大脑特异性普格德邦删除显示了的关键作用我-丝氨酸生物合成在控制d日-丝氨酸N个-甲基-d日-成人脑中的天冬氨酸受体辅基因^*

氨基酸分析

如前所述，测定Floxed和CKO小鼠（雄性，10周龄）的血清、大脑皮层、海马、胰腺、肾脏、肝脏和肌肉中的甘氨酸和其他氨基酸的含量(42,43). 简单地说，对组织进行称重，然后在5体积水中单独均质，并在20000×克在4°C下保持30分钟。如前所述，通过添加5%的高氯酸去除上清液中的蛋白质(40)，并使用氨基酸分析仪（L-8500；Hitachi）测定上清液的氨基酸组成。

如前所述，使用二维HPLC系统测定丝氨酸对映体(44)稍作修改。简言之，10周龄小鼠大脑皮层、海马和血清中的氨基酸如上所述去蛋白，并用荧光标记试剂4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并二唑衍生。将反应混合物置于带有微十八烷基硅烷柱和对映选择性柱的组合HPLC系统中。微十八烷基硅烷柱分离7-硝基-2,1,3-苯并二唑-Ser馏分，并用对映选择性柱分离和测定对映体。衍生氨基酸的荧光检测在530nm处，激发在470nm处。

一些普格德邦^{flox/flox公司}和hGFAP公司^+/Cre公司::普格德邦^{flox/flox公司}给小鼠（雌性，8个月大）我-丝氨酸（150米米在盐水中；5毫摩尔/千克；105–131μmol/小鼠）。作为对照，单独腹膜内注射生理盐水。注射后3小时，小鼠被斩首，因为放射性标记我-丝氨酸在体内迅速降解，但在腹腔注射后2-4h，在成年小鼠大脑中可以检测到丝氨酸(29).

免疫印迹分析

从Floxed和CKO小鼠（雄性，7-11周龄）的成年大脑中解剖大脑皮层和海马，然后在含有10 m米三氯化氢（pH 8.0），8米尿素、4%CHAPS、蛋白酶抑制剂混合物（Nacalai Tesque）和磷酸酶抑制剂混合物（Nacalai-Tesque）。在20000×克持续10分钟，以获得总蛋白提取物，并使用蛋白测定比钦酸盐试剂盒（Nacalai-Tesque）测定浓度。蛋白质样品通过10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，并在PVDF膜（Bio-Rad）上进行电印迹。用以下主要抗体探测印迹蛋白：抗Phgdh（兔，0.3μg/ml）(36)，抗丝氨酸消旋酶（克隆29，小鼠单克隆，BD Biosciences，1:1000），抗NMDA受体亚单位NR1（也称为GluRζ1；兔子，称为GluR-ζ1C2抗体，1:1000(45)，抗NR2B（也称为GluRϵ2；兔，称为GluR-2N抗体，1:1000）(46)、抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）（兔子，Polysciences，Inc.，1:45000）、抗SNAP 25（克隆BR05，小鼠单克隆，Wako Pure Chemical Industries，1:500）、抗胶质纤维酸性蛋白（Gfap）（兔，DAKO，1:500。与与辣根过氧化物酶结合的适当二级抗体孵育后，用化学发光检测系统（SuperSignal®West Pico，Pierce）观察结合抗体（细胞信号技术）。

组织学分析

用乙醚麻醉Floxed和CKO小鼠（雄性，7-8周龄），并用4%多聚甲醛经心灌注0.1米磷酸钠缓冲液（pH 7.2）。取下大脑并在同一固定液中固定过夜，然后在磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4，磷酸盐缓冲盐水）中清洗。为了进行苏木精和伊红染色，将大脑埋入石蜡中，并使用切片机在5μm处进行切片。

Arc mRNA表达的定量分析

野生型（雄性，12周龄）、Floxed（雌性，12-18周龄）和CKO（雌性，12-18周龄）小鼠经腹腔注射惊厥剂量的NMDA（Sigma，75 mg/kg体重，0.9%盐水）(47)或盐水。本实验中使用的Floxed和CKO小鼠是同窝小鼠。注射后3小时将小鼠麻醉，然后通过断头处死，然后从颅骨中快速切除大脑来实施安乐死。根据制造商的说明，将每个海马体从冰上的大脑中快速分离出来，浸入RNAlater试剂（Ambion）中，然后储存在−80°C下直到使用。使用RiboPure试剂盒（Ambion）制备海马总RNA。总RNA样品的质量通过1%变性琼脂糖凝胶电泳进行评估A类₂₆₀/A类₂₈₀>1.8的值用于后续实验。用TURBO DNA去除RNA样品中的污染DNA后-自由的^TM（TM）（Ambion），使用1μg DNA酶处理的RNA通过使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）逆转录生成cDNA。根据制造商的建议，使用7500型实时PCR系统（Applied Biosystems）在含有SYBR Premix Ex Taq（Takara Bio）和参考染料ROX的20μl反应中进行定量实时PCR。使用的引物序列为：弧正向，5′-GCCAGTCTTGGGCAGCATAG-3′；弧背面为5′-ATGGCTGAGTCACGGAGCTG-3′。所有反应均一式三份。使用靶基因表达的周期阈值进行数据分析，该阈值通过Gapdh公司作为内部控制。我们的DNA微阵列分析表明Gapdh公司在Floxed和CKO大脑的成年海马体中没有差异表达。⁴

功能性Phgdh调节我-和d日-大脑中的丝氨酸水平

我们定量了CKO和Floxed小鼠的血清、大脑皮层和海马中的丝氨酸对映体和其他氨基酸。血清我-两种基因型之间的丝氨酸浓度没有显著差异(图3A类; 学生的吨测试，第页=0.147），而血清d日-CKO小鼠的丝氨酸浓度趋于降低(图3B类; 学生的吨测试，第页= 0.071). CKO血清中甘氨酸浓度略有增加(图3C类; 学生的吨测试，第页=0.071）与Floxed小鼠相比。Floxed和CKO小鼠的其他氨基酸血清浓度没有差异。此外，野生型和Floxed小鼠之间的血清游离氨基酸浓度没有显著差异，但异亮氨酸除外，后者在Floxed鼠中显著升高（66.9±3.0μ米)与野生型相比（54.2±2.9μ米)（学生的吨测试，第页< 0.05). CKO和Floxed小鼠在肝脏、胰腺和肾脏中的游离丝氨酸水平没有差异（数据未显示），其中普格德邦据报道，mRNA水平较高(48,–50).

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图3。

我-和d日-CKO血清和大脑中的丝氨酸水平。 A类，血清我-显示了Floxed和CKO小鼠的丝氨酸浓度。B类，血清d日-显示了Floxed和CKO小鼠的丝氨酸浓度。C类显示Floxed和CKO小鼠的血清甘氨酸浓度。D类,我- (L（左）)以及d日-丝氨酸(D类)显示了Floxed和CKO小鼠大脑皮层中的水平。E类显示了Floxed和CKO小鼠大脑皮层中的甘氨酸含量。F类,我-和d日-显示了Floxed和CKO小鼠海马中的丝氨酸水平。克显示了Floxed和CKO小鼠海马中的甘氨酸含量。数据表示平均值±S.E.（Floxed：n个=7，CKO：n个= 6). 通过Student’s分析基因型之间的差异吨测试（参见“实验程序”）。

自由的水平我-和d日-与游离皮层相比，成年CKO小鼠大脑皮层中的丝氨酸显著减少(图3D类). 相对于Floxed皮层，我-和d日-CKO皮层的丝氨酸水平为17.7%(第页<0.0001）和9.1%(第页<0.0001）。CKO大脑皮层的游离甘氨酸含量也显著降低(第页<0.01），尽管下降幅度小于我-和d日-丝氨酸(图3E类). 同样，CKO海马表现出惊人的84.5%(第页<0.0001）和92.7%(第页<0.0001）自由基水平降低我-和d日-丝氨酸，分别与Floxed小鼠进行比较(图3F类). 与Floxed对照组相比，甘氨酸水平也降低了60%(图3克)，表明我-丝氨酸有助于甘氨酸合成，如胚胎脑组织中所示(43). 的级别我-丝氨酸和d日-Floxed和野生型小鼠大脑皮层和海马中的丝氨酸没有差异。CKO皮层和/或海马体中的其他氨基酸水平似乎发生了变化，如表1这包括大脑皮层中测得的精氨酸和苯丙氨酸水平的增加以及胱硫醚的减少。此外，与野生型相比，CKO和Floxed海马中的谷氨酰胺水平均显著增加。此外，谷氨酸含量略有下降（6%），苏氨酸含量明显下降（27-38%）。

深入了解d日-我们研究了腹腔注射对CKO脑丝氨酸形成的影响我-丝氨酸对大脑皮层丝氨酸代谢的影响。一次过量注射我-丝氨酸（5 mmol/kg；105–131μmol/只小鼠）导致我-注射后3h CKO皮层丝氨酸含量；也就是说，比注射盐水或未经处理的动物高2.7倍(图4A类). 同时d日-CKO皮层丝氨酸含量增加2.6倍(图4B类).我-Floxed小鼠皮层中的丝氨酸水平略有增加（1.3倍），而d日-注射后3小时丝氨酸水平未受影响(图4,C类和D类). 甘氨酸含量在两种基因型中均未受到显著影响（数据未显示）。这些观察结果表明d日-丝氨酸可以由我-源自大脑外的丝氨酸。注射后3小时我-丝氨酸和d日-CKO皮层中的丝氨酸分别为99.95和25.95 nmol/g湿组织(图4,A类和B类). 假设每只小鼠接受105～131μmol我-丝氨酸，很可能我-即使大脑中存在丝氨酸缺乏，丝氨酸也不能有效地通过血脑屏障。值得注意的是d日-CKO皮层中的丝氨酸与总丝氨酸的比值基本保持不变，但显著低于絮状皮层我-丝氨酸给药(图4E类).

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图4。

中的更改我-和d日-术后大脑皮层丝氨酸水平我-丝氨酸给药。 A–D，显示的是我-丝氨酸(A类和C类)以及d日-丝氨酸(B类和D类)CKO大脑皮层中的含量(A类和B类)和Floxed(C类和D类)小鼠腹腔注射过量后3h我-丝氨酸。数据表示平均值±S.E。E类，显示的是d日-丝氨酸给药后Floxed和CKO皮层中丝氨酸与总丝氨酸的比值。数据表示平均值±S.E.NT，无处理，n个=7（对于Floxed），n个=CKO为6；盐分，注入盐分，n个= 3;我-序号,我-丝氨酸注入，n个= 3). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.005与盐水注射小鼠（单向方差分析，Dunnett的事后检验）。这个我-和d日-丝氨酸数据显示在图3D类在A–D.英寸E类，***，第页< 0.005与注射盐水的Floxed小鼠（单向方差分析，Dunnett的事后检验）。

丝氨酸消旋酶和NMDA受体亚单位的表达

The marked decreases in我-和d日-丝氨酸含量促使我们假设在CKO脑中Srr和/或NMDA受体亚单位的表达可能失调。Western blot分析表明，两种基因型之间大脑皮层和海马中Srr蛋白的标准化水平没有显著差异(图5,A类和B类)表明Srr表达不受底物水平降低的影响。皮层切片的免疫组织化学显示，CKO皮层中Srr的表达水平与Floxed对照组相似。Srr免疫反应的细胞分布(绿色在里面补充图2，A类和B类)与星形胶质细胞标志物S100αβ相互排斥(红色在补充图2中). 在两种基因型中，Srr蛋白主要与神经元标记物NSE共定位(补充图2，C类和D类). Srr的神经元富集定位与最近的免疫组织学研究一致(51,52).

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图5。

丝氨酸消旋酶和NMDA受体亚单位的表达。 A类和B类，大脑皮层蛋白裂解物（10μg）中检测到Srr蛋白(A类)和海马(B类)通过Western blotting。Srr蛋白水平归一化为Gapdh蛋白水平。数据表示平均值±S.E.（大脑皮层：n个=5，海马体：n个= 4).C类和D类在大脑皮层蛋白裂解物（10μg）中检测到NMDA受体亚单位NR1和NR2B(C类)和海马(D类)通过Western blotting。表达水平归一化为Gapdh水平。数据表示平均值±S.E.（大脑皮层，n个= 5; 海马体，n个= 4).

然后，我们检测了大脑皮层和海马中主要类型的NMDA受体亚单位NR1（也称为GluRζ1）和NR2B（也称为GluRϵ2）的表达。Floxed和CKO小鼠在这些区域的标准化水平具有可比性(图5,C类和D类)，表明我-丝氨酸和d日-丝氨酸在维持这两个区域NR1和NR2B亚基的稳态水平方面没有发挥调节作用，如Srr(图5,A类和B类).

此外，我们的Western blot分析表明，CKO和Floxed小鼠大脑皮层和海马中神经元标记物SNAP-25和NSE以及星形胶质细胞标记物Gfap的正常表达水平没有差异(图6,A–D). 因此，CKO大脑的这两个区域似乎不太可能发生神经元和/或星形胶质细胞的退化。

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图6。

神经元和星形胶质细胞标记蛋白的表达。 A类和B类，在大脑皮层的蛋白裂解物（10μg）中检测到神经元标志物SNAP-25和NSE(A类)和海马(B类)通过Western blotting。将表达水平标准化为Gapdh水平。数据表示平均值±S.E.（大脑皮层，n个= 5; 海马体，n个= 4).C类和D类，在大脑皮层的蛋白裂解物（10μg）中检测到Gfap(C类)和海马(D类)通过Western blotting。表达水平归一化为Gapdh水平。数据表示平均值±S.E.（大脑皮层，n个= 5; 海马体：n个= 4).

NMDA受体功能改变

在小鼠大脑皮层中，Srr蛋白表达首次在出生后第7天检测到，此后逐渐上调，至少到出生后第56天(52). 吗啡给药增加稳态水平高级大鼠脑中的mRNA和蛋白质(57)但控制Srr表达的调控机制在很大程度上仍未探索。目前的生化和组织学实验表明，丝氨酸对映体的显著减少并不影响Srr的表达水平(图5,A类和B类)和NMDA受体亚单位(图5C类和D类)CKO小鼠的皮层和海马。因此，不太可能我-或d日-丝氨酸的可用性调节Srr和NMDA受体亚单位的水平，至少在大脑皮层和海马中是这样。尽管Srr和NMDA受体亚单位的表达水平没有显著变化(图5)，我们证明NMDA诱发弧CKO海马的转录激活减弱(图7). 最近使用敲除/突变小鼠的研究表明Srr公司缺失导致大脑显著减少d日-丝氨酸，与NMDA受体介导的神经传递减弱有关(31)和神经毒性(30,58). 此外，这两种突变小鼠的行为缺陷也很明显(31,32)尽管详细的行为表型并不一致。根据目前的研究以及这些基因的表型高级敲除/突变小鼠，我们认为我-大脑中通过磷酸化途径合成的丝氨酸是正常NMDA受体功能的关键决定因素，这取决于d日-丝氨酸保持在一定的浓度范围内。值得注意的是，删除功能普格德邦最终导致轻度产后小头畸形(图2)，在中未看到高级敲除/突变小鼠。进一步的研究旨在阐明丝氨酸缺乏与形态和行为异常之间的相关性，对于确定内源性合成的作用是必要的我-和d日-丝氨酸在脑生理和病理中的作用。