Tenascin-C缺乏减轻小鼠肺损伤后TGF-β介导的纤维化

实验动物。

如前所述，建立了129Sv株TNC缺陷小鼠(11).对TNC-null等位基因杂合的同源小鼠进行交配，并在断奶后对后代进行基因分型。在下述研究中，使用了TNC缺乏和野生型同窝鼠，或从这些小鼠获得的肺成纤维细胞。所有动物均按照加利福尼亚大学旧金山动物研究委员会批准的方案使用。

博莱霉素致肺损伤模型。

年龄和性别匹配的TNC缺乏小鼠和野生型小鼠通过气管内滴注接受60μl无菌生理盐水中60 mU博莱霉素（新泽西州普林斯顿市美赞臣）；对照组小鼠接受等量的无菌生理盐水。气管插管可经口或经手术切开。治疗后，对小鼠进行21天的随访，并处死幸存者以量化右肺胶原蛋白含量。

肺胶原蛋白定量。

切断腹主动脉后，通过右心室向肺血管灌注20 ml无菌盐水。右肺在肺门处切除，均质，然后在65%的三氯乙酸（宾夕法尼亚州匹兹堡Fisher Scientific）中培养。离心和吸取上清液后，将组织沉淀重新悬浮在12 N HCl中，并在110°C下烘烤过夜。然后在dH中重建变性组织₂O、 将200μl等分样品与500μl 1.4%氯胺T（Sigma-Aldrich）在10%异丙醇和0.5 M醋酸钠中在室温下培养20分钟。然后添加5微升未干燥的1 M 4-（二甲氨基）-苯甲醛（Sigma-Aldrich），并在65°C下培养悬浮液15分钟。每个样品在540 nm处的吸光度测量一式三份。使用0–500μg/ml反式-4-羟基同时生成标准曲线-我-脯氨酸（Sigma-Aldrich），从氯胺T反应开始。

组织学和免疫组织化学。

老鼠在图中所示的时间点被杀死。在15–20 cmH的PBS中用4%多聚甲醛固定肺部₂O压力。固定后，用石蜡包埋肺部，并制备5μm切片。组织学方面，切片用苏木精/伊红或马森三色染色。对于免疫组织化学，切片首先在3%H中冲洗₂O（运行）₂阻断内源性过氧化物酶活性。抗人TNC抗血清是哈罗德·埃里克森（杜克大学）赠送的，稀释度为1:100。兔抗人磷酸化Smad-2/3（加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司）按照矢量ABC Elite协议（加利福尼亚州伯林盖姆矢量实验室）以1:100稀释，使用DAB染色原（矢量）作为HRP底物。小鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白（DakoCytomation，Glostrup，Denmark）按照Dako-ARK方案（DakoCeotomation）稀释1:50使用。

TGF-β活化试验。

TNC对潜在TGF-β活化的影响是使用先前描述的共培养系统进行分析的(30).在该系统中，携带β6-整合素转基因的稳定转染SW480细胞与稳定表达荧光素酶报告基因的水貂肺上皮报告细胞共培养24小时，荧光素素酶报告细胞由纤溶酶原激活物抑制剂-1启动子的TGF-β反应元件驱动。如前所述，β6转染细胞激活潜伏的TGF-β，导致荧光素酶活性比未转染的SW480细胞增加7倍。TNC蛋白（1–10μg/ml）被测试为细胞被镀的底物和细胞被镀后的添加剂。TNC并没有阻止两种细胞系的粘附。在共培养物接种后立即添加上述多克隆TNC抗体（2–10μg/ml）以测试其效果。

成纤维细胞系。

为了建立成纤维细胞系，用PBS填充TNC缺乏型和野生型肺的空气空间，将其切碎，并浸入补充有10%FCS和以下生长因子的DME-H21中：1×胰岛素-转铁蛋白-硒（Invitrogen，Carlsbad，CA）、5μg/l rhPDGF（R&D）和10μg/l rhEGF（R＆D）。增殖的成纤维细胞在4-5天内迁移到平板上，此时通过胰蛋白酶处理去除组织碎片和粘附细胞，并用上述添加剂在DME中重新种植。膨胀后，细胞被冷冻，实验在通道3和10.

肌成纤维细胞表型评估。

如上所述，将一万个成纤维细胞接种到预涂层塑料组织培养孔中。为了诱导静止，细胞在不含FCS、添加生长因子的DME-H21和0.3–0.7 ng/ml rhTGF-β1（R&D Biosystems）中培养1–5天。此时，按照上述方法清洗、固定细胞，并阻断过氧化物酶。将1:250稀释的抗α-SMA IgG2a（DakoCytomation）在37°C下作用于细胞1小时。随后的清洗、封闭、二次抗体结合和比色反应步骤如上所述。再次，在450 nm处读取每个条件的八个重复，并确定每个条件的平均值和标准偏差。

为了分析TGF-β刺激的Smad表达和磷酸化，用0.5 ng/ml rhTGF-β1刺激细胞长达30分钟。去除培养基后，从1 ml冰冷的低渗缓冲液（10 mM HEPES，pH 7.9，1.5 mM MgCl2，10 mM KCl，0.5 mM DTT，0.2 mM PMSF）中的培养皿中刮取细胞并浸水10次（Kontes#19聚四氟乙烯/玻璃浸水）。这些样品要么用于全细胞研究，要么用于核研究，如下所示：细胞核在80克（1000 rpm，4°，微量离心），用1 ml低渗缓冲液清洗，在80℃下再次造粒克，并在含有β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液中再次悬浮。将等量的全细胞提取物或等量的细胞核（由血球计数仪测定）加载到4–12%的双三元聚丙烯酰胺凝胶（Invitrogen）上。膜转移后，样品暴露于1:250稀释的兔抗人Smad-2/3抗体（Santa Cruz Biotechnology）、鼠抗人Smad-2抗体（Cell Signaling Technology，Boston，MA）或兔抗人Smad-3抗体（Cell-Signaling）。然后，在使用SuperSignal West Femto底物（Pierce）进行开发之前，用适当的过氧化物酶相关二级抗体处理膜（Pierse Biotechnology，Rockford，IL）。显影后，使用公共领域NIH图像程序（由美国国立卫生研究院开发，可在互联网上访问http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).

肺成纤维细胞胶原测定。

如前所述，我们建立并维持了成纤维细胞培养(三).相同数量的野生型和TNC-null细胞被放置在复制孔中。为了诱导静止，细胞在无FCS、添加生长因子的DME-H21中培养过夜。在接下来的24小时内，在有或无1 ng/ml rhTGF-β1的无FCS和生长因子培养基中培养细胞。如前所述，在真皮成纤维细胞融合单层的细胞层分数中测量I型胶原(三).简单地说，将融合培养的成纤维细胞标记30小时我-[4-H]脯氨酸（新英格兰核电厂），10⁻³μCi/ml含有0.15 mM抗坏血酸钠、0.1 mMδ-氨基丙腈富马酸盐（Sigma）和10%FBS（Gibco BRL）的培养基。用胃蛋白酶在4°C的3%乙酸中提取细胞层胶原蛋白12 h，并在7.5%聚丙烯酰胺凝胶上分离。将凝胶固定、脱水，并用20%2,5-二苯恶唑（Sigma）在二甲基亚砜中浸渍3小时。荧光照相术后，通过切除带、37°C下在闪烁组织增溶剂（Fisher）中水解过夜和闪烁计数来测定α-1（I）和α-2（I）带中的放射性。通过对重复孔中相同处理的细胞进行计数，将结果归一化为细胞数。

定量PCR分析。

使用TRIzol试剂从成纤维细胞培养物中制备总RNA。使用RT2 Profiler系统（SABioscience）进行第一链合成和随后的qPCR。购买了用于TGF-β途径靶点和5个看家基因（Hprt1、Hsp90、Gapdh、Actb和Gusb）的反转录和PCR试剂以及优化的引物（SABiosciences）。根据制造商的建议，使用Sybr Green对LightCycler（Roche）进行逆转录和PCR检测。使用ΔΔ确定相对表达^{计算机断层扫描}方法(22).表达率计算为2^-ΔΔCt.

统计分析。

使用Kaplan-Meier统计法生成博莱霉素滴注后的存活曲线并进行比较。通过以下方法分析野生型和TNC缺失动物或细胞之间的单一比较t吨-测试。剂量反应和时间过程数据通过事后方差分析进行分析t吨-根据需要进行测试。定量PCR的统计差异使用非配对t吨-显著性阈值降低为的测试P（P）<0.005，以修正多重比较。

TNC在肺损伤部位高表达。

TNC在成人肺中表达最低，但在小鼠和人类的几种形式的肺损伤后高度诱导(2,20).我们首先调查了基线和ALI后TNC表达的时间进程。为此，我们将60 mU博来霉素气管内注射到成对的野生型小鼠中，并在6、14或21天后采集其肺部，以量化TNC。图1A类显示正常肺中不存在TNC，但在暴露于博莱霉素的野生型小鼠中，在6天和14天时显著诱导TNC。到21天，TNC已基本从肺部清除。正如预期的那样，TNC不是由盐水装置诱导的（未显示），并且在博莱霉素作用下TNC阴性小鼠中未表达(图1A类).因为在第6天出现峰值表达，所以我们检查了该时间点的TNC定位。免疫组织化学显示，TNC沉积在增厚的肺泡隔间质细胞外基质中，特别是在损伤部位(图1,D–G型)但不在正常肺的邻近区域(图1,H（H）和我).这些数据与先前对ALI后TNC表达的详细分析一致(46,57)并提示TNC可能在介导博来霉素的急性损伤反应中发挥直接作用。

TNC缺乏减少间质胶原沉积。

为了研究TNC对胶原沉积的作用，野生型和TNC阴性小鼠通过气管内注射60 mU博莱霉素或生理盐水，并随访21天。所有经盐处理的对照动物存活21天。服用博莱霉素后，两组的死亡率相当高，但无差异(图2,A类和B类).由于不到30%的动物在直接气管注射后存活21天，我们用经口博莱霉素治疗了第二组动物。在我们手中，这种方法只将药物输送到右肺，导致野生型和TNC阴性动物的存活率接近100%，同时仍会造成严重的单侧肺损伤。

取存活21天的小鼠右肺，用羟脯氨酸作为替代物测定全肺胶原蛋白含量。在直接气管内注射博莱霉素后，野生型小鼠的肺胶原蛋白含量增加了一倍，而TNC-null小鼠的胶原蛋白含量仅增加了15%(图3A类).经口给予博莱霉素后，TNC-null小鼠也得到了类似的保护，这表明这种保护作用并不是因为选择了纤维化程度较低的TNC-number幸存者。经口途径给予博莱霉素的纤维化作用有所减弱，可能是因为该途径最终将更少的博莱霉素输送到下呼吸道。

在注射博莱霉素后10天和21天从小鼠身上制备肺切片。Masson’s三色染色显示胶原染色呈蓝色，提示TNC阴性肺的间质纤维化减少10天(图3,B类和C类).到21天，TNC缺乏的肺部不仅胶原含量减少，而且肺泡结构的尴尬程度也减轻(图3,D和E类).

TNC缺乏与ALI后TGF-β反应减少相关。

TGF-β在产生间质纤维化中起着公认的作用，而间质纤维化是博莱霉素诱导肺损伤慢性期的特征(30).TGF-β在肺部的作用主要通过信号分子Smad-2和Smad-3的磷酸化介导(9,32,56).在成纤维细胞中，Smad磷酸化和信号传导促进分化为肌成纤维细胞表型，其特征是α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达(37).因此，我们检测了野生型和TNC阴性小鼠中α-SMA表达和Smad磷酸化作为TGF-β作用的替代指标。使用一种能识别磷酸化形式Smad-2和Smad-3的抗体，我们发现博莱霉素暴露的TNC缺乏小鼠肺部的纤维增生病灶中含有较少的细胞核内Smad-2/3染色细胞(图4,A类和B类).同样，野生型肺的间质中含有大量α-SMA阳性细胞，而在TNC缺乏的肺损伤部位，这些细胞数量大大减少(图4,C类和D).这些发现提示我们，ALI后TNC缺乏的肺可能会损害TGF-β的作用，因此我们继续在体外评估TGF-α的作用。

TNC缺乏损害TGF-β诱导的培养成纤维细胞活化。

虽然我们的体内研究表明，TGF-β介导的肌成纤维细胞活化受损，但他们没有区分受损的TGF-α活化和局部活化的TGF--β反应性的改变。在肺部，TGF-β的激活主要通过潜伏的TGF-α与肺上皮细胞表面αvβ6整合素的相互作用介导(30).使用先前报道的体外试验系统检测αvβ6介导的潜在TGF-β活化(30)以PAI-1启动子为报告基因，外源性TNC和TNC抗血清均未对肺上皮细胞TGF-β活化产生任何影响（未显示）。

为了测试TGF-β的反应性，我们从野生型和TNC-阴性的同卵双胞胎的肺部制备了原代成纤维细胞系。未经刺激的野生型肺成纤维细胞在培养中产生大量TNC，而TNC阴性细胞则不产生，因此可以直接比较内源性产生的TNC的作用。然后，我们使用这些细胞测试重组、组成活性TGF-β刺激肌成纤维细胞分化和胶原沉积的能力。如所示图5A类，野生型细胞对TGF-β有近似线性的剂量反应，暴露于最高浓度的TGF-α24小时后，>70%的细胞表达α-SMA。相反，TNC-null细胞的剂量反应平缓，只有不到30%的细胞表达α-SMA(P（P）< 0.001).类似地，如所示图5B类与野生型细胞相比，TNC-null成纤维细胞在基线和TGF-β作用下向细胞层基质分泌的胶原蛋白更少。这些发现反映了体内的观察结果，因此我们继续检查这些细胞中的TGF-β信号。

肺切片的免疫组织化学染色显示Smad-2/3信号改变，因此我们开始研究。使用与体内研究相同的抗磷酸化S-mad-2/3抗体，我们发现TNC-null细胞在暴露于TGF-β后Smad-2/3磷酸化略有降低(图5C类).重要的是，在TNC-null细胞的全细胞提取物中，Smad-2/3的总表达似乎降低，因此我们用Smad-2和Smad-3特异性抗体对这些提取物进行了印迹。如所示图5DSmad-2在野生型和TNC阴性细胞中的表达相似，但在TNC阴性的细胞中Smad-3的表达显著降低，这完全解释了Smad-2/3在图5C类.复制印迹显示TNC-null细胞中全细胞Smad-3蛋白减少70±12%(n个= 4,P（P）<0.01），但Smad-2蛋白无变化。

我们还使用这些Smad-2和Smad-3特异性抗体来评估TGF-β刺激的这些蛋白质的核移位。如所示图5,E类和F类纯化细胞核的印迹显示，TGF-β暴露30分钟后，细胞核Smad-2减少30%，而细胞核Smad-3减少65%。这些发现表明，TNC-null小鼠肌成纤维细胞转化和胶原沉积受损可能是由于Smad-3表达减少以及Smad-2和Smad-3磷酸化和核移位减少导致TGF-β信号传导受损所致。

最后，我们研究了TNC-null小鼠Smad-3蛋白降低的机制。我们使用定量RT-PCR检测Smads-2、-3和-4以及TGF-β1、TGF-α2和TGF-γ受体的mRNA水平。图6A类显示了野生型和TNC-null细胞之间的折叠变化差异。正如预期的那样，Smad-3 mRNA在TNC-null细胞中下调了三倍(P（P）<0.001）至少部分解释了这些细胞中Smad-3蛋白的缺乏，而Smad-2和-4没有改变。有趣的是，TGF-β信号系统的非Smad成分，包括TGF-？和TGF-。

最近的研究表明，TGF-β和BMP途径的许多生理调节发生在通过泛素蛋白酶体系统降解受体和核或细胞质Smads（包括Smad-3）介导的蛋白质水平上(8,51).因此，我们检测了泛素蛋白酶系统的有效抑制剂MG-132对Smad-3蛋白水平的影响。如所示图6B类β-肌动蛋白标准化的Smad-3蛋白基线水平为野生型水平的30%，但与MG-132隔夜孵育后加倍(P（P）< 0.05).相反，暴露于MG-132的野生型细胞中Smad-3蛋白略有下降。因此，TNC似乎在RNA和蛋白质水平上调节Smad-3。