胚胎干细胞为研究哺乳动物早期发育的分子机制提供了一种工具。ES细胞的分化需要其mRNA和蛋白质组成的快速大幅度变化。miRNAs非常适合通过抑制几个靶点的翻译来完成这项任务1据预测，miRNAs可以单独或同时调节数百个基因2,三根据小鼠的表型推断出小RNA在ES细胞分化中的重要作用骰子1敲除ES细胞4至少两类小RNA的成熟需要Dicer：miRNAs和短干扰RNA（siRNAs）5-7因此，目前尚不清楚miRNAs的缺乏是否是骰子1敲除表型。双链RNA-结合蛋白DGCR8和RNase III酶Drosha形成微处理器复合体，将长的初级miRNAs（pri-miRNAs）加工成短发夹，称为前体miRNA（pre-miRNAs）8-13.产生的发夹被输出到细胞质中14,15并被Dicer加工成成熟的miRNAs1,6与Dicer的细胞质处理不同，微处理器复合体的核处理似乎是miRNAs特有的。相反，据报道，Drosha在核糖体RNA加工中起作用，可能在一种独特的蛋白质复合物中起作用16因此，DGCR8可能是miRNAs特异性加工途径的唯一成员。为了评估DGCR8在miRNA加工中的作用，并研究miRNAs在早期胚胎发育和ES细胞分化中的全局作用，我们制作了小鼠图纸8敲除ES细胞().
图纸8淘汰战略。DGCR8蛋白有一个WW结构域和两个双链RNA结合结构域（dsRBD）。WW结构域编码于图纸8基因组DNA（gDNA）；这两个dsRBD分别位于外显子7-9和10-12。从mRNA中切除外显子3会产生一个框架移位，导致下游外显子中出现几个提前终止密码子。ES细胞被连续靶向并用Cre重组酶处理以产生图纸8Δ/flox和Δ/ΔES细胞。通过用3lox结构重定位Δ/ΔES细胞，然后用Cre重组酶去除HygroTK盒，生成救援细胞。
为了证实DGCR8对miRNA的生物生成至关重要，我们使用miR-293、miR-294和miR-130特异性探针对ES细胞进行了RNA印迹分析。miR-293和miR-294来自单个基因，在ES细胞中特异表达。miR-130在ES细胞和分化组织中独立转录并广泛表达17.英寸Dgcr8型敲除细胞，这些miRNA既没有完全成熟的前miRNA产物，也没有中间的前miRNAs产物(和补充图1在线）。miR-293探针鉴定了两个大RNA转录物（~3kb）图纸8剔除样本，与pri-miR-293转录本的预期大小一致18相比之下，野生型和图纸8杂合子ES细胞。这些结果表明，DGCR8是处理部分（如果不是全部）前miRNA到前miRNA的绝对必需的。
DGCR8是ES细胞中miRNA生物生成的必需且可能是特异性的。(一)使用miR-294和miR-130特异探针对来自野生型（WT）、杂合型（Δ/flox）和两个独立敲除型（△/Δ）ES细胞的miRNAs进行RNA印迹分析。使用U6 snRNA作为负荷对照。(b条)用miR-293特异探针对ES细胞的pri-miRNA、pre-miRNA和miRNA进行RNA印迹分析。(c（c）)的表达比率图纸889个miRNAs的杂合和敲除ES细胞相对于野生型ES细胞。这些比率是通过miRNA微阵列分析计算得出的。(d日)的表达比率图纸8杂合子和图纸8针对19个代表性miRNAs敲除与野生型ES细胞相关的ES细胞。左边的miRNA是ES细胞特异性miRNA；右边的表达于ES细胞和分化组织17. (e（电子）)前rRNA的RNA印迹分析。Top，用45S前rRNA的5′ETS序列特异探针进行杂交（与45S和30S转录物结合）；由于与丰富的28S rRNA的非特异性结合，检测到30S前rRNA以下的条带。中间，用5.8S rRNA序列特异性探针杂交（与45S、32S、12S和5.8S转录物结合）。底部，使用U6 snRNA作为负载控制。
为了确定所有miRNA的成熟是否需要DGCR8，我们进行了miRNA微阵列分析。使用野生型ES细胞的RNA作为我们的参考样本，我们观察到miRNAs在图纸8敲除细胞，但在图纸8杂合细胞(和补充表1在线）。野生型和杂合细胞之间表达的相似性表明，DGCR8在ES细胞中维持miRNA的稳态水平方面没有限制。在89个显示野生型RNA显著信号的miRNA阵列探针中，有82个探针在图纸8敲除细胞。其余7个在图纸8敲除细胞，但这七种miRNA中至少有四种的信号似乎是由于在分离RNA之前用于ES细胞培养的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养细胞的RNA不可避免地受到污染。这些miRNA在MEF中的表达很高，在没有喂食器的情况下，在涂有明胶的平板上暂时传代后，ES细胞的数量减少(补充图1和数据未显示）。其余三个miRNAs在杂合细胞、敲除细胞和MEF饲养细胞中的表达相似；因此，这些信号可能是未经微处理器复合体处理的小RNA。或者，它们可能是由纯化的小RNA群体中不可避免的降解产物引起的。在这两种情况下，我们的结果表明DGCR8广泛用于miRNA处理，几乎没有冗余或旁路机制的证据。
RNase III酶Drosha是将12S前rRNA加工成5.8S rRNA所必需的酶，也可能参与32S前rRNA-12S前r RNA和18S rRNA的切割16由于DGCR8与Drosha联合形成微处理器复合体，我们考虑了DGCR8也参与协助Drosha进行rRNA处理的可能性。为了测试这种可能性，我们对45S初级、30S、32S和12S中间以及5.8S末端rRNA转录物进行了RNA印迹分析(). 我们没有发现野生型和敲除型ES细胞之间核糖体RNA处理的定性或定量差异。虽然我们不能排除DGCR8在小RNA未知加工途径中发挥作用的可能性，但我们的结果以及显示DGCR8与pri-miRNA干环精确结合的发现13表明DGCR8在miRNA加工中具有特殊作用。
图纸8敲除胚胎发育早期受阻(补充表2在线）。因此，我们将研究重点放在分析图纸8敲除ES细胞。与野生型和杂合型细胞相比，敲除的ES细胞的群体倍增时间延长，但形态正常，继续表达ES细胞特异性标记(-). 较高的群体倍增时间不能用凋亡增加来解释，因为野生型和敲除型ES细胞均未显示明显的凋亡(补充图2在线）。敲除的ES细胞聚集在细胞周期的G1期，从野生型和杂合型的约14%增加图纸8G1至22%纯合子的细胞图纸8敲除细胞(). 通过同源重组重新导入DGCR8挽救了种群加倍时间和G1表型。DGCR8-缺陷的ES细胞在G1中的积累让人想起miRNA-特异性Dicer基因丢失的结果，数据中心-1，在中黑腹果蝇生殖系19这些结果表明，DGCR8是正常ES细胞增殖和细胞周期进展所必需的。
的增殖缺陷图纸8敲除ES细胞。(一)的形态学图纸8电镀7天后，Δ/flox和Δ/ΔES细胞集落。Δ/flox菌落过度生长，边缘发生分化。(b条)平均人口倍增时间(n个= 5–6). (c（c）)MTT法测定ES细胞的平均生长率(n个= 6). (d日)细胞周期分析图纸8敲除ES细胞(n个= 3). 中的误差线b条–d日代表s.d。
在维甲酸存在下ES细胞的单层分化。(一)多能性标记的RT-PCR分析。野生型和图纸8将敲除的ES细胞作为单层细胞，在没有LIF的情况下用维甲酸（RA）处理以诱导间充质分化。Gapdh公司用作加载控件。(b条)多能性标记的定量PCR分析10月4日和纳克(n个= 3). β-肌动蛋白基因作为参考。对于每个样本，数据均归一化为第0天的mRNA水平。(c（c）)分化细胞的ES细胞集落形成。在不同的单层分化时间后，将细胞返回ES细胞培养条件，并检测其形成碱性磷酸酶阳性集落的能力。误差条指示测量范围(n个= 3). (d日)如图所示，在无MEF饲养者和有或无LIF的情况下对ES细胞分化进行克隆分析。所示为所示条件下未分化、混合和分化菌落的百分比。”D5'表示5 d；'D8'表示8d。
评估图纸8敲除ES细胞后，我们将其培养为胚状体（EBs），在不含白血病抑制因子（LIF）的情况下进行培养。在这些条件下，野生型ES细胞自发分化为囊性EB，其中包含代表早期胚胎所有三个胚层的异质混合细胞。与野生型EB不同，Dgcr8型敲除EB未形成囊肿(). 此外，RT-PCR显示各种分化标记的异常表达(和补充图3在线）。Fgf5型是原始外胚层的标志20是胚泡内细胞团的直接衍生物，可使胚胎的所有组织正常生长21,22.在野生型EB中，Fgf5型在分化的第2天高度表达(). 相比之下Fgf5型在里面图纸8敲除细胞延迟：在分化第8天达到峰值，未达到野生型水平。
EB分化和畸胎瘤形成。(一)野生型、Δ/Δ和挽救的ES细胞的EB形态。EB培养40-50天(b条)RT-PCR多能性分析(10月4日)和分化标记(Fgf5、T（短梗）、Hnf4a、Krt18)EB分化后。Gapdh被用作参考。(c（c）)所示标记的定量RT-PCRb条β-actin基因被用作参考。对于每个基因，数据均归一化为野生型EB分化第0天的mRNA水平。(d日)野生型和图纸8敲除ES细胞。Δ/Δ肿瘤中的箭头表示上皮分化区域。
为了评估EB分化的后续步骤，我们使用了内胚层标记物(Hnf4a型和Afp公司)，中胚层(T型; 亦称为短梗)，外胚层(Sox1系列)，上皮(氪18)，滋养层(脱中胚蛋白)和生殖系(Ddx4型，也称为瓦萨;和补充图3). 除了Krt18（Krt18）,脱中胚蛋白和Ddx4型，标记的表达在图纸8淘汰EB。的表达式氪18但到分化第16天时，其水平与野生型细胞相似。脱中胚蛋白在野生型和图纸8敲除细胞。Ddx4型野生型细胞EB分化时表达降低，但没有图纸8敲除细胞。EB中的所有表达缺陷都通过重新导入图纸8(补充图4在线）。
与EB一样，畸胎瘤通常由不同类型的分化细胞组成。我们通过皮下注射产生了畸胎瘤图纸8将敲除的野生型ES细胞转化为免疫缺陷小鼠。与EB分化缺陷相一致，畸胎瘤产生于图纸8敲除细胞除了一些腺样结构外，基本上没有分化(). 总之，EB和畸胎瘤分化实验显示，分化标志物的表达在图纸8淘汰人口。
为了进一步评估图纸8敲除ES细胞后，我们用维甲酸处理这些细胞，维甲酸是一种强有力的分化诱导剂。在维甲酸中培养时，野生型和图纸8敲除的ES细胞具有与间充质分化一致的形态（数据未显示）。然而，即使在维甲酸存在的情况下，多能性标志物10月4日,雷克斯1,Sox2系统和纳克并没有完全沉默图纸8敲除细胞(). 我们将经维甲酸处理的细胞恢复到ES细胞培养条件，并测量其改造ES细胞样集落的能力。菌落形成的频率大约是图纸8基因敲除细胞比野生型或图纸8杂合细胞(). 此外，所有菌落均为碱性磷酸酶阳性，具有ES细胞的典型菌落形态。为了进一步评估图纸8敲除ES细胞以关闭干细胞程序，我们进行了克隆分化试验。野生型和图纸8在有或无LIF的情况下，将敲除的ES细胞以克隆密度进行培养，无MEF。无论有无LIF，野生型菌落开始分化，通过边缘变平和碱性磷酸酶染色缺失进行评估(和补充图5在线）。无LIF时分化更完整。相比之下，图纸8敲除菌落边缘没有变平，即使没有LIF，也继续表达碱性磷酸酶。这些数据表明图纸8即使在严格的分化条件下，敲除的ES细胞也不能有效地沉默ES细胞程序。
我们的研究结果表明，DGCR8是miRNAs生物生成所必需的，而miRNA是沉默ES细胞自我更新所必需的。NuRD复合体的敲除模型中也描述了干细胞程序沉默的类似缺陷，NuRD复合物是一种具有核小体重塑和组蛋白去乙酰化活性的大型复合体23此外，据报道，G9a组蛋白甲基转移酶和Dnmt3a和Dnmt 3b DNA甲基转移酶对维甲酸处理后维持ES细胞分化至关重要24因此图纸8敲除表型使DGCR8成为一组独特的细胞分化全球调节因子。我们认为，未能在分化后沉默ES自我更新图纸8突变背景是继miRNAs丢失之后的第二个原因，miRNA通常会抑制直接或间接维持ES细胞多能性的蛋白质的翻译。
这个图纸8敲除ES细胞表型与报道的骰子1淘汰赛4.骰子1敲除ES细胞，如图纸8敲除的ES细胞分化有缺陷。不同于图纸8然而，敲除细胞，骰子1敲除细胞在EB培养过程中不表达分化标记。骰子1敲除EB在培养约8天后停止生长，而图纸8敲除细胞在16天后仍继续生长和分化（数据未显示）。此外，骰子1敲除的ES细胞似乎有一个更深刻的初始增殖缺陷，随着时间的推移，该缺陷被克服，可能是由于额外的遗传事件25相比之下，图纸8敲除的ES细胞表现出一种稳定且更微妙的增殖缺陷。这些表型差异骰子1和图纸8敲除ES细胞表明Dicer在ES细胞功能中具有miRNA-independent作用。图纸8敲除ES细胞提供了识别这些角色的方法。图纸8敲除细胞还可以通过重新引入特定的miRNAs并测试其拯救已确定的敲除表型的能力，来解剖单个miRNAs的功能。因此图纸8敲除模型应该为研究小RNA在ES细胞自我更新和增殖以及在谱系承诺过程中沉默干细胞潜能中的作用提供有力的手段。
方法
目标定位战略
图纸8敲除ES细胞是通过去除外显子3产生的，导致在靶区下游形成几个提前终止密码子(). 我们通过PCR（高保真Taq，Invitrogen）从细菌人工染色体（奥克兰儿童医院和研究中心）中生成5′和3′臂。A类液氧P（P）-Hin公司dIII碎片插入手臂之间。将位于loxP位点两侧的HygroTK选择盒插入Bgl公司外显子3下游的II位点。用3lox构建物转染V6.5 ES细胞，并在130μg/ml潮霉素（Roche）中筛选。亚克隆被挑选出来并通过DNA印迹分析。用Cre重组酶表达质粒转染产生的野生型/3lox亚克隆，并在0.4 nM更昔洛韦（Sigma）中选择。第二个等位基因Dgcr8型被第二轮瞄准移除。靶向野生型/flox ES细胞并暴露于Cre重组酶以产生图纸8Δ/Δ和Δ/flox ES细胞。在救援实验中，使用3lox结构重定位Δ/ΔES细胞以产生3lox/Δ细胞，然后取出HygroTK选择盒。
组织培养
将ES细胞培养在ES细胞培养基中的MEF饲养细胞上26在显微分析、EB和单层分化实验中，饲养细胞通过在未涂层板上差异粘附0.5–1 h，然后在涂胶板上培养2 d来去除。作为微阵列分析的替代方法，ES细胞从MEF中分离五代，以尽量减少饲养者污染。对于EB分化，用胰蛋白酶轻轻处理细胞，并在无LIF的ES细胞培养基的Petri培养皿或低附着培养皿中悬浮培养。对于畸胎瘤形成，4×106至5×106通过皮下注射将ES细胞注射到免疫缺陷小鼠中。在固定并用苏木精和伊红染色之前，允许畸胎瘤发展到直径约2 cm。为了实现单层分化，将ES细胞培养在无LIF的ES细胞培养基中的涂胶板上，并在100nM维甲酸的存在下培养。的相对数量图纸8敲除的ES细胞加倍以弥补其增殖缺陷。在不同时间点收集总RNA（Trizol、Invitrogen），并通过RT-PCR进行分析。ES细胞集落形成试验，1×10三用维甲酸处理的细胞恢复到ES细胞状态。细胞在六孔塑料板中培养5天，进行碱性磷酸酶染色（Vector Laboratories）并手动计数。
为了实现ES细胞的克隆分化，将ES细胞从MEF饲养细胞中分离出来，并在添加LIF的ES细胞培养基中以每孔100–200个细胞的速度将其接种在6孔板中。第二天，媒体被有或没有LIF补充的媒体取代。每天更换培养基。5或8天后，菌落固定在4%多聚甲醛中，并用4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）和载体红色碱性磷酸酶底物试剂盒I（载体实验室）染色。用荧光显微镜在×5倍放大下对菌落进行计数和形态学评分（未分化、混合和分化）。仅含碱性磷酸酶阳性细胞的菌落被定义为未分化。仅含碱性磷酸酶阴性细胞的菌落被定义为分化细胞。混合菌落被定义为具有阳性核心和周围阴性生长的菌落。每个时间点每种细胞类型的菌落数在50到100个之间。
RNA印迹分析
如前所述，对成熟miRNAs进行分析27为了分析pri–和pre–miR-293，在1.2%变性琼脂糖和甲醛凝胶中溶解10μg总RNA。按说明分析前rRNA16将所有印迹在70°C的1%SDS中剥离1 h，然后探测U6小核RNA（snRNA）作为负载对照。miR-293（也用于pri–和pre-miR-293）、miR-294和miR-130的探针是与各自成熟miRNAs互补的DNA寡核苷酸。请参见补充表3在线获取RNA印迹分析中使用的探针。
微阵列分析
我们从野生型中分离出10-20μ，图纸8杂合子和图纸8在15%变性聚丙烯酰胺凝胶上敲除ES细胞。切下约18–26 nt的凝胶部分，在TEN缓冲液（10 mM Tris，pH 8.0，1 mM EDTA，300 mM NaCl）中提取，并用乙醇沉淀。在聚丙烯酰胺凝胶电泳分离之前，用放射性标记的微量无关的18-nt小RNA32将5′端的P添加到每个总RNA样品中，以监测凝胶提取的效率。凝胶提取后，向每个样品中添加等量的阳性对照RNA（Ambion）。随后，小RNA被聚腺苷酸化，使用NCode miRNA标记系统（Invitrogen）与捕获序列连接，并与Ambion哺乳动物miRNA探针集发现的微阵列杂交（怀特黑德研究所微阵列技术中心）。在GenePix 4000B扫描仪（Axon Instruments）上扫描微阵列，并使用GenePix Pro 4.1版进行分析。在所有分析中，使用来自野生型ES细胞的小RNA作为参考。阳性对照RNA的比率用于归一化。对MEF进行了两次微阵列分析，对图纸8杂合敲除ES细胞，两次为两个独立的图纸8-ES细胞株为空。两个独立细胞系的反向染色实验的相关系数分别为0.99和0.97。中显示的比率是所有实验的平均值(补充表1).
逆转录聚合酶链反应
我们用DNase（Promega）处理5μg总RNA以去除基因组DNA。用SuperScriptIII第一链cDNA合成RT-PCR试剂盒（Invitrogen）从2μg处理过的RNA合成cDNA10月4日，Rex1，Gapdh，T（brachyury）和Krt18（Krt18）是礼物（见致谢）。的引物Hnf4a型和Fgf5型已被描述23,27在7300实时PCR系统（应用生物系统）上进行定量PCR。对于每个细胞样本，PCR是一式三份的，以尽量减少变异。β-肌动蛋白mRNA作为内源性对照。底漆采用Primer Express 3.0（Applied Biosystems）设计。请参见补充表3用于定量实时PCR的引物。
细胞增殖测定和细胞周期分析
为了确定细胞群体倍增时间，0.5×106将ES细胞置于60-mm塑料皿上，2-3d后计数。细胞群倍增时间按以下公式计算Y（Y）结束=Y（Y）开始× 2(吨/T型)，其中T型是细胞数量加倍的时间，Y（Y）开始是电镀胚胎干细胞的起始数量，以及Y（Y）结束是生长一段时间后ES细胞的终止数量，吨每个细胞系至少计数五次。对于MTT分析，细胞以每孔4000个细胞的速度在96 well板上进行电镀，并在电镀后20、40、60和90 h进行分析。在指定的时间点，将ES细胞培养基替换为DMEM中100μl 1 mg/ml 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2.5-二苯基四唑溴化铵（MTT）（分子探针）。在37°C下培养3 h后，去除MTT溶液，并添加100μl二甲基亚砜以溶解沉淀物。使用Spectramax M2微孔板阅读器（分子器件）在540 nm处记录吸光度。对于细胞周期分析，将细胞固定在乙醇中，用碘丙啶标记，并通过流式细胞术进行分析。为了进行细胞凋亡分析，用碘伏和FITC-Annexin V（BioVision）标记细胞，并通过流式细胞仪进行分析。计算丙碘阴性细胞和Annexin V阳性细胞在总人口中的百分比，以追踪细胞凋亡的早期阶段。
