生物化学杂志。2010年12月31日；285(53): 41366–41373.
活化C激酶裂变酵母受体（RACK1）Ortholog Cpc2通过Wee1激酶调节有丝分裂承诺*
,1 ,2 , , ,和三
安德烈斯·努涅斯
来自西班牙穆尔西亚大学生物系遗传与微生物学系酵母生理学组，邮编：30071
亚历杭德罗·佛朗哥
来自西班牙穆尔西亚大学生物系遗传与微生物学系酵母生理学组，邮编：30071
特蕾莎·索托
来自西班牙穆尔西亚大学生物系遗传与微生物学系酵母生理学组，邮编：30071
杰罗·文森特
来自西班牙穆尔西亚大学生物系遗传与微生物学系酵母生理学组，邮编：30071
玛丽亚诺·加克托
来自西班牙穆尔西亚大学生物系遗传与微生物学系酵母生理学组，邮编：30071
何塞·卡萨多
来自西班牙穆尔西亚大学生物系遗传与微生物学系酵母生理学组，邮编：30071
来自西班牙穆尔西亚大学生物技术学院遗传学和微生物学系酵母生理学组，邮编30071
1西班牙塞内卡基金会（Región de Murcia）博士前研究员。
2西班牙穆尔西亚大学博士后研究员。
2010年8月10日收到；2010年10月18日修订
摘要
在裂变酵母中葡萄裂殖酵母，高度保守的Cdc2/Cdk1激酶依赖于Wee1的抑制性磷酸化决定了细胞达到一定大小时的有丝分裂开始。活化C激酶受体（RACK1）是一种在真核生物中高度保守的支架蛋白，它与其他蛋白结合以调节哺乳动物细胞中的多种过程，包括在G1/S过渡。我们最近描述了Cpc2，RACK1的裂变酵母同源物，通过积极调节其产物参与上述过程的特定基因的翻译，从核糖体控制MAPK级联的激活和细胞对氧化应激的防御。有趣的是，缺乏Cpc2的突变体在分裂时细胞大小增加，表明G区存在特定的细胞周期缺陷2/M过渡。在这项工作中，我们表明，在没有Cpc2的细胞中，Wee1有丝分裂抑制剂的蛋白质水平增加，而在上述突变中，Wee 1抑制剂Cdr2的水平下调。相反，G的动力学1/对照菌株和无Cpc2菌株的S转变几乎相同。因此，我们的结果表明，在裂变酵母中，Cpc2/RACK1通过调节蛋白质水平和Wee1活性，从核糖体积极调节有丝分裂的开始。这种新的翻译控制细胞周期进程的机制可能在高等真核生物中保持不变。
关键词：CDK（细胞周期依赖性激酶）、细胞周期、有丝分裂、核糖体、酵母遗传学
介绍
细胞繁殖涉及一系列统称为细胞周期的过程，包括DNA复制（S期）、染色体分离和核分裂（有丝分裂）以及细胞分裂（胞质分裂）等交替阶段。细胞周期蛋白B结合的Cdc2/Cdk1激酶的激活可诱导有丝分裂的进入，该激酶在真核细胞中高度保守(1). 在裂变酵母中葡萄裂殖酵母保守酪氨酸15（Tyr15)在Cdc2中调节其激酶活性，当细胞达到一定大小时，激酶活性决定有丝分裂的开始和分裂的开始(2). 激酶Wee1通过抑制性Tyr下调Cdc215磷酸化，被Cdc25磷酸酶逆转，导致Cdc2活化并触发有丝分裂进入(三,–6). 因此，缺乏Wee1活性的分裂酵母细胞在达到临界大小之前进入有丝分裂，产生两个小的子细胞(7). 相反，Cdc25中的突变体以增加的细胞大小进入有丝分裂，这表明必须严格调节Cdc25和Wee1的活性/水平，以精确控制有丝分裂的开始。在裂变酵母中，Wee1被磷酸化，其活性由两种SAD家族激酶Nim1（也称为Cdr1）负调控(8,–12)和Cdr2(13,14). 最近，有报道称，涉及DYRK家族激酶Pom1的细胞末端梯度通过将细胞长度与G偶联，在控制细胞周期进展中起着关键作用2/通过磷酸化和Cdr2活性的阴性控制实现M转换(15,16).
球拍14(第页接收器一活化蛋白C类 k个inase）是WD重复序列蛋白质大家族的成员，是一种36-kDa蛋白，与异源三聚体G蛋白的β亚基同源，在真核生物中高度保守(17). RACK1最初被描述为与不同蛋白激酶C亚型相互作用的能力。进一步的研究表明其作为支架的作用是通过结合介导各种信号通路之间的串扰体内并调节多种生物过程，如MAPK激活、血管生成、肿瘤生长、神经元反应、凋亡、染色质重塑和生物钟的正常功能(17,–20). Cpc2，即分裂酵母RACK1同源物，通过其对蛋白激酶Ran1/Pat1的作用而被鉴定，该激酶控制从有丝分裂到减数分裂的转变(21). 缺乏Cpc2的突变体表现出几种特征表型，如缺氮条件下的性分化缺陷和对不同胁迫的敏感性(21,22). 有趣的是，RACK1/Cpc2蛋白是40S核糖体亚单位的结构成分(23,–27)位于mRNA出口通道附近，与eIF3复合物的结合面密切接触(27). 在这种情况下，我们最近描述了在裂变酵母中，Cpc2通过正向调节特定mRNA的翻译而从核糖体发挥作用，如编码Pyp1和Pyp2酪氨酸磷酸酶的mRNA，这些mRNA控制Pmk1和Sty1 MAPKs的激活量以及转录因子Atf1的功能，调节对压力的全球转录反应(22). 这些结果支持RACK1/Cpc2可能为翻译参与关键细胞过程的特定mRNA亚群提供了一个平台(22,25).
RACK1/Cpc2的另一个相关生物学功能与细胞周期控制有关。例如，在寄生虫体内布氏锥虫，TRACK（RACK1 ortholog）参与有丝分裂和胞质分裂最后阶段的控制(28). 此外，遗传和生物化学方法表明，RACK1在G1/通过抑制Src（一种在细胞信号传导中起多种作用的非受体蛋白酪氨酸激酶）的活性，以及Src介导的细胞周期调节因子在G1从而推迟进入S阶段(29,30). 然而，缺乏Cpc2的分裂酵母突变体在分裂时细胞大小增加，表明G区存在特定的细胞周期缺陷2/M过渡(21). 在这项工作中，我们利用了庞贝乳杆菌作为一个合适的模型来确定与细胞周期相关的分子机制，我们表明Cpc2是参与调控该生物体有丝分裂开始的关键元素。
实验程序
菌株和生长条件
这个庞贝乳杆菌菌株()在28°C的YES培养基或EMM2中摇晃培养(34)添加2%的葡萄糖，并根据其特殊要求补充腺嘌呤、亮氨酸、组氨酸或尿嘧啶（100 mg/L，Sigma）。在使用cdc25-22型或cdc10-129温度敏感性突变菌株，细胞在YES培养基中生长到A类600在25°C（允许温度）下，温度为0.2，移动至37°C 3.5 h，并通过转移至25°C，从生长停滞中释放出来。
表1
| 应变 | 基因型 | 来源/参考 |
|---|
| MM1公司 | 小时+ | ade6-M216列1-32 ura4D-18 | 33 |
| MM2型 | 小时− | ade6-M216列1-32 ura4D-18 | 33 |
| AN001型 | 小时+ | ade6-M216立方厘米2::KanR leu1-32 ura4D-18 | 22 |
| AN002型 | 小时− | ade6-M216 cpc2::KanR leu1-32 ura4D-18 | 22 |
| PPG148型 | 小时− | cdc25-22 ura4-D18 | 佩雷斯实验室 |
| AN-CC18型 | 小时− | cdc25-22 cpc2::KanR ura4-D18公司 | 这项工作 |
| 326 | 小时− | cdc10-129 | 实验室库存 |
| AN-CC10型 | 小时− | cdc10-129 cpc2::KanR公司 | 这项工作 |
| 560 | 小时− | mcm4-GFP型::尿酸4+鲁1-32乌拉4− | 35 |
| AN-CC16型 | 小时− | mcm4-GFP型::尿酸4+cpc2::KanR leu1-32 ura4公司− | 这项工作 |
| AN-CC21型 | 小时+ | cdc10-129 mcm4-GFP::尿酸4+鲁1-32乌拉4− | 这项工作 |
| AN-CC22型 | 小时+ | cdc10-129 mcm4-GFP::尿酸4+cpc2::KanR leu1-32 ura4公司− | 这项工作 |
| 军情709 | 小时− | 威斯1DD-12myc::尿酸4+pmk1-HA6H型::尿酸4+亮氨酸1-32 ura4-D18 | 38 |
| 安600 | 小时− | 威斯1DD-12myc::尿酸4+pmk1-HA6H型::尿酸4+cpc2::KanR leu1-32 ura4-D18号机组 | 这项工作 |
| 米204 | 小时+ | ade公司−苯乙烯1::尿酸4+pmk1-HA6H型::尿酸4+亮氨酸1-32 ura4-D18 | 38 |
| AN-120型 | 小时+ | ade公司−样式1::尿酸4+cpc2::坎R pmk1-HA6H::尿酸4+亮氨酸1-32 ura4-D18 | 这项工作 |
| 16230财年 | 小时− | cdc2–3w cdc25::尿酸4+鲁1-32 ura4-D18 | YGRC公司 |
| AN-CC3型 | 小时− | cdc2–3w cdc25::尿酸4+cpc2::KanR leu1-32 ura4-D18号机组 | 这项工作 |
| 7108财年 | 小时− | ade6-M216，1-50周 | YGRC公司 |
| AN-CC5型 | 小时− | ade6-M216，1-50 cpc2::KanR公司 | 这项工作 |
| 7287财年 | 小时− | cdc2-1w列1-32 | YGRC公司 |
| AN-CC1型 | 小时− | cdc2-1w cpc2::KanR列1-32 | 这项工作 |
| AN071型 | 小时+ | ade6-M216 cpc2::KanR cpc2-GFP公司::亮氨酸1+pmk1-HA6H型::尿酸4+鲁1-32 ura4D-18 | 这项工作 |
| AN072型 | 小时+ | ade6-M216 cpc2::KanR cpc2（R36D K38E）-GFP::列1+pmk1-HA6H:ura4+鲁1-32 ura4D-18 | 这项工作 |
| FM-23型 | 小时− | ade6-M216 cdc25-HA::KanR leu1-32 ura4-D18号机组 | 实验室库存 |
| AN-CC20型 | 小时− | ade6-M216 cdc25-HA::KanR cpc2::KanR leu1-32 ura4-D18号机组 | 这项工作 |
| 1081 | 小时− | 我们1-3HA6H ura4-D18 leu1-32 | 31 |
| AN-CC8型 | 小时− | wee1-3HA6H cpc2::KanR leu1-32 ura4-D18号机组 | 这项工作 |
| AN-CC45型 | 小时− | 我们1-3HA6H cdr2::KanR leu1-32 ura4-D18号机组 | 这项工作 |
| AN-CC46型 | 小时− | 我们1–3HA6H cdr2::KanR cpc2::KanR leu1–32 ura4-D18 | 这项工作 |
| MM-76型 | 小时+ | pom1-GFP::KanR leu1-32 ura4-D18号机组 | 实验室库存 |
| AN-CC35型 | 小时+ | pom1-GFP::KanR cpc2::KanR leu1-32 ura4-D18号机组 | 这项工作 |
| LW117型 | 小时− | 尼姆1-2HA6his::尿酸4+亮1-32 ura4-D18 | P.罗素实验室 |
| AN-CC15型 | 小时− | nim1–2HA6小时::尿酸4+cpc2::KanR leu1-32 ura4-D18号机组 | 这项工作 |
| JK2310型 | 小时− | cdr2-2HA6本::尿酸4+鲁1-32 ura4-D18 | P.Russell实验室 |
| AN-CC14型 | 小时− | cdr2-2HA6本::尿酸4+cpc2::KanR leu1-32 ura4-D18号机组 | 这项工作 |
| AN-CC23型 | 小时− | cdr2-2HA6本::尿酸4+cpc2::KanR cpc2-GFP公司::列1+鲁1-32 ura4-D18 | 这项工作 |
| AN-CC24型 | 小时− | cdr2–2HA6本::尿酸4+cpc2::KanR cpc2（R36D K38E）-GFP::列1+鲁1-32 ura4-D18 | 这项工作 |
| JK2240型 | 小时− | cdr2:ura4+鲁1-32 ura4-D18 | P.Russell实验室 |
| AN-CC12型 | 小时− | cdr2::尿酸4+中央处理器2::KanR亮1-32 ura4-D18 | 这项工作 |
| TS313型 | 小时− | ade6-M216 pom1::坎R pmk1-HA6H::尿酸4+鲁1-32 ura4D-18 | 32 |
| AN-CC27型 | 小时− | ade6-M216 pom1::KanR cpc2::坎R pmk1-HA6H::尿酸4+列1–32 ura4D-18 | 这项工作 |
流式细胞术
单元格（107)2000×离心回收克5分钟，用1毫升70%的冷乙醇固定。细胞在50 m内重新水化米柠檬酸钠，0.1 mg/ml RNaseA，在37°C下培养2 h，并用4μg/ml碘化丙啶染色。使用配备CellQuest软件的Becton Dickinson FACSort细胞仪分析细胞。
Mcm4的原位染色质结合分析
本试验按照Kearsey描述的方案进行等。(35)，稍作修改。简单地说，通过离心（3000×克1分钟）并重新悬浮在ZM缓冲区（50 m米柠檬酸钠，pH 5.6，1.2米山梨醇，0.5米米醋酸镁，和10 m米DTT）加上2 mg/ml酶解酶50T（Seikagaku公司），并通过在32°C下培养10分钟使其渗透。然后在Stop缓冲液（0.1米人工编码站，pH 6.6，1.2米山梨醇，1米米EDTA和0.5 m米乙酸镁），并重悬于EB缓冲液（20 m米管道，pH 6.8,0.4米山梨醇，2米米醋酸镁，150 m米醋酸钾加上从Sigma获得的特定蛋白酶抑制剂混合物）。细胞悬液分为两等分；一个保持不变，另一个在室温下用0.02体积的Triton X-100处理5分钟。之后，通过离心回收细胞，首先重悬于甲醇中，然后重悬于丙酮中，最后通过荧光显微镜观察（见下文）。
基因破坏与表位标记
这个cpc2+-以质粒pFA6a-KanR为模板，通过PCR-介导的策略，完全删除相应的编码序列并用KanR盒替换，获得了空突变体(36). 通过转化（醋酸锂法）获得突变菌株(34)或通过EMM2中的交配和二倍体选择而不添加补充剂。通过葡萄糖醛酸酶处理纯化孢子(37)并允许在EMM2中发芽，再加上适当的要求。PCR和Western blot分析验证了菌株的正确结构（见下文）。
不同温度下细胞生长敏感性的测定
平板试验中，野生型和突变株庞贝乳杆菌在YES液体培养基中培养至A类6000.6。在含有2%（w/v）Bacto琼脂（Difco）的YES固体平板上每两份找到适当的稀释液，并在25、30、32、34或37°C下培养3天，然后拍照。
检测Wee1-、Cdc25-、Pom1-、Cdr1-和Cdr2-标记的引信
在所有情况下，通过4°C离心收集30-40 ml培养物，用冷PBS缓冲液清洗细胞，并立即将酵母颗粒冷冻在液氮中。总细胞匀浆在描述的自然条件下制备(38)，采用冷冻酸洗玻璃珠和裂解缓冲液（10%甘油，50 m米三氯化氢，pH 7.5，150 m米NaCl，0.1%Nonide P-40，加上真菌和酵母提取物专用蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，来自Sigma）。在20000×克30分钟后，根据融合蛋白的相对大小，在6–12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中溶解，然后转移到过滤器中。Western blotting实验中使用了以下抗体：小鼠单克隆抗HA抗体（克隆12CA5；Roche Molecular Biochemicals）、兔多克隆抗Cdc2 pY15抗体（Chemicon International）、鼠单克隆抗GFP抗体（Roche Applied Science）。使用兔抗Cdk1/Cdc2（PSTAIR）多克隆抗体（Upstate Biotechnology）作为负荷控制。使用抗鼠或抗兔HRP结合二级抗体（Sigma）和ECL（Amersham Biosciences）或Supersignal（Pierce）系统检测免疫反应带。
Northern Blot分析
酵母细胞在YES培养基中培养至A类6000.8，回收培养液50ml。总RNA制备如前所述，并通过1.5%琼脂糖甲醛凝胶溶解。如前所述，进行了Northern（RNA）杂交分析(22). 使用的探针通过PCR扩增，包括0.8kbp的星期一+用5′寡核苷酸TCTCCATTTGCATCGGGC和3′寡核苷酸AGGGGGATCGAACCTCA扩增的基因；1.5kbp的片段尼姆1+用5′寡核苷酸GGGACGTCTATTTGATTGCC和3′寡核苷酸ATGGTGAGCGACACAAAAAAT扩增基因；1.2kbp的片段cdr2+用5′寡核苷酸GGACGGATTGTCGGACGA和3′寡核苷酸AGGACATCCAACGCGC扩增基因；以及亮氨酸1+用5′寡核苷酸TCGTCGTCTTACCAGGAG和3′寡核苷酸CACAGCCTTAATAT扩增基因。使用现成DNA标记珠（GE Healthcare）进行DNA标记。为了确定定量结论，在荧光成像仪（分子动力学）中测定了mRNA的水平，并与内部对照进行了比较(列1+mRNA）。
荧光显微镜
为了确定分裂时的细胞大小，将酵母菌株在EMM2或YES培养基中培养至A类6000.5，用钙氟白色处理，特别是对细胞壁和隔膜进行染色(39). 每个突变体至少有200个分隔细胞被计分。如前所述，在细胞核DAPI染色后评估双核细胞(39). 在Mcm4-GFP染色质结合试验中，Triton X-100提取的和未提取的细胞在丙酮中回收，再悬浮在2 m的TBS缓冲液中米氯化钙2DAPI染色。提取液中含有核Mcm4-GFP的细胞百分比与对未提取的细胞进行评估。使用配备100×物镜的徕卡DM 4000B荧光显微镜，使用冷却的徕卡DC 300F相机和IM50软件捕获图像，然后导入Adobe PhotoShop CS3（Adobe Systems）。
结果的再现性
所有实验重复至少三次，结果相似。显示了具有代表性的结果。
结果
Cpc2积极调节G2/细胞周期中的M转变
庞贝乳杆菌缺乏Cpc2的突变体在分裂时细胞大小增加(A类) (21,22). 在真核细胞中，Cdk1/Cdc2激酶活性在G2通过Tyr磷酸化实现细胞周期的阶段15(2). 因此，我们检测了Tyr的Cdc2磷酸化水平15在PPG148菌株同步培养的细胞周期中(cdc25-22)和AN-CC18(cdc25-22 cpc2Δ)在25°C下生长到对数期后，将细胞移到37°C下3.5小时，以阻止细胞进入G2，然后孵育至25°C。如所示B类，Cdc2-Tyr的最低水平15磷酸化cdc25-22 cpc2Δ与对照细胞相比，细胞表现出延迟动力学（～150分钟cdc25-22 cpc2Δ细胞与～90分钟）。双核（进入有丝分裂）和间隔细胞的最大百分比在cdc25-22 cpc2Δ突变体，证实G细胞周期缺陷2有趣的是，在cdc25–22通过同时删除cpc2+(,C类和D类). 综上所述，这些结果表明，在裂变酵母中，Cpc2正向调节G2/通过影响Cdc2激酶的磷酸化状态在细胞周期中进行M转换。
Cpc2是G的正调节因子2/细胞周期中的M转变。 A类菌株MM2（对照）和AN002的细胞形态和分裂尺寸（微米±S.D.）(cpc2Δ)在28°C的YES培养基中生长，并用钙荧光白染色。B类，来自菌株PPG148的细胞(cdc25-22型)和AN-CC18(cdc25-22 cpc2Δ)成长为A类600在25°C条件下，0.3的浓度，转移至37°C 3.5小时，然后通过转移至25°C，从生长停滞中释放出来。在不同的时间间隔采集等分样品，并在Tyr进行Cdc2磷酸化15或分别用抗Cdc2 pY15和抗Cdk1/Cdc2（PSTAIR）抗体免疫印迹法检测总Cdc2。下部、分隔细胞、双核细胞和Tyr的相应百分比15磷酸化cdc25-22 (实心钢筋)以及cdc25–22 cpc2Δ(开放式酒吧)单元格(n个= 4).C类，样本包含10个4, 10三, 102、或101菌株MM2（对照）、PPG148的细胞(cdc25-22型)和AN-CC18(cdc25-22立方厘米2Δ)在YES培养基中生长的细菌被发现在添加了Bacto琼脂的YES培养板上，并在25°C、28°C、34°C和37°C中培养3天，然后拍照。D类PPG148菌株分裂时的细胞形态和大小(cdc25-22型)和AN-CC18(cdc25-22 cpc2Δ)在28°C下生长，如中所述A类.
Cpc2不调节G1/裂变酵母中的S跃迁
RACK1是高等真核细胞中的Cpc2同源基因，通过抑制G中Src激酶的活性来调节细胞生长1因此延迟进入S阶段(29,30). 相反，下调RACK1激活Src介导的信号传导并加速G1/S级数(29). 尽管上述结果表明，Cpc2调节G的长度2在分裂酵母细胞周期的阶段，它在G1/S过渡。为了测试这种可能性，我们用控制和cpc2Δ含有Cdc10热敏等位基因的细胞(cdc10-129)，它诱导几个基因的转录，这些基因是通过G1进入S相(40). 菌株326(cdc10-129)和AN-CC10(cdc10-129 cpc2Δ)在G早期同步1在37°C下培养4小时，然后再次培养至25°C。对随后采集的样本进行的流式细胞术分析表明，在G期，DNA含量从1C增加到2C的速率1/两个菌株的S转变相似(A类)支持Cpc2不参与细胞周期这一阶段的调控。我们进一步分析了G1/通过使用控制和cpc2Δcdc10ts秒表达C末端GFP标记Mcm4的细胞，Mcm4是一种DNA复制因子，在早期S期形成复制前复合体的一部分(35). Mcm4是研究G动力学的理想工具1/不同情况下的S转换，因为该因子在B后期稳定地与染色质结合，并在S期随着复制的进行而移位(35,41). 如所示B类(上面的和降低)，染色质结合的Mcm4-GFP在从限制温度释放细胞后60分钟内出现最大值cdc10型吨ts秒控制(41)以及cdc10ts秒cpc2Δ培养基，随后减少。此外，Cdc2-Tyr的增加15G期磷酸化1/中的S转换cdc10型ts秒细胞不受Cpc2缺失的影响(C类). 总的来说，这些结果证实了Cpc2不调节G1/裂变酵母细胞周期中的S转换。
Cpc2不调节G1/细胞周期中的S进展。 A类326株细胞的流式细胞术直方图(cdc10-129)和AN-CC10(cdc10-129 cpc2Δ)在37°C的YES培养基中孵育3.5 h，将其同步化，再转移回25°C，并孵育指定的时间。B类,上面的，来自菌株AN-CC21的细胞(cdc10-129 mcm4:GFP)和AN-CC22(cdc10-129 mcm4:GFP cpc2Δ)在G同步1在37°C的YES培养基中孵育3.5小时，然后转移回25°C。在不同的时间采集样本，并通过荧光显微镜估计具有稳定染色质结合Mcm4（GFP阳性细胞）的细胞百分比(n个= 3).实心圆圈，菌株AN-CC21；开放三角形，菌株AN-CC22。B、 较低释放后60分钟，上述表达Mcm4-GFP菌株的细胞的显微照片，并用DAPI染色。C类，来自菌株326的同步细胞(cdc10-129)和AN-CC10(cdc10-129 cpc2Δ)在25°C下释放。在不同的时间间隔取等分试样，并在Tyr下磷酸化Cdc215或分别用抗Cdc2 pY15或抗Cdk1/Cdc2（PSTAIR）抗体免疫印迹法检测总Cdc2。
G的Cpc2调节2/M过渡需要Wee1
到目前为止，我们已经证明了这一点cpc2Δ突变细胞在G时经历特定的细胞周期延迟2/M过渡。MAPK Sty1是SAPK途径的主要效应物，它在分裂酵母中以至少两个不同的水平控制有丝分裂的开始：（i）通过在Ser上磷酸化Plo1（Polo激酶）402并促进其在纺锤体极体内的补充，以调节Cdc25/Wee1对Cdc2活性的控制(42); 和（ii）通过结合和磷酸化MAPKAP激酶-2相关蛋白Srk1，该蛋白通过直接磷酸化和抑制Cdc25磷酸酶来控制有丝分裂的进入(43). 鉴于样式1Δ由于G值的增加，单元格以增大的大小显示除法2/M延迟，突变细胞表达组成活化版本的MAPK激酶Wis1(威斯1DD)直接激活Sty1，促进有丝分裂并在细胞缩小时分裂(A类) (42,44). 然而，在这两者中样式1Δ和威斯1DD我们观察到cpc2+促进了分裂时细胞大小的明显增加(A类)表明Cpc2对G期细胞周期的控制2/M在有丝分裂期间独立于Sty1功能。
Wee1是Cpc2在G调节期间的目标2/M过渡。 A类MI709菌株分裂时的细胞形态和大小（微米±S.D.）(威斯1DD)和AN600(威斯1DD cpc2Δ) (上面的)，MI204型(样式1Δ)和AN-120(样式1Δcpc2Δ) (降低)用钙荧光白染色后，在YES培养基中生长。B类,上面的FY16230菌株分裂时的细胞形态和大小(cdc2-3w cdc25Δ)和AN-CC3(cdc2-3w cdc25Δcpc2Δ)如上所述准备。B类,降低，样本包含10个4, 10三, 102、或101FY16230菌株的细胞(cdc2-3w cdc25Δ)和AN-CC3(cdc2-3w cdc25Δcpc2Δ)在YES培养基中生长，将其置于添加Bacto琼脂的YES培养板上，并在25°C、28°C、34°C或37°C下培养3天，然后拍照。C类FY7287菌株分裂时的细胞形态和大小(cdc2-1w型)和AN-CC1(cdc2-1w cpc2Δ) (上面的)，7108财年(第1-50周)和AN-CC5(我们1-50 cpc2Δ) (降低)如上所述准备。
在裂变酵母中，Cdc2激酶的活性通过Tyr处的磷酸化负调控15通过酪氨酸磷酸酶Cdc25和Wee1酪氨酸激酶的拮抗作用(6). 为了检查Cpc2对Cdc2的信号是否由Cdc25介导，我们使用cdc2-3w cdc25Δ背景，其中cdc2-3w型变异渲染庞贝乳杆菌对缺乏Cdc25磷酸酶不敏感的细胞(三). 如所示B类，除法处的单元格大小(上面的)和热敏表型(降低)英寸cdc2-3w cdc25Δcpc2Δ与相比，细胞明显增多cdc2-3w cdc25Δ细胞。因此，我们将注意力转向Wee1激酶，它使Cdc2保持非活性状态(6). 值得注意的是，在分裂时没有观察到细胞大小的增加cdc2-1w cpc2Δ细胞与cdc2-1w型突变体(C类)，显示wee1表型，对wee1活性不敏感(三). 与此一致的是，在Wee1中表达温度敏感突变的菌株分裂时的细胞大小(第1-50周)不受同时删除的影响中央处理器2+(C类). 这些发现支持有丝分裂过程中Cpc2介导的细胞周期控制需要Wee1。
他人和我们之前的工作已经证明，在裂变酵母中，Cpc2是一种核糖体结合蛋白，它调节特定mRNA的翻译，其产物参与各种反应，包括调节MAPK活性和细胞对氧化应激的防御(22,23). 重要的是，通过使用表达与核糖体结合能力降低的突变型Cpc2（R36D/K38E）的菌株体内(22)，我们还表明，Cpc2的核糖体结合对于在G2/M边界(A类). 上述结果以及已知Wee1以剂量依赖方式抑制有丝分裂周期进展的事实(三)，增加了缺乏Cpc2可能增加Wee1蛋白水平和/或活性的可能性。事实上，尽管Cdc25蛋白水平在有无Cpc2的情况下没有显著影响(B类)，不断增长的文化cpc2Δ与对照细胞相比，细胞显示Wee1蛋白水平增加（表达为与HA6H表位融合的染色体标记蛋白）（参见0倍，C类). 此外，在cpc2Δ细胞不是由星期一+信使核糖核酸(D类)表明Cpc2通过抑制相应mRNA的翻译来负调控Wee1的表达。或者，Cpc2突变可能影响Wee1蛋白的稳定性或周转。
Cpc2负调节Wee1蛋白水平。 A类，Cpc2的核糖体结合对G的正确调节至关重要2/M过渡。菌株AN071分裂时的细胞形态和大小（微米±S.D.）(cpc2Δcpc2-GFP)和AN072(cpc2Δcpc2（德国）-GFP)在YES培养基中生长并用钙荧光白染色。B类，菌株FM-23(cdc25-HA，控制）和AN-CC20(cdc25 HA中央处理器2Δ)在YES培养基至中对数期生长。用抗HA抗体免疫印迹法检测细胞提取物中的Cdc25。抗Cdc2抗体用于负荷控制。C类,左边，菌株1081(杂草1-3HA，控制）和AN-CC8(介于1-3HA cpc2之间Δ)生长在YES培养基至中对数阶段。获得总提取物，用抗HA抗体免疫印迹法检测Wee1。抗Cdc2抗体用于负荷控制。C类,正确的用20μg/ml环己酰亚胺处理在YES培养基中生长的菌株1081和AN-CC8，并在指定时间取等分样品。如上所述检测Wee1和Cdc2。D类，菌株1081（对照）和AN-CC8(cpc2Δ)在YES中到早期测井阶段生长。从每个样品中提取总RNA，并在1.5%琼脂糖甲醛凝胶中溶解20μg。将变性RNA转移到尼龙膜上并与之杂交32P标记探针星期一+和列1+（装载控制）。
令人信服的证据表明，Wee1对G至关重要2在环己酰亚胺存在下，裂变酵母对蛋白质合成的部分抑制所经历的延迟，在这些条件下，Wee1蛋白水平上调(45). 有趣的是，环己酰亚胺处理过cpc2Δ与对照细胞相比，细胞进一步增加了Wee1水平，支持了Cpc2介导的Wee1调控在不同水平上进行(C类).
Wee1抑制剂Cdr2在cpc2Δ细胞中的蛋白水平下调
Wee1在裂变酵母中由两种密切相关的蛋白激酶Nim1/Cdr1和Cdr2负调控(12,14). 最近，有报道称DYRK家族蛋白激酶Pom1以剂量依赖性的方式磷酸化并抑制Cdr2，以协调适当细胞大小下有丝分裂进入的时间(15,16).
我们观察到Wee1在cpc2Δ细胞引导我们探索Pom1、Cdr1或Cdr2的蛋白水平可能在该突变中发生改变的可能性。如所示,A类和B类Pom1和Cdr1水平（分别表达为与GFP和HA6H表位融合的基因组版本）均未受到以下因素的显著影响cpc2+删除。然而，与对照细胞相比，cpc2Δ细胞表现出Cdr2激酶蛋白水平的明显降低，表现为与HA6H表位融合的基因组版本(C类). Cdr2的这种减少量在表达不与核糖体结合的突变Cpc2（DE）蛋白的细胞中也很明显(C类). 同样，Cdr2蛋白水平的降低并不是由于cdr2+信使核糖核酸(D类). 令人惊讶的是cdr2Δcpc2Δ突变体仍然高于cdr2型Δ单元格(,E类和F类). 此外，cpc2+删除也增加了分裂时的细胞大小pom1型Δ单元格(克)，由于缺乏Cdr2抑制作用，其分裂很小(15,16). 总体而言，我们的研究结果表明，Cdr2依赖和独立机制都是Wee1水平升高和G2/中的M缺陷cpc2Δ细胞。
Wee1抑制剂Cdr2的蛋白水平受Cpc2的正向调节。 A类，菌株MM-76(pom1-GFP，控制）和AN-CC35(pom1-GFP cpc2Δ)在YES培养基至对数中期生长，获得总细胞提取物，并用抗GFP抗体免疫印迹检测Pom1。抗Cdc2抗体用于负荷控制。B类，菌株LW117(尼姆1-HA6H，控制）和AN-CC15(nim1-HA6H cpc2Δ)按照上述方法生长，用抗HA抗体免疫印迹法检测Nim1。C类，菌株JK2310(cdr2-HA6H，控制），AN-CC14(cdr2-HA6H cpc2Δ)，AN-CC23型(cdr2-HA6H cpc2-GFP)和AN-CC24(cdr2-HA6H cpc2（DE）-GFP)在上述YES培养基中培养，用抗HA抗体免疫印迹检测Cdr2。D类，菌株LW117（对照），AN-CC15(cpc2Δ)、JK2310（控制）和AN-CC14(cdr2-HA6H cpc2Δ)在YES中到早期测井阶段生长。从每个样品中提取总RNA，并在1.5%琼脂糖-甲醛凝胶中溶解20μg。将变性的RNA转移到尼龙膜上，并与32P标记探针尼姆1+（菌株LW117和AN-CC15），cdr2+（菌株JK2310和AN-CC14），以及列1+（装载控制）。E类JK2240菌株的细胞形态和分裂尺寸（微米±S.D.）(cdr2Δ)和AN-CC12(cdr2Δcpc2Δ)在YES培养基中生长并用钙荧光白染色。F类，菌株1081(杂草1-3HA，控制），AN-CC45(我们1-3HA cdr2Δ)和AN-CC46(我们1-3HA cdr2Δcpc2Δ)在YES培养基至中对数期生长。获得总提取物，用抗HA抗体免疫印迹法检测Wee1。抗Cdc2抗体用于负荷控制。克TS313菌株的细胞形态和分裂尺寸（微米±S.D.）(pom1型Δ)和AN-CC27(pom1型Δcpc2Δ)按中所述确定A类.
讨论
我们的工作结果提供了强有力的生物化学和遗传学证据，表明Cpc2，即裂变酵母中的RACK1同源物，从核糖体正向调节G2/通过调节Wee1激酶的蛋白水平实现M转换。这种激酶反过来直接磷酸化并抑制Cdc2的活性，Cdc2是真核生物有丝分裂开始的主要调节器。Wee1激酶的活性是真核生物有丝分裂承诺的剂量依赖性抑制剂(三)因此，在细胞周期进程中，它们的细胞水平和功能必须受到严格调控。事实上，在G期间，Wee1被证明是不稳定的2从酵母到人类的各种生物体中细胞周期的M期(46). 在裂变酵母中，而周1+mRNA在细胞周期中保持不变，Wee1蛋白水平在整个细胞周期中振荡，在M和G期间下降1相位(47). 在这项工作中，我们已经表明庞贝乳杆菌缺乏Cpc2的突变体经历G2/M延迟依赖于Wee1，因为在没有Wee1功能的情况下，Cpc2突变体分裂时增加的细胞大小受到抑制。相反，要么取消Cdc25活性，要么下调Sty1 MAPK通路，该通路通过Srk1 MAPKAPK调节Cdc25的活性(43)，在缺乏Cpc2的情况下加重细胞周期缺陷。重要的是，在Cpc2-null突变体中，Wee1蛋白水平上调，而不是Cdc25蛋白水平上调。这表明，正如下文所讨论的，它们至少在一定程度上对这些细胞的细胞周期进展缺陷负责。
据报道，环己酰亚胺介导的蛋白质合成部分抑制增加了庞贝乳杆菌Wee1蛋白水平并促进细胞周期停滞2(45). 我们证实了这一结果，并进一步发现Cpc2缺失会导致环己酰亚胺处理细胞中Wee1水平的增加。考虑到Cpc2与40S核糖体亚基相关，环己酰亚胺特异性结合60S核糖体亚基以阻止蛋白质合成过程中延伸的移位步骤，这一结果是有意义的(48). 考虑到Cpc2/RACK1作为结合不同蛋白质的平台的多功能性，这一过程可能涉及一个或多个Cpc2-结合伙伴。最近有报道称，Cpc2与Moc2/Ded1（一种参与性分化的必需RNA解旋酶，作为一般翻译调节因子）和Moc1/Sds23（一种性发育诱导因子，参与应激抵抗）相关(49). Cpc2-Moc介导的复合物似乎是一种翻译调节物，通过Ste11转录因子参与控制裂变酵母的性别分化(49). 因为已知Moc2/Ded1和Moc1/Sds23在有丝分裂细胞周期的调节中也起着重要作用(50,51)，它们可能被认为是构成控制Wee1的Cpc2依赖性翻译机制的一部分的有力候选。
激酶依赖性过度磷酸化是M期Wee1失活的一种保守机制(46). 在裂变酵母中，这一任务至少由两种SAD激酶完成，即Nim1/Cdr1和Cdr2，它们磷酸化并使Wee1失活(8,–14). 因此，删除尼姆1+/cdr1+或cdr2+导致G2/由于缺乏Wee1下调导致M延迟(8,–14). 重要的是，我们发现在没有Cpc2的情况下，Cdr2的蛋白水平下调，支持Cpc2发挥其作为编码Cdr2 mRNA的正翻译调节器的功能。此外，此控件特定于cdr2+因为在没有Cpc2的情况下，Cdr1的蛋白质水平保持不变。然而，不能排除Cpc2对Cdr2周转产生积极影响的可能性。
总的来说，我们的研究结果强烈表明，在裂变酵母中，Cpc2通过至少两种不同的机制靶向Wee1：下调Wee1蛋白水平和积极调节Wee1抑制剂Cdr2的翻译。细胞周期缺陷和Wee1水平的增加cdr2Δcpc2Δ单元格与cdr2Δ或中央处理器2Δ单个突变体，以及对pom1型Δ通过同时删除cpc2+支持这两种替代性监管机制的存在。在这种情况下，最近有报道称，在人类细胞中，RACK1与低氧诱导因子-1结合，并通过E3泛素连接酶复合物促进其降解，该复合物与伸长素C相关(52). 相反，RNA干扰导致的RACK1功能丧失增加了低氧诱导因子-1水平，增强了其转录活性(52). 有趣的是，RACK1的WD-40重复序列6（WD6）中的22氨基酸序列负责与低氧诱导因子-1和伸长素C结合(52)在Cpc2中保守，强烈表明在裂变酵母中，Cpc2可能通过类似的机制调节Wee1的稳定性和/或周转。
在小鼠NIH3T3细胞中，RACK1结合并抑制Src1在G1，延迟细胞进入S相(29). RACK1-Src复合物的破坏导致细胞周期素依赖性激酶CDK2和CDK4的活性增加，细胞周期素A、E和D1的诱导，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p16、p15和p27的表达受到抑制，pRB（视网膜母细胞瘤蛋白）的磷酸化增加，所有这些都是G的关键调节剂1/S转换(30). 相反，我们的结果表明，在裂变酵母中，Cpc2没有发挥类似的作用，因为G1/通过流式细胞术分析、复制前复合物形成和Tyr处的Cdc2磷酸化来估计S转变15，在控制和cpc2Δ细胞。因此，RACK1蛋白作为细胞周期进程调节剂的功能似乎在进化过程中有所不同。在这种情况下，已经证明在裂变酵母中表达大鼠RACK1可以在结构和功能上补充cpc2Δ细胞，包括G处的细胞周期缺陷2/M（M）(21). 因为RACK1也存在于40S核糖体亚基上，所以在高等真核生物中，RACK1可能也通过核糖体控制G2/细胞周期的M转变以Wee1依赖的方式进行，类似于Cpc2。庞贝乳杆菌细胞大部分时间（约四分之三的周期）都在G2，而G1通常是哺乳动物细胞周期中最长的阶段(6). 这种情况可能会以某种方式掩盖RACK1和Cpc2的不同精细控制的存在。无论如何，这里的结果揭示了Cpc2在G中的关键作用2/裂变酵母中的M转变，并定义了在该模型生物体有丝分裂开始期间在翻译水平上存在一种新的控制。
致谢
我们感谢R.R.Daga（西班牙巴勃罗·德奥拉维德大学）对手稿的批判性阅读；T.Kato（日本ERATO）、S.E.Kearsey（英国牛津大学）、P.Nurse（纽约洛克菲勒大学）、J.B.Millar（英国华威大学）、Pérez（CSIC/西班牙萨拉曼卡大学）、P.Russell（加州拉霍拉斯克里普斯研究所）和酵母遗传资源中心（日本YGRC）用于供应酵母菌株；和P.Pérez帮助进行流式细胞术分析。
*这项工作得到了MICINN Grants BFU2008-01653和Fundación Séneca（Región de Murcia），西班牙，Grant 08725/PI/08（致J.C.）的支持。
4使用的缩写如下：
- 机架1
- 活化蛋白C1受体
- EMM2型
- 爱丁堡最小中等2
- 6小时
- 包含血凝素抗原和六个组氨酸残基的表位
- 对
- 酵母提取物和补充剂。
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