线粒体复合物III突变对复合物I的影响秀丽隐杆线虫

摘要

介绍

固态模型(1)线粒体膜内的线粒体呼吸链是半个世纪前提出的。在这个模型中，呼吸复合体被组装成多复合体结构，即超复合体。超复合体能够对衬底进行沟道化，因此有助于电子从一个复合体转移到下一个(2). 这与随机碰撞模型相反(三)，提出线粒体呼吸链的复合物作为单独的实体嵌入线粒体内膜中。单个复合物通过小的可移动电子载体、辅酶Q和细胞色素在功能上相互连接c（c）随着动力学研究表明辅酶Q的同质池行为，随机碰撞模型变得更为普遍接受(4)、不需要底物通道的电子传递速率，以及成功分离具有酶活性的单个呼吸复合物(三,5). 然而，含有络合物I、III和IV的超络合物结构已经通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）进行了研究，^三蔗糖梯度离心和单颗粒分析(6,7). Acin-Perez的最新研究等。(8)令人信服的是，当提供适当的电子供体时，超复合体是能够消耗氧气的功能单元。他们得出结论，超复合体实际上是线粒体的功能性呼吸单位体内Schagger和Pfeiffer(9)证明超复合体I·III·IV出现在蓝色天然凝胶（BNG）上，复合物IV的化学计量增加。他们将这些实体命名为S0–S4，其中数字表示超复合体中的复合物IV数量。

超复合体为在患者中观察到的电子传输链（ETC）的综合缺陷提供了逻辑解释。据估计，约30%的ETC疾病涉及多种复合物(10). 综合I·IV缺陷(11,–14)以及报告的多个I·III组合缺陷示例(15,–17). 在大多数真核生物中，复合物III由11个亚基组成(18,19)其中只有细胞色素b由线粒体基因组编码。复合物III的催化核心由细胞色素组成bISP（铁硫蛋白；Rieske蛋白）和细胞色素c（c）₁.细胞色素的大多数突变b导致孤立的复杂III缺陷。然而，细胞色素有一个子集b导致患者合并I·III缺陷的突变(15,–17,20)在哺乳动物细胞系中(21). 此外，细胞色素的丢失c（c）已报道导致细胞系中复合物I和IV的丢失(22). 根据这些发现，有人认为，复合物I的组装和稳定性需要完全组装的复合物III，无论是否具有功能。值得注意的是，ISP或细胞色素没有结构突变c（c）₁已在动物中报告。然而，人类患者的复杂III缺陷是由BCS1L突变引起的(23,–25)，ISP在初生复合体III中的伴侣(26,27). 目前尚无报告表明，配合物III中的缺陷会影响完全组装的配合物I的功能，而不会减少配合物I数量。

在秀丽隐杆线虫，两个不同的复合III突变体赋予有趣的表型。网络服务提供商-1改变ISP头部结构域中高度保守的氨基酸（P225S）残基。Hekimi及其同事(28)报告说网络服务提供商-1表现出低氧消耗、对活性氧的敏感性降低、寿命延长和胚胎发育延迟。一个突变(ctb-1型)在复合物III亚基细胞色素中bA170V被发现是isp-1。isp-1；ctb-1型与相比，发展速度有所提高isp-1型(28). 然而，这种表型改善的分子原因尚不清楚。

我们在这里表明，由ISP突变引起的复合物III的结构缺陷可以减少完全组装的复合物I的数量，而不会减少完全组装复合物III数量。此外，我们证明ctb-1型可以减少复数I函数，而不会减少完全组装的复数I的数量或复数I在超复数中的分布。此外，我们还发现isp-1；ctb-1型与…相比网络服务提供商-1单独使用并不源于复杂III功能的改善。将第二个突变亚基引入复合物III中，对复合物I产生了有益的变构效应。此外，这种双突变增强了超复合物I·II·IV的弱结合，从而改变了BNG上超复合物的组成。在模型系统中观察到的复杂I和III相互依赖的详细机制表明，超复杂在调节复杂I和复杂III的固有酶活性中起着主要作用。ETC各成分之间相互依赖的复杂性对诊断多个复合物缺陷患者具有重要意义。

实验程序

线虫、培养和线粒体分离

所有菌株均来自隐杆线虫病遗传中心。隔离ctb-1型,isp-1（qm150）；ctb-1（qm189）雌雄同体杂交到N2雄性。F1被允许自交，F2动物被单独培养。克隆F3动物的DNA测序鉴定出ctb-1型100%同源突变。使用既定方案进行蠕虫准备和线粒体分离(29,30).

增长率

成年线虫在大肠杆菌然后移除OP50和。孵化日被定义为生命的第0天。成年的第一天是通过盘子上鸡蛋的外观来记录的。所有研究均在20°C下进行。

下蛋

成年后，在产卵之前，立即将25-30条成年线虫转移到新的培养皿中，让其产卵。每24小时将蠕虫转移到新的盘子中，在取出成虫后对虫卵进行计数。

极谱法和ETC分析

如前所述，测量完整线粒体的耗氧量和线粒体酶复合物活性(31,32).

BN-页码

如前所述，对BN-PAGE中的呼吸复合物进行BN-PAGE和凝胶内活性（IGA）染色(32). 使用配有分子量截止值为3.5 kDa的透析膜（杰拉德生物技术公司，俄亥俄州牛津）和所述电极缓冲液的管，对BN-PAGE超络合物进行电解(33). 将含有I·III和I·III·IV超复合物的BNG带从凝胶中切除，转移到电洗脱管中，然后将其浸没在含有电极缓冲液的电泳装置中。在4°C的300 V下进行电洗脱。3小时后从试管中收集洗脱液，并保存在冰上，以便立即测定酶活性。

二维BN/hrCNE

按照先前制定的方案，对BN-PAGE凝胶条进行双向BN-PAGE/高分辨率透明天然电泳（BN/hrCNE）(34)稍作修改。将从一维BNG上切下的垂直凝胶条水平放置在3.5-11%天然梯度聚丙烯酰胺凝胶上。运行第二维度的阴极缓冲液含有0.05%的脱氧胆酸和0.02%的十二烷基麦芽糖苷。在4°C、125 V下进行电泳15 h。如前所述，进行复合物I IGA和复合物IV IGA、考马斯蓝染色和银染色（彩色银染色试剂盒，赛默飞世尔科学公司）(32).

BNG天然蛋白质的电印迹（Native Western Blots）

如前所述，将BNG分解的超复合物转移到PVDF膜上(33). 用5%脱脂牛奶在磷酸盐缓冲盐水/Tween 20（0.05%）中封闭膜，并用单克隆抗体孵育，如下所述。

蛋白质组分析

使用LTQ Velos MS与Eksigent 1D-plus纳米液相色谱耦合，通过LC/MS分析BNG中的ISP-A、-B和-C。将BNG切片的每个凝胶内胰蛋白酶消化液20μl注入反相柱（Magic C18 200 A，Michrome Bioresources，Auburn，CA）中，并在固定相中以3μl/min（5%乙腈）的流速洗涤10分钟在10 cm反相分析柱（HALO C18，Michrom Bioresources）上以300 nl/min在10–50%或10–70%乙腈的30分钟梯度上分离之前。MS光谱以数据相关模式收集，每次完整扫描后进行10个最强烈离子的MS扫描。MS峰值列表使用Xcalibur软件（Thermo Fisher Scientific）和ReAdW生成MzXML格式的峰值列表。根据秀丽线虫使用搜索算法X！串联，全胰蛋白酶特异性，2.5 Da质量精确度。以1%的全局错误发现率作为蛋白质鉴定的基础。使用参考文献中概述的方法和工具进行蛋白质鉴定。35.BNG上其他波段的标签（S0、I、III₂、V、，等）应用于之前发表的野生型线粒体BNG的蛋白质组分析(32). 根据BNG上的尺寸推断出超配合物I·III·IV（标记为S1–S4）的不同化学计量，并与中所示的结果相证实图5.

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图5。

二维BN/hrCNE分离野生型和复合III型突变超复合物的能力。 一超复合物解离区域的二维凝胶考马斯染色。B类，凝胶副本的银染一从第二维度的420-kDa区域切割而成。此尺寸与IV相同₂.C类，络合物IV的量₂，通过条带密度扫描测量a–d在里面B类，相对于单体复合物V的考马斯染色量。误差线表示三个独立实验的平均值±S.E。安星号表示统计显著性为第页与野生型相比<0.05。

Western Blot分析

用12%SDS-PAGE分离25μg线粒体蛋白并转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶在磷酸盐缓冲盐水/Tween 20（0.05%）中封闭膜，然后用以下单克隆抗体（线粒体、尤金、OR）孵育：抗复合物I亚基NDUFS3（NUO-2秀丽线虫)（MS112），抗复合体IV亚单位I（MS 404），抗细胞色素c（c）（MSA06）、抗腺苷核苷酸转运体（MSA02）、抗复合体III亚单位Rieske（MS305）和抗核2（这两种都是Mitosciences赠送的礼物）。二级抗体来自圣克鲁斯生物技术公司。化学发光底物（SuperSignal West Pico，Thermo Fisher Scientific）用于开发反应。

蛋白质/蛋白质复合物的定量

通过对基于洋地黄素和基于Triton X-100的BNG的复合物I IGA染色的密度测定扫描，量化每个基因型中复合物I的数量。将这些测量值归一化为总复合物V的考马斯染色的密度扫描。通过对洋地黄基BNG中的复合物IV IGA进行密度扫描，对复合物IV进行定量，也归一化至总复合物V的考马斯染色。利用抗Rieske单克隆抗体探测的基于洋地黄的BNG的天然蛋白质印迹定量复合物III，然后将其归一化为针对复合物V探测的重复天然蛋白质印记。完全组装的复合物III的数量是超复合物和二聚体（III）中复合物III光密度扫描的总和₂)表单。在所有情况下，至少扫描了三个凝胶。

结果

表型

所有孵化出来的复杂III突变体在产卵后24小时内都会孵化出来。然而，随后的发展速度受到了严重影响。野生型（N2）和ctb-1型在～3.5天达到成年。网络服务提供商-1和isp-1；ctb-1型从卵发育到成虫分别需要7.5天和5天。具体而言，N2和ctb-1型24小时网络服务提供商-1和isp-1；ctb-1型在N2中从L4发育到成年，isp-1；ctb-1型，以及ctb-1型在12小时内完成，而网络服务提供商-1L4级动物发育成成人还需要24小时(补充表S1).

复合III突变也会影响产卵量网络服务提供商-1<isp-1；ctb-1型<ctb-1型，大约=N2(补充表S1). 野生型在成年第二天产卵率最高，网络服务提供商-1，以及isp-1；ctb-1型。对于ctb-1型，最大产卵率为成年第三天(补充图S1).

线粒体综合呼吸

与野生型相比，所有复合III突变体的复合I和II依赖呼吸的状态3比率均显著降低。复合IV依赖呼吸速率网络服务提供商-1和isp-1；ctb-1型大于野生型(补充图S2). 总的来说，复杂III突变体中的线粒体呼吸与复杂III缺陷一致。

呼吸酶复合物活性

复合物III（抗霉素A敏感的癸基喹啉·细胞色素）大幅减少c（c）还原酶）活性网络服务提供商-1(图1一)是发育速度最慢的突变体。令人惊讶的是，在isp-1；ctb-1型，尽管与网络服务提供商-1.复合物III活性ctb-1型大于网络服务提供商-1或isp-1；ctb-1型但仍显著低于野生型。与N2相比，所有复合物III突变体均表现出显著降低鱼藤酮敏感复合物I（NADH-癸基辅酶醌还原酶）活性(图1B类). 然而，两者的复杂I活动isp-1；ctb-1型和ctb-1型与网络服务提供商-1NADH-铁氰化物还原酶活性仅在网络服务提供商-1，而isp-1；ctb-1型和ctb-1型具有正常的NADH-铁氰化物还原酶活性(图1C类). 综合I–III活动(图1D类)在所有复合III突变体中显著低于野生型，与复合III缺陷一致。络合物II–III活性isp-1；ctb-1型显著低于野生型(图1E类). 复合物III突变体中的复合物II活性正常(图1F类). 尽管复合物IV活性的绝对值较高，但与任何复合物III突变体中的N2活性相比没有显著差异(图1G公司). 总之，我们在isp-1；ctb-1型与…相比网络服务提供商-1改进了复杂I功能。

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图1。

复合III突变体和野生型的呼吸链酶活性。 一，复合物III的酶活性(CIII公司).B类，复合物I的酶活性。C类，NADH-铁氰化物还原酶的酶活性。D类，复合物I–III的酶活性。E类，复合物II–III的酶活性。F类复合物II的酶活性。G公司复合物IV的酶活性(考克斯). 数据表示为四到八个独立蠕虫培养物的平均值±S.E.。*和#，统计显著性为第页与野生型和网络服务提供商-1分别为。CII公司，复合体II；CI公司，复合物I；保护、蛋白质；非金融风险，NADH-铁氰化物还原酶。

完全组装的呼吸复合物的数量

根据Triton X-100基和洋地黄基BNG测定完全组装复合物I的数量，如图2一和​和3三B类（参见“实验程序”）。作为负载控制，将超复合体中复合体I的数量标准化为复合体V的总量，并表示为相对于野生型的折叠变化。在复合III突变体中，只有网络服务提供商-1完全组装复合物I的数量减少，为N2的50%(图2C类).

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图2。

呼吸酶复合物。 一，基于Triton®声波风廓线仪X-100的BNG以隔离形式展示了完全组装的复合物I(我)以超复杂的形式(I： 三). 复合物I IGA在重复凝胶中进行。B类，天然西方印迹(西部土著)用抗Rieske单抗探测(左边)或抗ATP酶亚单位Va单克隆抗体(正确的，重复凝胶中的加载控制）。第0期，超复合体I·III；S1、一、三、四₁; S2、I·III·IV₂; S3、I·III·IV_三; S4、I·III·IV₄.C类定量分析完全组装的配合物I、III和IV的数量。配合物I和IV通过BNG上IGA的密度测定扫描进行测量，配合物III通过天然Western blot的密度测定扫查进行测量。所有值均归一化为复数V（见“实验程序”）。数据表示为三到四个独立实验的平均值±S.E。安星号表示统计显著性为第页与野生型相比<0.05。

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图3。

复合III突变体中基于洋地黄苷的BNG-PAGE。 一考马斯染色。B类，复杂I IGA。C类，复合IV IGA。D类(左边)、N2凝胶切片的考马斯染色和网络服务提供商-1并列比较，以揭示ISP-A和ISP-B，它们仅出现在isp-1。D类(正确的)，使用抗NDUFS3单克隆抗体进行天然蛋白质印迹，以更好地可视化ISP-A、ISP-B和ISP-C。E类，超复合体I·III中复合体I的数量(第0期)和I·III·IV(S1–S4)从四个独立的基于洋地黄素的复合物I IGA中测量，并表示为它们之间的比率。误差线表示三个独立实验的平均值±S.E。安星号表示统计显著性为第页与野生型相比<0.05。

基于洋地黄的BNG的天然蛋白质印迹(n个=3）用抗Rieske单克隆抗体探测，以测量完全组装的复合物III图2B类.）突变体中完全组装的复合物III的数量与N2中相同(图2C类). 我们从二聚物IV的位置观察到另一个信号。该信号不包括在定量中，因为其分子量表明它是部分形成的III₂与二聚体复合物IV共迁移。使用复合物III核心2蛋白的抗体获得了相同的结果（数据未显示）。此外，我们通过对洋地黄素BNG凝胶内活性的密度测定扫描来量化完全组装的复合物IV的数量。复合物IV在任何突变体中都没有显著增加(图2C类，以及​和3，三,A–C). SDS-PAGE的蛋白质印迹证实了我们从天然蛋白质印迹得到的结果(补充图S3和表S3).

isp-1对超复合体的影响

网络服务提供商-1基于洋地黄的BNG中I·III和I·III·IV超复合物的数量减少(图3,A–C). 三₂在网络服务提供商-1比N2中(图3,一和D类)，与天然蛋白质印迹分析一致(图2B类).

考马斯染色和基于洋地黄素的BNG的Western blot显示网络服务提供商-1野生型线粒体中不易识别的(图3D类). 这些带被标记为ISP-A、ISP-B和ISP-C。ISP-A和ISP-B的成分通过质谱鉴定(补充表S2)由复合物I、III和IV的亚单位组成。根据我们的蛋白质组数据，ISP-A没有复合物I IGA(图3B类)，表明它缺乏复合物I的N模块（NADH氧化酶模块，参见(36)查看）。类似地，ISP-B是一种由大多数P模块（质子泵模块，亚复合物Iβ）组成的中间产物（参见参考文献。36)和Q模块（辅酶Q还原模块，参见参考文献。36)由NDUFS3亚单位的存在决定(图3D类,右侧面板). 由于ISP-C与IV极为接近，因此其没有质谱特征₂但最有可能的是Q和P模块合并到一个子复合物中，这取决于它的大小和NDUFS3亚单位的存在(图3D类,右侧面板).

复合物III突变体的超复合体谱

因为减少了isp-1；ctb-1型和ctb-1型不是由于复合体I的数量减少，我们询问它们的超复合体分布的变化是否可能是复合体I缺乏的原因。在哺乳动物线粒体中，I·III型复合体I的活性远低于超复合体I·III·IV(37). 根据我们之前的野生型蛋白质组数据和复合物I和IV的凝胶内活性染色推断出了鉴定结果(32).isp-1；ctb-1型显示了I·III超复合物的增加量和I·III·IV超复合物减少量，这是由基于洋地黄苷的BNG的光学密度扫描测定的（代表性凝胶图3,一和B类和中的量化E类). 相比之下ctb-1型在各个方面都与野生型完全相同(图3E类).

电洗脱超复合体的复I函数

复合物I活性降低ctb-1型不能用复合物I总量或复合物I·III·IV与复合物I总数之比的降低来解释。然而，正如哺乳动物线粒体一样(37)从BNG中电洗脱后，I·III·IV超络合物中的络合物I的活性显著高于来自N2的I·III超络合物的络合物Ⅰ。I·III超复合体中的复合体Iisp-1；ctb-1型和ctb-1型和野生型一样活跃。然而，令人惊讶的是，I·III·IV中的复杂I超复杂isp-1；ctb-1型或ctb-1型活性明显低于N2(图4).

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图4。

超复合体I·III和I·III·IV中的复合体I活性。电洗脱的I·III和I·III·IV超复合物测定复合物I(CI公司)和NADH-铁氰化物还原酶(非金融风险)活动。数据表示为四个独立实验的平均值±S.E。安星号表示统计显著性为第页< 0.05.

超复数的稳定性

如果超复合体的组成部分因亚基改变而移位，那么超复合体可能比正常情况下更容易解离。十二烷基麦芽糖苷解离了isp-1；ctb-1型和ctb-1型从一维凝胶（洋地黄素处理）到二维更小的超复合物(图5一,中间的和右侧面板). 一维凝胶中的原始S4部分分解为三个较小的超复合物，其分子量与从一维凝胶中迁移的原始S3、S2和S1相当。类似地，S3、S2和S1部分解离，得到较小的超络合物。凝胶内染色显示，所有分离的超复合体对复合体I呈阳性染色（数据未显示）。银染色显示出第二维度的一条带(图5B类)二聚体复合体IV的预期大小，低于较小的非缔合超复合体。在野生型线粒体中，解离的超复合物和二聚体IV也出现在第二维度，但没有达到突变体的程度(图5,一和B类). 络合物IV数量的定量测量₂（归一化为络合物V的量）表明，在isp-1；ctb-1型和ctb-1型，与野生型相比(图5C类).

讨论

我们已经证明，在线虫中，复合物III的初级变化可以显著影响复合物I的功能。这可以在不减少复合物III数量的情况下发生(网络服务提供商-1)或超复合体中复合体I的数量或分布(ctb-1型).

最初，我们假设isp-1；ctb-1型,ctb-1型会抑制网络服务提供商-1(28)通过恢复复合体III的活性。令人惊讶的是，与网络服务提供商-1，复合物III活性isp-1；ctb-1型没有被抑制突变所改善ctb-1型相反，复合物I活性得到改善，这是我们能够测量到的线粒体功能的唯一改善。我们的结果表明，配合物I和III之间的变构相互作用是ctb-1型严重发育表型的抑制isp-1型.

从L3到L4和L4到成人的发育伴随着线粒体DNA含量的急剧增加(38,39)这与细胞能量消耗增加有关(39).网络服务提供商-1和isp-1；ctb-1型在L3–L4的时间是原来的两倍ctb-1型或野生型，意味着线粒体缺陷isp-1型和isp-1；ctb-1型每个都比ctb-1型。这些结果得到了以下因素的证实：网络服务提供商-1和isp-1；ctb-1型。有趣的是，尽管ctb-1型发育速度相同，产卵量与野生型相似(补充表1)其最大产卵率比野生型晚1天。这是在ctb-1型我们将其解释为轻度线粒体缺陷。

这个网络服务提供商-1我们研究的等位基因是一种高度保守的脯氨酸的丝氨酸取代，它位于ISP的头部结构域(18). 这种脯氨酸残基已被证明对[2Fe-2S]簇的二级结构至关重要，因为它使紧邻链β5的Rieske头部结构域主干向内折叠(40). 这种氨基酸变化可能通过改变[2Fe-2S]残基的位置而对ISP的氧化还原特性产生负面影响，并显著阻碍复合物III的活性。此外，P146L替换（相当于网络服务提供商-1我们研究中的蠕虫等位基因）酿酒酵母被发现改变了[2Fe-2S]簇的中点电位(41). 因此，不出意料地观察到网络服务提供商-1突变体。isp-1（qm150)是ISP本身缺陷影响动物复合体III功能的第一个例子。据报道，所有与ISP相关的动物的复杂III缺陷都是由BCS1L突变引起的(23,–25)，一种参与ISP合成的伴侣蛋白。

这个ctb-1型突变是细胞色素螺旋αD N端的保守丙氨酸到缬氨酸的替换b在电子转移期间，靠近Rieske头部域的对接位置（螺旋αC、螺旋αcd1和环EF(18). 突变的丙氨酸不是高度保守的残基，可能不会显著改变细胞色素的构象b因此，复合物III活性的降低并不奇怪ctb-1型不像在网络服务提供商-1。此外ctb-1型和网络服务提供商-1突变并不紧密(18,19)而且预计不会直接相互作用。因此，这两个突变不能结合修复复合III功能可能并不奇怪。所有复合物III突变体具有正常数量的完全组装复合物III，但复合物III活性降低，包括ctb-1型显著影响复合III功能。

仅限网络服务提供商-1与N2相比，完全组装的复合物I数量减少，这无疑导致其复合物I活性降低。复杂I活动isp-1；ctb-1型尽管具有正常数量的复合物I，但相对于N2而言，复合物I的活性降低。然而，我们已经表明，复合物Ⅰ在I·III·IV超复合物中通常比I·III形式中更为活跃，如在牛心脏中(37). 因此，在双突变体中，与超复合物I·III相比，超复合物Ⅰ·III·IV的数量减少可能是复合物I活性降低的原因，正如在秀丽线虫(32). 它很可能代表了ctb-1型超复合体内的复合体IV结合（见下文）。然而，与之相比，双突变体中总复合物I的增加量足以改善复合物I功能网络服务提供商-1独自一人。

ctb-1型尽管超复合物I·III和I·III·IV呈野生型分布，复合物I数量正常，但复合物I活性降低。因此，ctb-1型以最活跃的形式，即I·III·IV超复合体，对复合体I产生负面影响。最简单的解释可能是，这种突变改变了超复合体I·III·IV的构象，使得复合体IV与超复合体的结合不那么紧密，从而使复合体I的活性降低到其I·III形式的酶促速率。如果是这样，超复合体Ⅰ·III相对于Ⅰ·III·Ⅳ的比例增加isp-1；ctb-1型可能反映了ctb-1型在双突变体中，双突变体的活性与ctb-1型.

我们假设，如果复合物III以这种方式改变了I·III·IV超复合物组分之间的相互作用，我们可以检测到超复合物解离的脆弱性增加。与野生型相比，这两个复合物III突变体更容易从超复合物（S1–S4）中丢失复合物IV。此外，S4部分分解成较小的超复合体，其分子量与S3、S2和S1相当，这表明，正如我们最初推断的那样，S4是超复合体I·III·IV₄包含复合体IV的四个拷贝。野生型超复合体抵抗了与任一复合体相关的离解isp-1；ctb-1型和ctb-1型这表明这两个突变产生了破坏超复杂完整性的构象变化。

我们如何将复杂III突变改变超复合体从而使复杂IV放松对超复合体I·III·IV的控制并降低复杂I活性的发现联系起来？根据超复合体I·III·IV的当前三维图，复合体III和IV支撑着复合体I的膜臂(37)综合设施I的质子泵机械被认为位于那里(42,43). 基质臂中的NADH·辅酶Q还原酶通过构象耦合为质子泵提供驱动力(43,–45). 构成质子泵机制核心的复合体I膜臂中ND亚基同源物的突变导致复合体I活性降低，但NADH-铁氰化物还原酶活性正常(46,–49). 复合物IV与突变体中超复合物的其他组分之间的松弛相互作用可能导致质子泵模块的不完美构象和功能障碍，从而阻碍基质臂中的NADH·辅酶Q还原酶。类似的逻辑可以解释为什么野生型超复合体I·III中的复合体I不如野生型超复合物I·III·IV中的复数I活跃。

正如预期的那样，复合III缺陷影响复合I和复合II依赖性呼吸；在所有突变体中，复合IV呼吸增加，在网络服务提供商-1和isp-1；ctb-1型尽管在这些突变体中复合物IV的数量没有变化。细胞色素c（c）氧化酶控制线粒体能量代谢(50,51)通过充当线粒体外ATP/ADP的传感器(52). 如复合体III突变体中预期的那样，低ATP/ADP比率可能会增加复合体IV驱动的呼吸。然而，与野生型相比，在ETC分析中，复合物III突变体的复合物IV活性没有显著增加。由于线粒体膜在ETC分析中溶解，因此消除了菌株之间的ATP/ADP差异。Yang和Hekimi最近的一项研究(53)证明复合物I–III和复合物II–III的酶活性降低网络服务提供商-1，尽管复合物II–III的速率比复合物I–III受到抑制更多。这与我们的数据在性质上不同。他们没有测量复杂III活性就其本身而言或复合物I活性，所有速率均归一化为柠檬酸合成酶。很难将我们的研究技术与Yang和Hekimi的研究技术进行比较(53)，因此它们之间的差异无法完全解释。

我们还确定了BNG中的三个独特带网络服务提供商-1可能代表复杂I组装或降解中的中间体。当前的超复合体组装模型提出，复合体I的亚复合体Iβ首先与部分组装的复合体III和IV相关联，从而形成成熟超复合体形成的模块(36). ISP-A代表一个几乎完整的亚复合物，由已经与ND4/ND5中间体结合的P和Q模块以及部分组装的复合物III和IV组成。这表明ISP中的突变在加入NADH氧化酶模块（N模块）之前的最后一步阻止了超复合物的成熟。反过来，两个较小的中间产物积累，ISP-B（830-kDa中间P/Q络合物，带有部分组装的络合物III和IV）和ISP-C（可能是一个400-kDa的中间产物，由Q模块和早期形式的P，即膜臂组成）。尽管我们看到的谱带很好地对应于复杂I的拟议组装模块，但我们并不排除它们可能代表超复杂的退化步骤。

复合物I和III之间的物理联系被认为涉及复合物III的ISP以及复合物I的Q模块的NDUFS2和NDUFS4亚基。这些复合物I亚基中的错义突变降低了复合物III的水平(54). 因为isp-1（qm150)改变蛋白质高流动性外围结构域中的氨基酸，很难想象这会如何改变复杂的I-III相互作用。然而，这种变化很容易影响超复合体的组装或稳定性，从而导致复合体错位。异常子复合体的出现网络服务提供商-1BNG支持这种模式。

有趣的是ctb-1型改进了网络服务提供商-1背景不影响复杂III功能。复合物III亚基对复合物I的影响代表了一种变构机制，其中催化核心亚基可以调节超复合物的组装(网络服务提供商-1)，超复数的比率(isp-1；ctb-1型)或复数I电子在超复数的正常量和分布面上的流动(ctb-1型). 这是第一次报道复合物III突变，它可以以这种方式影响复合物I。

这项研究为超复合体在ETC缺陷中的作用提供了新的见解。复合物I和III具有复杂的结构和变构相互作用，揭示了线粒体呼吸体不同复合物之间复杂的相互关系(9,15). 线粒体疾病患者的诊断显然存在问题，必须考虑到ETC中可能由单一突变引起的无数后果。显然，ETC单个亚单位的缺陷会对线粒体功能产生广泛和意料之外的影响。

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参考文献