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临床投资杂志。2000年4月15日；105(8): 1085–1093.
数字对象标识：10.1172/JCI8641
预防性维修识别码：项目经理300831
PMID：10772653

成纤维细胞生长因子-2基因的破坏导致骨量和骨形成减少

阿尔德马尔·蒙特罗,1 冈田洋介,1 丰田正人,1 伊藤雅子,2 筑谷浩史,三 中村俊中,三 托马斯·多奇曼,4 J.道格拉斯·科芬,5和马尔贾·M·赫尔利1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）是软骨和骨生长和分化的重要调节因子，在成骨细胞中表达和调节。为了研究FGF-2在骨中的作用，我们检测了破坏骨组织中FGF-2的小鼠Fgf2型基因。股骨干骺端骨小梁结构的测量Fgf2型+/+和Fgf2型–/–通过micro-CT对成年小鼠进行的研究表明，血小板样小梁结构显著减少，小梁骨的许多连接杆在Fgf2型–/–老鼠。动态组织形态计量学证实小梁骨体积、矿物质并置和骨形成率显著降低。此外，来自Fgf2型–/–老鼠。这项研究提供了强有力的证据，证明FGF-2有助于确定骨量和骨形成。

介绍

碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）在体外影响多种细胞类型的增殖和分化(1–5). 它储存在细胞外基质（ECM）中(三,6,7)并在成骨细胞中表达(7). FGF-2已被证明是软骨和骨细胞功能的重要调节剂(2,8–10). 以前，我们报道过FGF-2在转基因小鼠中的过度表达导致软骨发育不全和长骨缩短(11). 成纤维细胞生长因子受体（FGFRs）也是骨生长和发育的重要调节因子，在骨和软骨中有差异表达(2,12,13). 许多人类畸形综合征在基因上与不同FGFRs的突变有关(2,14,15). 小鼠FGFR3基因的破坏导致软骨内骨生长增加(16,17)，而FGFR2的突变增加了颅骨成骨细胞中成骨细胞分化标志物的表达(18). FGFR2对肢芽的形成至关重要，FGFR1的缺失导致小鼠肢芽的远端截断(19).

在骨细胞培养中，FGF-2刺激复制(20)以及碱性磷酸酶和1型胶原等分化标记物减少(21–24). 与持续治疗相比，间歇性FGF-2治疗刺激了体外骨形成(23)和体内(2,25). 对大鼠的体内研究一致表明，FGF-2刺激了骨内和骨小梁表面的新骨形成，但对骨膜表面没有刺激作用(25–27). 一些研究小组报告了FGF-2对去卵巢大鼠（OVX）骨量恢复的合成代谢作用(28–30)这是一个公认的绝经后骨质流失模型。FGF-2不仅刺激了原有骨表面的骨形成，而且还诱导骨髓腔内骨针的从头形成，导致骨质减少OVX大鼠松质骨质量的部分恢复(30). FGF-2治疗增加骨髓腔内松质骨(25,30)表明骨髓腔内的成骨细胞前体是FGF-2作用的靶细胞。这一观察很重要，因为骨髓中含有合成FGF-2的成骨细胞前体/基质细胞(31)并以自分泌/旁分泌方式对FGF-2作出反应(32–35). FGF在大鼠骨折修复中也发挥重要作用(36)在人类中(37). 这个Fgf2型基因在骨折修复的早期阶段在骨折部位肉芽组织中表达(38). FGF-2也是破骨细胞形成和骨吸收的有力刺激物(5,39,40). 因此，FGF-2应被视为破骨细胞-成骨细胞相互作用或耦合的重要调节因子。

成骨细胞中表达FGF-2(20,41–43)骨细胞和骨膜细胞(42).Fgf2型转化生长因子β可提高成骨细胞的信使核糖核酸和蛋白质水平(41)，前列腺素(42)和甲状旁腺激素(43). 因此，激素和局部因子调节FGF-2的生成，它们在骨内稳态中具有重要作用。

这些数据表明，FGF信号在骨发育中起着重要作用。因为除FGF-2外，至少还有17种FGF，其中许多具有多受体特异性(44–50)，重要的是确定哪些配体在骨骼发育中发挥特定作用。最近，Fgf2型–/–小鼠是在黑瑞士×129 Sv遗传背景下培育的(51). 这些老鼠是可以存活和繁殖的。Fgf2型–/–小鼠血管平滑肌收缩力降低，血压降低，血小板增多。他们对IL-3的反应也减弱。一种刺激造血多系增殖和分化的细胞因子(52).Fgf2型–/–小鼠被证明伤口愈合延迟(53)以及神经元缺陷和大脑皮层发育受损(53,54).

因为FGF-2对成骨细胞的复制和分化有深远的影响，我们检测了缺失Fgf2型该基因对骨形成有影响。这项研究提供了强有力的证据，证明FGF-2是骨量的重要决定因素，也是骨形成的调节器。

方法

小鼠在康涅狄格大学健康中心实验动物护理中心的转基因设施中繁殖和饲养。一氧化碳处死小鼠2麻醉和颈椎脱位。动物实验方案由康涅狄格大学健康中心动物护理委员会批准。

细胞复制。

成骨细胞群由2-5个细胞组成，它们是前成骨细胞、成骨细胞和骨细胞的混合物，从8周龄的颅骨中制备而成Fgf2型+/+和Fgf2型–/–小鼠用0.1%胶原酶（美国印第安纳州印第安纳波利斯Boehringer Mannhiem生化公司）连续消化，然后在含有10%热灭活FCS（美国犹他州洛根Hyclone Laboratories）的DMEM中100 mm盘子中，在5%CO中放置12天237°C培养箱。细胞以5000个细胞/cm的密度进行移植2持续7天，每3天更换一次媒体。对于标签研究[三H] 在培养的最后4小时内添加胸腺嘧啶核苷（10μCi/孔）以测量细胞增殖(20).

骨髓基质培养。

如前所述分离细胞(55). 简言之，6个月大的胫骨和股骨Fgf2型+/+和Fgf2型–/–小鼠被解剖，没有粘附组织。取下末端，用α-MEM冲洗骨髓腔（美国纽约州格兰德岛GIBCO-BRL）。细胞在2×10的条件下培养6除非另有说明，否则在含有10%FCS的αMEM中的6个多孔板中的电池/孔；每3天用新鲜分化培养基（αMEM、10 nM地塞米松、10%FCS、8 mMβ-甘油磷酸、50μg/mL抗坏血酸）培养细胞。使用商用试剂盒（美国密苏里州圣路易斯市西格玛化学公司）固定细胞并对其进行碱性磷酸酶染色。菌落数量和面积由NIH Image（版本1.61；美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）确定。然后用von Kossa试剂重新对一些盘子进行测定矿化度。

信使核糖核酸水平的测量。

成骨细胞取自8周龄的颅骨Fgf2型+/+和Fgf2型–/–这里已经描述过的老鼠。以5000个细胞/厘米的速度对第二次传递细胞进行电镀2在具有FCS的DMEM中（10%）；抗坏血酸（50μg/mL）和β-甘油磷酸（8 mM）7–21天。通过Chomczynski和Sacchi方法从细胞中提取总RNA(56). 对于Northern分析，20μg总RNA在0.8%琼脂糖/1.1 M甲醛凝胶上变性和分馏，通过毛细管印迹或正压转移到过滤器，并通过紫外线照射固定在过滤器上（Stratalinker；Stratagene，La Jolla，California，USA）(57). 经过4小时的预混合后，过滤器与[32P] -标记的小鼠cDNA探针Fgf1型或Fgf2型(58).

骨组织形态计量学。

Fgf2型–/–小鼠表现正常，与Fgf2型+/+老鼠。Fgf2型+/+和Fgf2型–/–在4.5个月龄或8个月龄的小鼠称重，并在第1天注射钙黄绿素0.6mg/100g体重；第5天进行第二次注射；第8天处死小鼠。右胫骨近端用10%缓冲福尔马林固定，然后用100%乙醇固定，然后嵌入甲基丙烯酸甲酯（MMA）中，使用Reichert切片机（德国海德堡Reichert-Jung）获得近端胫骨的五微米厚的额叶中段。左胫骨近端用4%多聚甲醛固定，并嵌入MMA、甲基丙烯酸羟乙二醇酯和丙烯酸2-羟乙基酯的混合物中。聚合在4°C下进行。然后，对未钙化的5μm切片进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色(59).

使用与光学显微镜相连的半自动图像分析系统进行组织形态计量学（Cosmozona 1S；日本东京尼康）。分析继发性海绵状细胞的面积，不包括生长板-骺端交界处0.5 mm以内的区域(60). 分析生长板干骺端连接处远端4.5mm的胫骨干骺端松质骨区域。测量小梁骨体积密度（BV/TV，%），小梁厚度（Tb.Th，μm）和小梁数（Tb.N，mm）–1)采用Parfitt等人的平行板法进行计算(61). Tb。N被定义为应用于样本的测试线总长度中骨和非骨成分之间的交点数(62). 测定破骨细胞表面（Oc.S/BS，%）和破骨细胞数（Oc.N/BS，mm）。10月。N/BS，mm为TRAP阳性细胞，在小梁表面形成吸收陷窝，含有1个以上被鉴定为破骨细胞的细胞核。对于动态组织形态计量学，矿化表面（DLS/BS，%）、矿物附着率（MAR，μm/d）和骨形成率（BFR/BS，μm三/微米2每天）。

股骨远端干骺端小梁骨的显微CT扫描Fgf2型+/+和Fgf2型–/–老鼠。如前所述，通过微型CT系统（μCT-20；Scanco Medical，瑞士苏黎世）分析远端干骺端的股骨松质骨(63). 使用扫描切片的二维数据，进行三维分析以计算形态计量学指标，包括骨体积密度（骨体积[BV]/组织体积[TV]）、小梁厚度（Tb.Th=2×BV/骨表面[BS]）、骨小梁数量[Tb.N=（BV/TV）/Tb.Th]和小梁分离[Tb.Sp=（1/Tb.N）–Tb.Th]。这些参数是通过Parfitt等人的平行板模型计算得出的(61). Tb。N被定义为应用于样本的测试线总长度中骨和非骨成分之间的交点数(62).

统计分析。

当方差分析显示平均值之间存在显著差异时，通过方差分析和Tukey-Kramer多重比较检验评估平均值之间的统计显著性。

结果

FGF mRNA在Fgf2颅骨成骨细胞中的表达+/+和Fgf2–/–.

确认中断Fgf2型从两种基因型的颅骨成骨细胞中提取总RNA。图中的上部面板​图11（通道1、3、5和7）显示6-kb的表达Fgf2型成骨细胞mRNA转录Fgf2型+/+老鼠。没有检测到Fgf2型成骨细胞的mRNA转录Fgf2型–/–鼠标（图​（图1，1，泳道2、4、6和8）。因为酸性FGF（FGF-1）对骨骼的影响与FGF-2相似(2)储存在骨骼基质中(三)，我们确定它是否在来自Fgf2型–/–老鼠。Northern分析显示没有Fgf1型两种基因型成骨细胞的mRNA转录。然而，Fgf1型信使核糖核酸在来自Fgf2型+/+小鼠，作为阳性对照（数据未显示）。

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Northern分析Fgf2型7日龄颅骨原代成骨细胞mRNA的表达Fgf2型+/+和Fgf2型–/–老鼠。培养7、9、14和21天后，从细胞中提取总RNA。6千字节Fgf2型mRNA转录物在颅骨成骨细胞培养物中表达Fgf2型+/+老鼠（通道1、3、5和7）。否Fgf2型在成骨细胞中检测到mRNA转录Fgf2型–/–老鼠（2、4、6和8道）。

Fgf2基因断裂对骨细胞复制的影响。

我们测量了8周龄颅骨成骨细胞中胸腺嘧啶掺入DNA的情况Fgf2型+/+和Fgf2型–/–老鼠。在来自Fgf2型–/–鼠标（图​（图2）。2). 我们比较了24小时治疗与外源性FGF-2在这些培养物中增加细胞复制的能力。添加FGF-2（10 nM）增加了两种基因型成骨细胞的细胞复制。

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8周龄颅骨成骨细胞胸腺嘧啶核苷掺入DNA的比较Fgf2型+/+和Fgf2–/–老鼠。成骨细胞取自8周龄的颅骨Fgf2型+/+和Fgf2型–/–小鼠，在100毫米的皿中用10%的热量将FCS灭活12天。收集细胞并以5000个细胞/cm的密度重新种植2持续7天。每3天更换一次媒体。在培养期的最后24小时内，用新鲜培养基处理培养物，不含或含有FGF-2（10 nM）。对于标签研究[三H] 在培养的最后4小时内添加胸腺嘧啶（10μCi/孔），以测量胸腺嘧啶掺入DNA的情况。数值为每组6次测定的平均值±SEM。A类与对照培养基显著不同; P（P）< 0.05.B类与Fgf2型+/+;P（P）< 0.05.

Fgf2骨髓培养中碱性磷酸酶阳性集落和矿化结节+/+和Fgf2–/–老鼠。

我们评估了Fgf2型基因会改变骨髓培养物中碱性磷酸酶阳性（ALP）集落和矿化结节的形成Fgf2型–/–老鼠。骨髓细胞以1×10的低密度电镀6在14天培养期的前3天添加FGF-2（10 nM）时，每孔的细胞数。使用NIH图像（版本1.61）计算ALP菌落数并测量菌落面积。两种基因型的车辆处理骨髓培养物的比较显示，ALP菌落较少（29+4 vs.16+0.8；P（P）<0.05），菌落面积减少（0.24+0.05 vs.0.07+0.01；P（P）<0.05）在来自Fgf2型–/–老鼠。FGF-2处理对菌落面积的影响如图所示​图3a。三a.FGF-2治疗后，菌落面积显著增加。然而，在Fgf2型–/–小鼠骨髓培养中FGF-2治疗反应的比较Fgf2型+/+老鼠。在一些实验中，骨髓细胞在206每孔培养13或21天，染色ALP，然后用von Kossa方法保存矿物质（图​（图3b）。三b） ●●●●。在这些培养物中，我们无法计算来自Fgf2型+/+因为弥散染色；然而，即使在如此高的初始板密度下，在Fgf2型–/–老鼠。骨髓培养13天后ALP菌落较少，20天后矿物质染色最少Fgf2型–/–小鼠与Fgf2型+/+文化（图​（图3三b） ●●●●。

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(一)FGF-2对小鼠骨髓培养物集落面积的影响Fgf2型+/+和Fgf2型–/–老鼠。在含有青霉素/链霉素和10%热灭活FCS的αMEM中，在没有或存在FGF-2（10 nM）的情况下，细胞以每孔100万个细胞的密度进行培养。第3天，更换培养基，细胞在分化培养基（αMEM、10nM地塞米松、10%FCS、8mMβ-甘油磷酸、50μg/mL抗坏血酸）中培养11天。A类与对照文化显著不同；P（P）< 0.05.B类与Fgf2型+/+;P（P）< 0.05. (b条)von Kossa染色法测定小鼠骨髓培养物中碱性磷酸酶集落和矿化结节形成能力的比较Fgf2型+/+和Fgf2型–/–老鼠。细胞在含有青霉素/链霉素和10%热灭活FCS的αMEM中以每孔2000万个细胞的密度进行培养。第3天，更换培养基并在分化培养基（αMEM、10 nM地塞米松、10%FCS、8 mMβ-甘油磷酸、50μg/mL抗坏血酸）中培养细胞，培养时间为指定时间。

4.5月龄成人股骨远端干骺端骨小梁的显微CT分析Fgf2型+/+和Fgf2型–/–老鼠。我们用micro-CT检测了两种基因型成年小鼠的骨微结构(63). 4.5月龄男性股骨干骺端的三维图像Fgf2型+/+和Fgf2型–/–小鼠如所示（图​（图4）。4). 骨小梁的板状结构明显减少，骨小梁连接杆断裂Fgf2型–/–小鼠与Fgf2型+/+鼠标（图​（图4）。4). 使用二维图像，确定BV/TV、Tb的总面积、骨面积和骨周长。Th、Tb。N、 和Tb。计算Sp。图​图55显示了计算的三维参数。BV/TV和Tb。N和Tb分别显著降低34%和31%。年Sp显著增加63%Fgf2型–/–小鼠与Fgf2型+/+老鼠。Tb、。Th在这个年龄段的两种基因型之间没有差异（数据未显示）。

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4.5月龄股骨小梁骨的显微CT扫描形态学研究Fgf2型+/+和Fgf2型–/–老鼠。4.5月龄男性股骨远端干骺端三维骨小梁构筑Fgf2型+/+和Fgf2型–/–用micro-CT对小鼠进行分析。注意，在Fgf2型–/–小鼠与Fgf2型+/+.

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使用从4.5个月大的股骨micro-CT获得的二维数据计算三维微观结构参数Fgf2型+/+和Fgf2型–/–老鼠。计算的形态计量学指标包括骨体积密度（骨体积[BV]/小梁体积[TV]）、小梁数[Tb.N=（BV/TV）/Tb.Th]和小梁间距[Tb.Sp=（1/Tb.N）–Tb.Th]。A类与Fgf2型+/+群体；P（P）<0.05，Tukey-Kramer多重比较试验（ANOVA）。

4.5个月龄Fgf2小鼠胫骨的静态和动态组织形态计量学分析+/+和Fgf2–/–老鼠。

对4.5月龄小鼠右胫骨近端的静态组织形态计量学分析证实了显微CT的发现。骨体积和小梁数量的结构参数显著降低，小梁分离显著增加Fgf2型–/–小鼠与Fgf2型+/+老鼠（表​（表1）。1). 与micro-CT一样，小梁厚度没有变化（数据未显示）。使用左胫骨近端测定骨吸收参数。破骨细胞表面和破骨细胞数量在Fgf2型–/–骨骼，但差异并没有达到统计学意义。

表1

4.5月龄右胫骨近端骨结构的静态组织形态计量学参数Fgf2型+/+和Fgf2型–/–老鼠

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为了确定骨量的减少是否是由于骨形成动力学的减少，测定了骨形成的组织形态计量学参数。右胫骨近端骨形成的量化如表所示​表2。2双标记表面、矿物并置率和骨形成率在Fgf2型–/–老鼠。这些数据与Fgf2型–/–骨骼与Fgf2型+/+表明成骨细胞增殖和分化在Fgf2型–/–老鼠。

表2

4.5月龄右胫骨近端骨形成的动态组织形态计量学参数Fgf2型+/+和Fgf2型–/–老鼠

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8月龄Fgf2股骨远端的组织形态计量学+/+和Fgf2–/–老鼠。

我们还检查了8个月大的男性股骨远端的未钙化切片Fgf2型+/+（图​（图6a）6a） 和Fgf2型–/–（图​（图6b）6b） 暗场照明小鼠(60). BV/TV和Tb。N英寸Fgf2型–/–与对照组相比，小鼠的继发性海绵状细胞减少Fgf2型+/+老鼠。小梁分离也增加Fgf2型–/–老鼠。

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股骨远端未脱钙切片(一)一个8个月大的孩子Fgf2型+/+鼠标和(b条)一个胎儿生长因子–/–鼠标（暗场照明). Trabecular number is decreased in the secondary spongiosa of theFgf2型–/–鼠标。

8月龄Fgf2股骨远端干骺端骨小梁的显微CT分析+/+和Fgf2–/–老鼠。

我们通过micro-CT检测了两种基因型的8个月龄小鼠的骨微结构。表​表3三显示了BV/TV和Tb的计算三维参数。N和Tb分别显著降低67%和54%。骨骼中的Sp显著增加了249%Fgf2型–/–小鼠与Fgf2型+/+老鼠。与我们在4.5月龄小鼠中的观察结果相反，Tb。这些老年人骨骼中的Th减少了27%Fgf2型–/–老鼠。

表3

8月龄股骨显微CT的三维参数Fgf2型+/+和Fgf2型–/–老鼠

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8月龄Fgf2胫骨的静态组织形态计量学分析+/+和Fgf2–/–老鼠。

我们对8月龄小鼠的右胫骨近端进行了静态组织形态计量学分析。如表所示​表4，4，骨体积和小梁数量的结构参数显著降低，小梁间距显著增加Fgf2型–/–小鼠与Fgf2型+/+老鼠。这些数据证实了从8个月大的Fgf2的股骨远端获得的显微CT结果–/–鼠标，如表所示​表3。三测定了左胫骨近端的骨吸收参数。在这些老年小鼠中，破骨细胞表面在Fgf2型–/–但破骨细胞数量没有明显下降。

表4

8月龄儿童右胫骨近端骨结构的静态组织形态计量学参数Fgf2型+/+和Fgf2型–/–老鼠

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讨论

我们假设Fgf2基因可能导致骨形成减少，因为FGF-2是成骨细胞和成骨细胞前体的强大有丝分裂原(20,2)以及骨形成刺激物(2,25–30). 此外，在软骨内骨形成过程中，FGF-2在长骨的生长板中有差异表达(64). 对18天大鼠胎儿的交叉切片免疫组织化学研究表明，在分化早期软骨细胞中存在FGF-2染色(64). 骨化中心、钙化基质和成骨细胞也含有FGF-2的强烈染色(64). 检查的其他研究Fgf2型mRNA和蛋白分别经原位杂交和免疫组织化学检测，在人胎儿骺板的静止软骨细胞和增殖软骨细胞中均有表达(65). 在早期的研究中，骨髓基质细胞被证明能够合成和释放FGF-2(31)并因FGF-2而增殖。这些研究表明Fgf2型软骨内骨形成。

在本报告中，我们发现来自8周龄的颅骨成骨细胞的增殖降低Fgf2型–/–老鼠。如图所示​图2，2在培养7天后，胸腺嘧啶核苷标记在Fgf2型–/–颅骨成骨细胞培养与Fgf2型+/+颅骨成骨细胞培养。因此，内源性FGF-2在维持成骨细胞复制的基础速率方面似乎很重要。将外源性FGF-2添加到两种基因型的颅骨成骨细胞培养物中均诱导了有丝分裂反应。然而，注射重组FGF-2（18-kDa亚型）并没有完全恢复颅骨成骨细胞培养中的增殖反应Fgf2型–/–老鼠。

我们还发现骨髓基质细胞Fgf2型–/–小鼠形成较少的碱性磷酸酶矿化集落（图​（图3b）。三b） ●●●●。这些结果可能是由于成骨细胞前体数量减少，继发于复制减少。我们进行了实验，以确定是否将外源性FGF-2短期添加到来自Fgf2型+/+和Fgf2型–/–小鼠会增加ALP菌落数和菌落面积。骨髓培养中碱性磷酸酶集落形成缺陷Fgf2型–/–小鼠通过重组18kDa FGF-2治疗仅部分恢复（图​（图3a）。三a） ●●●●。这些结果很有趣，因为一些研究表明FGF-2的特定亚型可能会不同地调节细胞表型(66,67).

在小鼠骨骼中，有3种FGF-2蛋白亚型，分子量（MWs）分别为18、21和22kDa。我们在之前的报告中证实，FGF-2基因的缺失会消除FGF-2蛋白的所有亚型(51). 研究表明，仅表达低分子量（LMW；18kDa）FGF-2亚型的细胞比仅表达高分子量（HMW）的细胞迁移性更强(66,67). 先前的研究表明，18-kDa FGF-2主要定位于细胞质，而HMW蛋白定位于细胞核，可能在介导有丝分裂反应中起重要作用(66). 在早期的研究中，我们检测了过度表达LMW、HMW或FGF-2所有MW亚型的转基因小鼠平滑肌细胞的生长(67). 我们证明，血清刺激的生长在表达HMW hFGF-2亚型的培养光滑细胞中最高，在具有非核LMW亚型的细胞中居中，在野生型细胞中最低。此外，中和性抗FGF-2抗体显著降低了血清刺激的DNA合成，但仅在过度表达出口/非核LMW亚型的细胞系中(67). 这些研究表明，FGF-2的核形式在对该生长因子的有丝分裂反应中起着重要作用。因此，在缺乏HMW亚型的情况下，使用LMW FGF-2治疗可能无法完全修复我们在颅骨成骨细胞培养中观察到的增殖缺陷或骨髓基质细胞培养中的ALP集落形成缺陷Fgf2型–/–老鼠。目前，HMW蛋白无法确定添加这些蛋白是否会完全恢复这些反应。

骨髓基质是一种复杂的组织，其中含有能够分化为多种间充质细胞类型的多能干细胞(68,69)包括成骨细胞，可以分化和表达碱性磷酸酶、I型胶原和骨钙素，并产生可矿化基质(69–71). 大鼠骨髓基质细胞培养模型已用于在体内证明FGF-2对骨形成的刺激作用(72–74). 利用人骨髓基质细胞进行的体外研究表明，FGF-2调节人骨髓衍生类骨细胞的成骨表型的生长和表达(75–78). 如图中的典型实验所示​图3b，三b、 ALP、矿化集落在来自Fgf2型–/–老鼠。在缺乏FGF-2的情况下，促进成骨细胞分化的因子可能减少或缺失。研究表明，FGF-2可以与血小板源性生长因子协同作用，维持大鼠骨髓源性间充质细胞的成骨潜力(79). 此外，在诱导大鼠新骨形成方面，FGF-2和骨形态发生蛋白-2的联合作用比单独使用这两种因子更有效(80).

成骨细胞和脂肪细胞由骨髓的多潜能间充质干细胞发育而成(81)先前的研究表明，小鼠成骨细胞生成缺陷和骨质减少可能与脂肪生成增加和骨髓增生有关(82). 因为FGF-2通过影响基质细胞和早期造血祖细胞促进其他骨髓谱系的发育(83)，我们检查了Fgf2型我们以前发表的血液学骨髓谱系的基因(51). 骨髓细胞的甲基纤维素培养显示Fgf2型–/–小鼠，巨核细胞数量增加。在小鼠骨髓培养中检测脂肪生成的研究Fgf2型–/–老鼠是有计划的。

micro-CT数据（图​（图44和​和5）5)以及4.5月龄婴儿的静态和动态组织形态计量学研究Fgf2型–/–鼠标（桌子​（表11和​和2）2)骨质量显著下降，新骨形成率下降，两者非常一致。在4.5个月大的股骨中也发现小梁分离增加Fgf2型–/–老鼠。8个月大的老年人未钙化股骨远端的暗场检查Fgf2型+/+（图​（图6a）6a） 和Fgf2型–/–（图​（图6b）6b） 小鼠的骨小梁较少，骨连接丢失Fgf2型–/–小鼠与Fgf2型+/+老鼠。micro-CT数据（表​（表3）三)和静态组织形态计量学数据（表​（表4）4)来自这些8个月大的小鼠的小梁分离表现出更显著的增加、BV/TV和Tb的进一步降低。N和Tb下降。这些数据证实了在4.5个月龄时观察到的结果Fgf2型–/–并进一步表明，随着这些小鼠年龄的增长，这些变化是渐进的。

原发性海绵体内的骨量和小梁数量减少可能发生在Fgf2型–/–软骨成熟延迟会导致骨量峰值降低。然而，这些小鼠的生长板没有明显异常(51). 我们不能从目前的研究中排除小梁骨吸收增加的可能性Fgf2型–/–小鼠处于骨小梁发育的早期阶段，随着动物的生长迅速下降。然而，对这些结果的另一种解释是，由于骨量和结构是由周转期间形成和吸收的骨的平衡决定的，如果骨吸收率没有改变，但仍大于骨形成率，则可能存在负平衡。

动态组织形态计量学（表​（表2）2)证实4.5个月大的婴儿骨骼中DLS/BS、BFR/BS和MAR显著下降Fgf2型–/–老鼠。这些结果得到了体外骨形成数据的进一步支持（图​（图3，三（a和b），表明来自Fgf2型–/–小鼠与Fgf2型+/+MAR降低是自相矛盾的，因为一些研究表明，成骨细胞培养物的慢性FGF-2治疗抑制胶原合成、碱性磷酸酶活性和骨钙素合成(2). 然而，FGF-2刺激成骨细胞的增殖，许多体外和体内研究表明，间断使用FGF-2可增加新骨形成(2,25–30). 新骨形成的增加仅见于骨内和骨小梁表面。骨髓间隙中也有新形成的松质骨填充，这表明FGF-2作用的靶细胞是骨髓中存在的成骨细胞前体。因此，FGF-2似乎抑制分化成骨细胞的功能，而其合成代谢作用可能是由于能够分化为能够诱导新骨形成的成熟成骨细胞前成骨细胞数量的增加。因此，在Fgf2型–/–成骨细胞前体细胞较少的小鼠，成熟成骨细胞数量也会减少，因此MAR可能会通过这种机制降低。

总之，我们的研究表明Fgf2型小鼠体内的基因导致成骨细胞复制减少，骨髓培养中矿化结节形成减少，体内新骨形成减少。这些数据首次证明了内源性FGF-2在维持骨量和骨形成方面的重要作用。我们认为，在45个月大的婴儿骨骼中的观察结果Fgf2型–/–小鼠在年龄较大的8个月大的动物中更显著。这些数据进一步表明，当Fgf2基因在小鼠中被破坏时，FGF家族成员的冗余不能补偿以防止骨质流失。

致谢

作者感谢劳伦斯·莱斯（康涅狄格州法明顿康涅狄克大学医学院）的有益讨论。这项工作得到了NIH拨款AR-46025（给M.M.Hurley）和HL-53631（给J.D.Coffin）的部分支持。作者还要感谢Jan Figueroa的文书协助。

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文章来自临床研究杂志由以下人员提供美国临床研究学会