要，而且对介导蛋白质-蛋白质相互作用也很重要。肉豆蔻酰化蛋白的膜结合和解离通常受细胞内钙的调节²⁺通过Ca发出信号²⁺-myr开关(52,–54)通过钙改变细胞内从胞浆到膜的定位²⁺绑定(55). 然而，钙的细胞内靶向性²⁺MARCKS、CAP-23/NAP-22和Nef等无感觉蛋白受CaM结合调节。虽然MA蛋白属于钙²⁺无意义蛋白质，myr基团未被CaM“捕获”的发现可能表明CaM在Gag向PM运输和/或靶向组装中具有新的功能作用。

CaM-结合蛋白通常包含一个区域，其特征是由～20个残基组成的基本双亲螺旋。在许多经典的CaM-结合靶中，疏水残基通常占据1-5-10或1-8-14的保守位置，指向螺旋的一个面(34). 其他碱性残基通过与CaM酸性残基的静电相互作用稳定络合物。虽然这些模式通常在许多CaM-结合蛋白中发现，但也发现了许多未分类的例子(34). Ikura实验室（安大略癌症研究所）开发了一种基于网络的工具，用于识别具有潜在CaM-结合位点的序列(41). 在对蛋白质序列进行分析后，根据几个标准（包括亲水性、α螺旋倾向、残渣重量、残渣电荷、疏水残渣含量、螺旋类别和特定残渣的出现），它给出了从0到9的分数。给定序列中最可能的结合位点用重复的9表示。该方法已用于分析MA蛋白序列，并在Lys-32到Glu-40残基方面获得最高分数。这些残留物构成螺旋II的大部分。有趣的是，该区域包含几个疏水残基（Ile-34、Val-35、Trp-36和Ala-38），它们与CaM-结合位点的任何已知模式都不匹配。虽然使用基于网络的数据库工具进行序列分析没有发现螺旋I内的潜在结合位点（得分0），但溶液x射线散射数据(49)MA短肽的荧光研究(28)发现MA的螺旋I和II（残基11–47）对CaM结合都很重要。虽然合成肽跨越区域Gly-11至Gln-28（螺旋I和β-发夹）以2:1的化学计量比结合CaM，但Gly-26至Asn-47（螺旋II）和Gly-11到Asn-47。综上所述，我们的结果与之前的研究结果相结合，可能提出了一种新的CaM-结合模式，该模式需要MA螺旋I和II的疏水残基参与。

在准备这份手稿的过程中，周等。(48)报道了他们对CaM与全长myr（−）MA相互作用的研究结果。在这项研究中，有人建议CaM破坏MA结构以与螺旋I和II相互作用。根据CD数据，推测MA蛋白与CaM结合后螺旋特征损失20%。我们目前的数据与之前的研究相结合(28,48,49)表明MA中的CaM结合位点位于残基11–45内。虽然尚不清楚哪些特定残基对结合至关重要，但数据表明螺旋I和/或II中的几个疏水残基可能与CaM相互作用。MA的N末端区域（残基2-47）对各种MA功能至关重要。这些功能中包括其在介导Gag-膜相互作用和调节myr开关机制中的作用(4,5,22,23,27,57,58,73,81,82). MA的螺旋I与Gag与包括AP-3复合物在内的几种细胞成分的结合有关(11)和TIP47(29). 据报道，螺旋I中的几个残基（Leu-8、Ser-9、Leu-13、Trp-16、Glu-17和Lys-18）对Env掺入至关重要(83,–85)由此提出MA蛋白通过螺旋I与Env蛋白直接相互作用(83,86). 事实上，我们在这里提供的核磁共振数据表明，螺旋I可能会因CaM结合而发生结构变化或位置调整，这反过来导致myr基团的挤出。

结构研究表明，myr暴露增加了几个因素，包括PI（4,5）P₂结合、pH值、蛋白质浓度增加和衣壳结构域包含(27,57,73). 平衡数据表明，尽管myr（+）MA处于单体-三元平衡，但myr（−）MA蛋白在所有条件下都保持溶液中的单体特征(57). 此外，myr组的暴露与蛋白质三聚反应有关(57). 尽管有证据表明MA可以形成三聚体并作为六聚体在膜上组装(87,88)，MA齐聚在稳定Gag-Gag相互作用中的作用仍有争议(57,88,–93). 我们在此提供的数据表明，myr基团与CaM结合后的暴露不会诱导MA三聚体的形成。CaM与Gag或类Gag结构体（包含衣壳结构域）的结合是否会增强齐聚反应，尚待确定。

诱导胞浆Ca瞬时升高²⁺研究表明，多泡体中HIV-1 Gag、Gag组装中间体和病毒样颗粒的数量增加，导致病毒样颗粒释放量急剧增加(94). 有人建议Ca²⁺-液泡/多泡体样腔室的介导融合促进了病毒样颗粒的产生。然而，目前尚不清楚是否操纵细胞质钙²⁺该级别在稳定Gag-CaM相互作用和促进Gag贩运和组装方面发挥了作用。总之，尽管目前已确定CaM直接与MA蛋白结合，导致myr基团被挤出，但CaM在HIV复制周期中的确切功能作用仍有待检验，并需要进一步研究。

补充材料

致谢

参考文献