葡萄糖剥夺抑制CD8中多个关键基因表达事件和效应器功能⁺T细胞

效应细胞因子的产生依赖于葡萄糖

作为我们基因阵列数据的验证性分析，对细胞因子基因的子集进行了实时RT-PCR分析。与基因表达谱一致，实时RT-PCR检测到的2-DG阻断了编码IFN-γ和GM-CSF的转录物的诱导(图2B和2D). 同样，在抑制葡萄糖代谢时，IFN-γ和GM-CSF蛋白的分泌几乎完全被阻断(图2A和2C). 相反，正如我们之前报道的那样[1]，IL-2的产生相对抵抗2-DG的抑制，TNF-α的分泌也被2-DG阻断（数据未显示）。这些数据表明，关键效应细胞因子的产生非常依赖葡萄糖。

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图2

效应细胞因子的产生、增殖和细胞溶解活性依赖于葡萄糖

A.CD8产生IFN-γ⁺用ELISA检测抗CD3和抗CD28刺激后的效应T细胞。刺激24小时后收集上清液。数据表示三个独立实验的平均值+SD，2-DG效应具有统计学意义（p<0.01）。B.用50 mM 2-DG处理12小时的细胞中IFN-γmRNA的定量RT-PCR。C.CD8的GM-CSF生产⁺用抗CD3和抗CD28单克隆抗体包被珠刺激后的效应T细胞用ELISA检测。刺激24小时后收集上清液。数据表示三个独立实验的平均值+SD，2-DG对所有浓度的抑制均具有统计学意义（p<0.001）。D.用50 mM 2-DG处理12小时的细胞中GM-CSF mRNA的定量RT-PCR。数据代表至少两个独立实验。E.CD8产生IFN-γ⁺用ELISA法检测OVA肽体内激发的T细胞。用OVA肽体外再刺激20小时后收集上清液。对于所有测试浓度，2-DG对IFN-γ的影响具有统计学意义（p<0.001）。F.CD8产生IFN-γ⁺用ELISA法检测OVA肽体内激发的T细胞。用抗CD3和抗CD28单克隆抗体涂层珠刺激20小时后收集上清液。对于所有测试浓度，2-DG对IFN-γ的影响具有统计学意义（p<0.001）。E和F的数据表示两个独立实验的平均+SD。

为了证实葡萄糖代谢对体内激发的T细胞效应功能的重要性，用完全弗氏佐剂中的卵清蛋白免疫小鼠。整夜回收并激活淋巴结中的T细胞，在有无2-DG的情况下用卵清蛋白刺激，并测试IFN-γ分泌。与体外激发的2C细胞一样，2-DG强烈抑制体内激发的多克隆T细胞分泌IFN-γ(图2E). 为了确定当培养物中唯一受2-DG影响的细胞是T细胞时，是否会观察到同样的效果，也在没有APC的情况下进行刺激，而是使用抗CD3/抗CD28单克隆抗体涂层珠。在这些条件下，2-DG同样抑制了IFN-γ的生成(图2F).

CD8的细胞溶解活性⁺效应T细胞依赖葡萄糖

我们的基因阵列数据表明，2-DG刺激的效应细胞中穿孔素和颗粒酶C mRNA的表达降低，这表明细胞溶解也可能是葡萄糖依赖性的。实时RT-PCR证实了2-DG对这些转录物的减少(图3A). 为了检测细胞溶解的葡萄糖依赖性，启动2C/RAG2^-/-CD8（CD8）⁺T细胞被用作效应器，识别L^d日以P815靶点表示。添加50 mM 2-DG几乎完全消除了CD8的能力⁺效应T细胞在4小时内裂解靶细胞⁵¹铬释放测定(图3B). 我们之前表明，2-DG在20小时内不会增加凋亡导致的T细胞死亡[1]他认为，这种细胞溶解活性的降低不能用T细胞活性的降低来解释。

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图3

2-DG阻断CD8的细胞溶解活性⁺效应T细胞

A.通过定量RT-PCR评估50mM 2-DG对穿孔素和颗粒酶C mRNA水平诱导的影响。数据表示两次独立分析的平均值。B.CD8的细胞溶解活性⁺效应T细胞在4小时内测定⁵¹在存在或不存在50 mM 2-DG的情况下进行Cr释放试验。数据表示五个独立实验的平均值。2-DG对各E:T比值的抑制具有统计学意义（P<0.01）。C.在存在或不存在50mM 2-DG的情况下，评估2C和P815-B7.1靶点之间的共轭形成。将钙调素AM标记的T细胞（绿色）与PKH标记的P815-B7.1细胞（红色）结合指定的时间段。使用流式细胞术来确定缀合物在细胞总数中的百分比。数据表示三个合并实验的平均值+SD。D.在存在或不存在50mM 2-DG的情况下，通过微管蛋白染色（红色）测量T细胞/靶细胞缀合物中的MTOC重新定向。所示数据是分析的至少20个共轭物的代表性图像。E.T细胞/靶细胞结合物中cSMAC的形成。使用PKCθ（绿色）和talin（红色）抗体。靶细胞用CMAC（蓝色）染色。图像代表了至少20个分析的共轭物。

虽然我们观察到在2-DG刺激12小时的细胞中穿孔素和多颗粒酶亚型的基因表达减少，但我们推断，基因表达减少不能完全解释4小时细胞溶解试验中的显著减少。差异化CD8⁺效应T细胞已经在溶酶体样隔室中表达成熟的细胞毒性颗粒[4]. 一旦靶效应细胞参与，这些裂解颗粒迅速向靶细胞极化，然后分泌到细胞间的膜间隙。因此，我们检查了裂解过程的其他特征，以检查其葡萄糖依赖性。CD8结合物形成的建立⁺效应T细胞和靶细胞是一个复杂的粘附过程，可能需要强有力的ATP生成。因此，我们在存在或不存在2-DG的情况下，使用基于流式细胞术的分析检测共轭物的形成。如所示图3C，效应细胞在最早的可检测时间点形成易于检测的结合物。事实上，2-DG的存在使结合效率降低了约50%，认为CTL对靶细胞的粘附是葡萄糖依赖性的。

溶解过程中的另一个步骤是细胞溶解机制向目标细胞的极化。这种细胞极化通过微管组织中心（MTOC）的运动反映出来。使用共焦显微镜，我们测试了CD8⁺在2-DG存在下成功形成共轭物的效应器可以重组MTOC。如所示图3D，2-DG不抑制MTOC重取向，这在绝大多数共轭物中仍然存在。为了与细胞的正常极化过程保持一致，我们还检查了在有或无2-DG的情况下免疫突触特征的建立。免疫突触的特征是talin沿T细胞/靶细胞界面积聚。此外，许多系统中的成熟突触包括talin的中央清除和PKC-θ等信号分子在中央超分子激活簇（cSMAC）中的分配[5]. 因此，我们使用荧光显微镜来确定在2-DG存在下，是否可以在T细胞中形成成熟的免疫突触，该突触成功地与靶细胞形成结合。事实上，很容易检测到talin向界面的募集，以及PKCθ向cSMAC的聚焦(图3E). 这些结果与葡萄糖剥夺不抑制早期TCR介导的信号事件这一事实相一致[1]. 总之，这些数据表明，2-DG通过阻止结合物的形成和抑制新颗粒蛋白的诱导来抑制细胞溶解活性。

T细胞增殖依赖葡萄糖

我们的基因阵列实验结果还表明，诱导细胞周期蛋白D2 mRNA需要葡萄糖的利用，这表明细胞周期的进展可能是葡萄糖依赖性的。实时RT-PCR证实，50 mM 2-DG刺激的效应细胞中诱导的细胞周期蛋白D2较少(图4A). 因此，我们分析了效应细胞[^三H] 在2-DG浓度增加的情况下，用丝裂霉素C处理的P815-B7.1细胞刺激48小时后胸腺嘧啶掺入。我们观察到2-DG对[^三H] 胸腺嘧啶掺入(图4B). 为了检查直接阻断胸腺嘧啶掺入反应在细胞分裂水平，检测CFSE稀释度。底漆2C/RAG2^-/-CD8（CD8）⁺效应T细胞用CFSE标记并用P815-B7.1细胞刺激48小时。如所示图4C在2-DG存在下，正常活跃的细胞分裂被完全消除。为了确定2-DG阻断了细胞周期的哪个阶段，我们通过PI染色（Nicoletti分析）检查了受刺激效应细胞的DNA含量[6]. 如所示图4D，在对照条件下刺激的细胞显示出2n和4n的DNA峰。相比之下，我们在用10 mM 2-DG刺激的细胞中观察到一个显著的2n峰，表明细胞在细胞周期的G1至S期停滞。这些数据与细胞周期蛋白D2的mRNA表达降低相关，后者专门调节G1到S的进展。

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图4

2-DG抑制刺激CD8的细胞周期进展⁺效应T细胞

A.在存在或不存在2-DG的情况下，定量RT-PCR检测经抗CD3和抗CD28单克隆抗体包衣的细胞中cyclin D2 mRNA水平。数据表示两个独立实验的平均值。B[^三H] 在存在或不存在2-DG的情况下，用抗CD3/抗CD28单克隆抗体包被珠刺激的细胞中评估胸腺嘧啶掺入。数据表示三个独立实验的平均+SD，2-DG的抑制具有统计学意义（p<0.001）。C.CFSE标记的2C CD8⁺在存在或不存在10 mM 2-DG的情况下，用P815-B7.1细胞刺激效应T细胞。48小时后，用流式细胞仪分析CFSE的稀释度。D.用或不用10mM 2-DG刺激48小时的效应T细胞的DNA含量进行评估。

关键基因产物抑制的Western blot证实

一些关键转录物的2-DG抑制程度似乎不如功能分析中的抑制程度深。我们推断，一个潜在的解释可能是在蛋白质水平上显示出更大的抑制，因为这反映了转录和翻译随时间的整体整合。为此，对所选择的蛋白质进行了蛋白质印迹分析。如所示图52-DG几乎完全阻断了全细胞裂解液中检测到的IFN-γ蛋白的诱导。同样，细胞周期蛋白D2和Granzyme B蛋白的上调表达几乎完全被抑制。总ERK被用作内部控制，正如我们之前发现的那样，这种信号通路不受葡萄糖剥夺的影响[1]. 因此，2-DG对参与T细胞功能的选定关键蛋白的产生具有深远的抑制作用。

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图5

选定蛋白质的蛋白质印迹分析

2C/RAG2型^-/-效应器CD8⁺在存在或不存在2-DG的情况下，用抗CD3/抗CD28单克隆抗体涂层珠刺激T细胞16小时。收集细胞，裂解，用SDS-PAGE分离，并用印迹法检测所示蛋白。箭头指示背景带上方的Granzyme B带。在两个独立的实验中也看到了类似的结果。

所选CD8⁺缺氧对效应器功能的影响最小

除了葡萄糖外，氧气也是生成ATP的重要资源。因此，我们评估了CD8的细胞因子产生和细胞溶解活性的依赖性⁺氧的效应T细胞。为此，CD8⁺效应细胞在1%O下受到刺激₂（缺氧）条件。底漆2C/RAG2^-/-与21%O刺激的细胞相比，在缺氧环境中刺激的T细胞仍能产生相当水平的IL-2₂（控制）条件(图6A). 与2-DG的完全抑制相比(图2A)，在缺氧条件下仍能检测到IFN-γ的产生(图6B). 此外，与对照条件相比，低氧条件下的细胞溶解活性即使没有更好，也相当(图6C).

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图6

选择性效应器功能受缺氧影响最小

A.和B.通过ELISA评估缺氧条件下IL-2（A）或IFN-γ（B）的产生。用抗CD3和抗CD28单克隆抗体涂层珠刺激24小时后收集上清液。数据表示至少三个独立实验的平均+SD。C.CD8的细胞溶解活性⁺效应T细胞在缺氧或常氧条件下进行测量。P815细胞被用作特定靶点。控制，21%O₂; 缺氧，1%O₂数据表示两个独立实验的平均值。D.和E.在细胞色素b-c1抑制剂0.8μM粘噻唑（myxo）或50 mM 2-DG存在下，用抗CD3和抗CD28单克隆抗体涂层珠刺激IL-2（D）和IFN-γ（E）的产生，通过ELISA进行评估。刺激24小时后收集上清液。数据表示至少五个独立实验的平均值+SD。F.CD8的细胞溶解活性⁺效应T细胞在2-DG或粘噻唑存在或不存在的情况下进行。数据表示两个独立实验的平均值。与其他研究一样，2-DG对IFN-γ生成和细胞溶解的抑制具有统计学意义（p<0.05），而与粘噻唑或缺氧相比，差异不显著。

实验中使用的1%氧气张力尽可能低。然而，由于1%的氧气足以允许某些氧化磷酸化，我们采用了另一种方法，通过使用线粒体细胞色素b-c1复合物抑制剂粘噻唑来阻断有氧呼吸，从而模拟缺氧，从而阻断氧依赖性代谢。我们观察到0.8 mM粘液噻唑的浓度足以阻止吸氧（数据未显示）。有趣的是，正如我们在缺氧条件下观察到的那样，黏液噻唑对IL-2的产生几乎没有影响(图6D)，IFN-γ产生(图6E)或细胞溶解(图6F). 这些数据支持CD8的概念⁺效应器的功能可以在极低的氧气张力下保持，因为氧气是CD8的最低能量来源⁺与葡萄糖相比，效应T细胞。

细胞

效应2C TCR转基因CD8的产生⁺T细胞已被描述[28]. 简单地说，从2C/RAG2的脾脏中纯化出原始2C细胞^-/-使用小鼠CD8茎叶浓缩鸡尾酒的小鼠⁺T细胞（干细胞技术，温哥华，不列颠哥伦比亚省，加拿大）。为了产生效应细胞，用丝裂霉素C处理过的P815-B7.1细胞对原始细胞进行4天的贴壁。在刺激的第四天，收集细胞，进行Ficoll-Hypaque离心，然后再重复4天以产生第8天的效应细胞。第8天的细胞通常被证明分泌高水平的IFN-γ并裂解抗原表达的靶细胞（数据未显示）。

用完全弗氏佐剂乳化的鸡卵清蛋白（1 mg/ml）免疫C57BL/6J小鼠后足垫，产生体内激发的T细胞。从淋巴结中回收并纯化T细胞，用卵清蛋白或抗CD3/抗CD28单克隆抗体涂层珠培养过夜，并测试IFN-γ分泌。

基因阵列分析

根据制造商的说明，使用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）分离总RNA，然后使用DNase I（Invit罗gen）和RNeasy迷你柱纯化（Qiagen，Chatsworth，CA）进行处理。使用安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技，加利福尼亚州帕洛阿尔托）评估RNA的完整性。使用GeneSpec III（Miraibio）测定纯度/浓度。所有用于杂交的RNA样品的OD260/280和OD260/230比值>1.8，总RNA浓度>1μg/ml。

所有基因阵列杂交均在芝加哥大学功能基因组学设施进行。根据Affymetrix基因芯片表达分析手册（Affymetix，加州圣克拉拉）制备靶点。简单地说，使用10μg总RNA通过上标选择系统（Invitrogen）合成双链cDNA。第一链cDNA合成用T7-（dT24）寡核苷酸引物。使用BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit（Enzo Diagnostics，Farmingdale，NY）从长期凝胶纯化的cDNA合成生物素标记的反义cRNA。用4 M LiCl沉淀后，20μg cRNA在片段缓冲液（40 mM Tris-Acetate，pH 8.1，100 mM KOAc，30 mM MgOAc）中在94°C下片段化35分钟。片段化cRNA（12μg）在45°C和60 rpm的Affymetrix杂交炉640中与阵列杂交16小时。在Affymetrix Fluidics Station 450中，使用Affymmetrix GeneChip协议对阵列进行清洗和链霉亲和素-PE染色，并使用Affmetrix基因芯片扫描仪3000进行扫描。

使用GCOS（Affymetrix）对阵列图像进行采集和初始量化。后续数据分析涉及：i）通过dCHIP软件对数组值进行归一化[29]，ii）每个实验两个独立样本的平均值，iii）使用Microsoft Excel电子表格中的标准化值确定相对表达式。

⁵¹铬释放试验

评估细胞溶解活性，2×10^{3 51}铬标记靶板镀有2×10⁵初始或效应CD8⁺96周V型底板中的T细胞（ICN Biomedicals，Costa Mesa，CA）。在37°C下培养4小时后，将50μl上清液转移到LumaPlate-96（PerkinElmer Life Sciences）中，并让其过夜干燥。然后使用TopCount-NXT（PerkinElmer Life Sciences）对平板进行计数。

增殖试验

对于[^三H] 胸腺嘧啶掺入试验，5×10⁴纯化CD8⁺用5×10刺激T细胞⁴丝裂霉素C处理的P815.B7–1细胞，置于96周的微量滴定板中。在电镀后的不同时间，1μCi的[甲基-^三H] 向细胞中添加胸腺嘧啶核苷（Amersham Biosciences）。经过6小时的脉冲后，盘子被冷冻直到收获。使用Packard Filtermate Harvester和TopCount-NXT（PerkinElmer Life Sciences）采集微孔，以测定[3H]胸苷掺入量。

对于CFSE标记，CD8⁺效应T细胞在冰上用5 nM CFSE标记2分钟。然后用15 ml FBS淬灭细胞，用10%FBS/DMEM再冲洗两次，然后用P815-B7.1细胞作为APC刺激细胞。

对于Nicoletti分析，5×10⁵在所示条件下，在96 well板中刺激细胞并培养过夜（～20小时）。然后将细胞转移到新鲜的1.5 ml试管中，以2000 rpm造粒5分钟，并在100μl Nicoletti缓冲液（0.1%柠檬酸钠/0.1%Triton X-100/50μg/ml PI）中再次悬浮至少4小时。用流式细胞仪检测DNA含量。

细胞因子ELISA

为了评估细胞因子的产生，10⁵纯化的第8天效应器2C CD8⁺用5×10刺激T细胞⁵涂有抗CD3（2C11；1μg/ml）和抗CD28（PV-1；1μg/ml）抗体的聚苯乙烯珠（Dynal Biotech Inc.，Lake Success，NY），置于96个平底板中，37°C下约20小时。刺激20小时后收集上清液，并通过ELISA分析细胞因子的产生（IL-2或IFN-γ，BD Biosciences Pharmingen抗体对；GM-CSF，OptEIA for GM-CSF；BD Biosciences Sparmingen）。

蛋白质印迹分析

如图所示刺激T细胞，并按所述制备细胞裂解物[30]. 蛋白质在10%SDS-PAGE凝胶上溶解，转移到PVDF膜上，并使用公布的技术进行印迹[30]. 使用的抗体包括：抗Granzyme B（加利福尼亚州圣地亚哥eBiosciences）、抗Cyclin D2（马萨诸塞州沃本MBL International）、抗IFN-γ（加利福尼亚州圣何塞BD Bioscinces）和抗ERK（加利福尼亚州卡尔斯巴德Zymed Laboratories）。对于Granzyme B和IFN-γ分析，在细胞裂解前2小时添加GolgiPlug（BD Biosciences），以减少分泌。

定量RT-PCR

反应在50μl体积中进行，并在96 well光学板中进行。ABI 7700热循环器（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）用于扩增。使用从Applied Biosystems购买的特定引物/探针对每个基因进行评估，并用FAM染料进行标记。特定基因的ΔCT与β-肌动蛋白的ΔCT进行标准化。使用SDS软件（Applied Biosystems）分析数据。

缺氧实验

含10%FBS的完整DMEM在缺氧（1%O₂/5%一氧化碳_2;37°C）条件下过夜。在环境（21%O）下制备细胞和试剂₂/5%一氧化碳₂; 37°C）条件下。最后，实验在缺氧室内进行。在缺氧（1%O）条件下进行的实验₂/5%一氧化碳₂; 37°C）的条件下，在37°C的密封增湿缺氧室中进行（Coy Laboratory Products，Grass Lake，MI）。O的气体压力₂和CO₂由质量流量控制器进行维护。在环境培养箱条件下进行平行对照。

氧气消耗量

30×10的耗氧率⁶幼稚和效应2C CD8⁺使用Warburg室和极谱O在室温下的环境空气中测量T细胞₂电极。使用Pegasus软件（伊利诺伊州芝加哥Lakeshore Technologies）获取并分析数据。实验期间，鱼藤酮、N，N′，N′-四甲基对苯二胺（TMPD）和抗坏血酸（均来自密苏里州圣路易斯市西格玛）直接添加到Warburg室中。

ATP水平的测量

根据制造商的说明，使用ATP生物发光试剂盒HS II（Roche）测定稳态ATP水平。10⁶效应器CD8⁺用5×10培养T细胞⁶无涂层或5×10⁶在所示条件下，将抗CD3和抗CD28抗体涂层珠（总体积为0.5 ml）放置在1.5 ml带有戳孔的微量离心管中，以便进行气体交换。在3小时刺激后，用冰镇PBS清洗细胞一次，并将其重新悬浮在0.2 ml细胞裂解缓冲液中（包括在试剂盒中）。用稀释缓冲液（包括在试剂盒中）将裂解液进一步稀释成两个1:10的系列稀释液，最终体积为0.2 ml。向裂解液中添加等量的细胞裂解缓冲液。然后使用单光光度计（BD Pharmingen）读取三份含有0.1 ml裂解物和0.1 ml荧光素酶底物的样品，并取平均值。因此，代表了3333个细胞的ATP浓度。

共轭形成

该分析的执行与前面描述的类似[31]. 简言之，T细胞用钙黄绿素AM（Molecular Probes，Eugene，OR）标记，EL4细胞或P815细胞用PKH标记（Sigma，Saint Louis，MO）。T细胞（2.5×10⁵)和目标（5×10⁵)混合、离心、轻轻旋涡，并在37°C下培养指定时间。然后将细胞剧烈旋转30秒并立即固定。进行双色流式细胞术分析，通过计算双阳性结合物与T细胞总数的比率来确定结合物的百分比。

免疫荧光显微镜

为了区分APC和T细胞，如前所述，将活性染料CMAC细胞追踪蓝（分子探针）装入APC[31]. APC（1.5×10⁵)与等量的Ficoll-Hypaque纯化T细胞在含有10%FBS的DMEM中混合，在5000 rpm下离心30秒，并在37°C下培养指定时间（-2分钟）。吸取上清液，然后用1000-μl移液管将结合物轻轻地重新悬浮在无血清DMEM中，并在固定前将其镀在聚赖氨酸（分子量30000-70000，Sigma）涂层载玻片上2分钟。将载玻片固定在PBS中3%（w/v）多聚甲醛中15分钟。样品在0.3%（v/v）Triton X-100（Sigma）的PBS中渗透10分钟，然后在PBS中冲洗并在含有10%FBS的DMEM中封闭5分钟。所有随后的抗体孵育均在含有2%FBS的无钙/无镁DPBS中进行。在室温下连续应用一级和二级抗体60分钟，并在每次孵育后用DPBS清洗五次。荧光标记后，将样本安装在Mowiol 4-88（Hoechst Celanese，Charlotte，NC），加入10%的1,4-重氮双环[2.2.2]辛烷（Sigma）作为防褪色剂。使用蔡司Axiover100显微镜对样品进行分析。使用SlideBook软件（科罗拉多州丹佛市Intelligent Imaging Innovations）进行图像捕获和反褶积分析（如适用）。

我们非常感谢Janel Washington对小鼠专家的帮助，Helena Harlin对基因阵列数据分析的帮助，Matthew Mack、Robert Guzy和Paul Schumaker对缺氧/氧气实验和建议的宝贵帮助，以及Maria-Luisa Alegre、Kenneth Frauworth和Jeffrey Rathmell的有益讨论。我们还感谢芝加哥大学功能基因组学设施的李新民进行基因阵列分析。

这项工作得到了NIH的RO1 AI47919的支持。