Tenascin-C缺乏减轻小鼠肺损伤后TGF-β介导的纤维化

博莱霉素致肺损伤模型。

年龄和性别匹配的TNC缺乏小鼠和野生型小鼠通过气管内滴注接受60μl无菌生理盐水中60 mU博莱霉素（新泽西州普林斯顿市美赞臣）；对照组小鼠接受等量的无菌生理盐水。气管插管可经口或经手术切开。治疗后，对小鼠进行21天的随访，并处死幸存者以量化右肺胶原蛋白含量。

肺胶原蛋白定量。

切断腹主动脉后，通过右心室向肺血管灌注20 ml无菌盐水。右肺在肺门处切除，均质，然后在65%的三氯乙酸（宾夕法尼亚州匹兹堡Fisher Scientific）中培养。离心和抽吸上清液后，将组织颗粒重新悬浮在12 N HCl中，并在110°C下烘烤过夜。然后在dH中重建变性组织₂O、 将200μl等分样品与500μl 1.4%氯胺T（Sigma-Aldrich）在10%异丙醇和0.5 M醋酸钠中在室温下培养20分钟。然后添加5微升未干燥的1 M 4-（二甲氨基）-苯甲醛（Sigma-Aldrich），并在65°C下培养悬浮液15分钟。每个样品在540 nm处的吸光度测量一式三份。使用0–500μg/ml反式-4-羟基同时生成标准曲线-我-脯氨酸（Sigma-Aldrich），从氯胺T反应开始。

组织学和免疫组织化学。

小鼠在图中所示的时间点被杀死。在15–20 cmH的PBS中用4%多聚甲醛固定肺部₂O压力。固定后，用石蜡包埋肺部，并制备5μm切片。组织学方面，切片用苏木精/伊红或马森三色染色。对于免疫组织化学，切片首先在3%H中冲洗₂O（运行）₂阻断内源性过氧化物酶活性。抗人TNC抗血清是Harold Erickson（杜克大学）赠送的，以1:100稀释使用。兔抗人磷酸化Smad-2/3（加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司）按照矢量ABC Elite协议（加利福尼亚州伯林盖姆矢量实验室）以1:100稀释，使用DAB染色原（矢量）作为HRP底物。小鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白（DakoCytomation，Glostrup，Denmark）按照Dako-ARK方案（DakoCeotomation）稀释1:50使用。

TGF-β活化试验。

TNC对潜在TGF-β活化的影响是使用先前描述的共培养系统进行分析的(30). 在该系统中，携带β6-整合素转基因的稳定转染SW480细胞与稳定表达荧光素酶报告基因的水貂肺上皮报告细胞共培养24小时，荧光素素酶报告细胞由纤溶酶原激活物抑制剂-1启动子的TGF-β反应元件驱动。如前所述，β6转染细胞激活潜伏的TGF-β，导致荧光素酶活性比未转染的SW480细胞增加7倍。TNC蛋白（1–10μg/ml）被测试为细胞被镀的底物和细胞被镀后的添加剂。TNC并没有阻止两种细胞系的粘附。在共培养物接种后立即添加上述多克隆TNC抗体（2–10μg/ml）以测试其效果。

成纤维细胞系。

为了建立成纤维细胞系，用PBS填充TNC缺乏型和野生型肺的空气空间，将其切碎，并浸入补充有10%FCS和以下生长因子的DME-H21中：1×胰岛素-转铁蛋白-硒（Invitrogen，Carlsbad，CA）、5μg/l rhPDGF（R&D）和10μg/l rhEGF（R＆D）。增殖的成纤维细胞在4-5天内迁移到平板上，此时通过胰蛋白酶处理去除组织碎片和粘附细胞，并用上述添加剂在DME中重新种植。膨胀后，细胞被冷冻，实验在通道3和10.

肌成纤维细胞表型评估。

如上所述，将一万个成纤维细胞接种到预涂层塑料组织培养孔中。为了诱导静止，细胞在不含FCS、添加生长因子的DME-H21和0.3–0.7 ng/ml rhTGF-β1（R&D Biosystems）中培养1–5天。此时，按照上述方法清洗、固定细胞，并阻断过氧化物酶。将1:250稀释的抗α-SMA IgG2a（DakoCytomation）在37°C下作用于细胞1小时。随后的清洗、封闭、二次抗体结合和比色反应步骤如上所述。再次，在450 nm处读取每个条件的八个重复，并确定每个条件的平均值和标准偏差。

为了分析TGF-β刺激的Smad表达和磷酸化，用0.5 ng/ml rhTGF-α1刺激细胞长达30分钟。去除培养基后，将细胞从培养皿中刮取到1ml冰镇低渗缓冲液中（10 mM HEPES，pH 7.9，1.5 mM MgCl2，10 mM KCl，0.5 mM DTT，0.2 mM PMSF）并浸水10次（Kontes#19聚四氟乙烯/玻璃浸水）。这些样品要么用于全细胞研究，要么用于核研究，如下所示：细胞核在80克（1000 rpm，4°，微量离心），用1 ml低渗缓冲液清洗，在80℃下再次造粒克，并在含有β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液中再次悬浮。将等量的全细胞提取物或等量的细胞核（由血细胞计数仪测定）加载到4–12%的双三元聚丙烯酰胺凝胶（Invitrogen）上。膜转移后，样品暴露于1:250稀释的兔抗人Smad-2/3抗体（Santa Cruz Biotechnology）、鼠抗人Smad-2抗体（Cell Signaling Technology，Boston，MA）或兔抗人Smad-3抗体（Cell-Signaling）。然后，在使用SuperSignal West Femto底物（Pierce）进行开发之前，用适当的过氧化物酶相关二级抗体处理膜（Pierse Biotechnology，Rockford，IL）。显影后，使用公共领域NIH图像程序（由美国国立卫生研究院开发，可在互联网上访问网址：http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).

肺成纤维细胞胶原测定。

如前所述，我们建立并维持了成纤维细胞培养(三). 相同数量的野生型和TNC-null细胞被放置在复制孔中。为了诱导静止，细胞在无FCS、添加生长因子的DME-H21中培养过夜。在接下来的24小时内，在有或无1 ng/ml rhTGF-β1的无FCS和生长因子培养基中培养细胞。如前所述，在真皮成纤维细胞融合单层的细胞层分数中测量I型胶原(三). 简单地说，将融合培养的成纤维细胞标记30小时我-[4-H]脯氨酸（新英格兰核）在10⁻³μCi/ml含有0.15 mM抗坏血酸钠、0.1 mMδ-氨基丙腈富马酸盐（Sigma）和10%FBS（Gibco BRL）的培养基。用胃蛋白酶在4°C的3%乙酸中提取细胞层胶原蛋白12 h，并在7.5%聚丙烯酰胺凝胶上分离。将凝胶固定、脱水，并用20%2,5-二苯恶唑（Sigma）在二甲基亚砜中浸渍3小时。荧光照相术后，通过切除带、37°C下在闪烁组织增溶剂（Fisher）中水解过夜和闪烁计数来测定α-1（I）和α-2（I）带中的放射性。通过对重复孔中相同处理的细胞进行计数，将结果归一化为细胞数。

定量PCR分析。

使用TRIzol试剂从成纤维细胞培养物中制备总RNA。使用RT2 Profiler系统（SABioscience）进行第一链合成和随后的qPCR。购买了用于TGF-β途径靶点和5个看家基因（Hprt1、Hsp90、Gapdh、Actb和Gusb）的反转录和PCR试剂以及优化的引物（SABiosciences）。根据制造商的建议，使用Sybr Green对LightCycler（Roche）进行逆转录和PCR检测。使用ΔΔ确定相对表达^{计算机断层扫描}方法(22). 表达率计算为2^-ΔΔCt.

TNC缺乏减少间质胶原沉积。

为了研究TNC对胶原沉积的作用，野生型和TNC阴性小鼠通过气管内注射60 mU博莱霉素或生理盐水，并随访21天。所有经盐处理的对照动物存活21天。服用博莱霉素后，两组的死亡率相当高，但无差异(图2,A类和B类). 由于不到30%的动物在直接气管注射后存活21天，我们用经口博莱霉素治疗了第二组动物。在我们手中，这种方法只将药物输送到右肺，导致野生型和TNC阴性动物的存活率接近100%，同时仍会造成严重的单侧肺损伤。

在单独的窗口中打开

图2。

TNC缺乏小鼠的可比死亡率。野生型(♦）和TNC-缺乏小鼠通过直接气管或经口注射博莱霉素，并随访21天。直接气管滴注后测量存活率(A类,n个=27个基因型）或经口滴注(B类,n个=每个基因型9个）。所有经盐处理的对照动物存活21天（直接气管，n个=6，经口，n个=每个基因型4个）。

取存活21天的小鼠右肺，用羟脯氨酸作为替代物测定全肺胶原蛋白含量。在直接气管内注射博莱霉素后，野生型小鼠的肺胶原蛋白含量增加了一倍，而TNC-null小鼠的胶原蛋白含量仅增加了15%(图3A类). 经口给予博莱霉素后，TNC-null小鼠也得到了类似的保护，这表明这种保护作用并不是因为选择了纤维化程度较低的TNC-number幸存者。经口途径给予博莱霉素的纤维化作用有所减弱，可能是因为该途径最终将更少的博莱霉素输送到下呼吸道。

在单独的窗口中打开

图3。

TNC缺乏小鼠肺部胶原沉积减少。野生型和TNC缺乏小鼠通过气管或经口直接注射博莱霉素或无菌盐水。21天后处死小鼠，以测量右肺胶原蛋白含量和湿重（经口，n个=8，直接气管，n个=6）。A类：暴露于博莱霉素后，野生型小鼠（黑条）的肺部沉积了大量胶原蛋白，与给药方式无关*P（P）< 0.01.B–E类：直接接受气管博莱霉素（胶原蛋白染色蓝色）的小鼠肺切片的马森毛染色。在10天时从野生型和TNC阴性动物中获取切片(B类和C类分别为）和21天(天和C类）。图像是每种基因型的3只小鼠的代表性切片。

在注射博莱霉素后10天和21天从小鼠身上制备肺切片。Masson三色染色，其中胶原染色为蓝色，提示TNC无效肺的间质纤维化减少10天(图3,B类和C类). 到21天，TNC缺乏的肺部不仅胶原含量减少，而且肺泡结构的尴尬程度也减轻(图3,天和E类).

TNC缺乏与ALI后TGF-β反应减少相关。

TGF-β在产生间质纤维化中起着公认的作用，而间质纤维化是博莱霉素诱导肺损伤慢性期的特征(30). TGF-β在肺部的作用主要通过信号分子Smad-2和Smad-3的磷酸化介导(9,32,56). 在成纤维细胞中，Smad磷酸化和信号传导促进分化为肌成纤维细胞表型，其特征是α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达(37). 因此，我们检测了野生型和TNC阴性小鼠中α-SMA表达和Smad磷酸化作为TGF-β作用的替代指标。使用一种能识别磷酸化形式Smad-2和Smad-3的抗体，我们发现博莱霉素暴露的TNC缺乏小鼠肺部的纤维增生病灶中含有较少的细胞核内Smad-2/3染色细胞(图4,A类和B类). 同样，野生型肺的间质中含有大量α-SMA阳性细胞，而在TNC缺乏的肺损伤部位，这些细胞数量大大减少(图4,C类和天). 这些发现提示我们，ALI后TNC缺乏的肺可能会损害TGF-β的作用，因此我们继续在体外评估TGF-α的作用。

在单独的窗口中打开

图4。

TNC缺乏小鼠肺和成纤维细胞中TGF-β活性降低。野生型和TNC缺乏小鼠经气管直接注射博莱霉素，10天后处死。野生型小鼠肺部的纤维增殖区(A类)与TNC缺乏小鼠的肺相比，P-Smad-2和-3（棕色染色细胞核，箭头）染色阳性的细胞数量似乎更多(B类). 野生型肺的间质(C类)与TNC阴性肺相比，α-平滑肌肌动蛋白染色（箭头）也更多(天).