Bcl-6和NF-κB池蛋白介导天然免疫反应的反向调节

Bcl-6–NF-κB顺反流拮抗作用

考虑到Bcl-6顺反子的动态性质，我们的注意力回到了与NF-κB的潜在交叉以及重叠顺反子相互调节的可能性。为了支持这一观点，LPS刺激的BMDM中Bcl-6 ChIP序列DNA的基序分析，如静止巨噬细胞中的一样，确定了得分最高的NF-κB共识基序，以及Bcl-6本身和髓系先锋因子Pu.1的基序（补充图2E）。为了检测“基因组串扰”的可能性，我们首先需要建立NF-κB池蛋白。以p65作为活性NF-κB复合体的标志，在静止的骨髓基质干细胞中仅发现164个结合位点，可能是由于未刺激细胞中的细胞质隔离所致。然而，NF-κB基序在ChIP序列DNA中最丰富（补充图3A）。令人印象深刻的是，虽然LPS处理显著降低了Bcl-6池色素沉着，但它反过来增加了NF-κB的结合，达到31000个以上的峰值(图2A)，其富含NF-κB和Pu.1的基序（补充图3B）。与Bcl-6一样，NF-κB主要定位于启动子远端位点，启动子结合仅占其池蛋白的10%(图2A). 与其在免疫、发育和体内平衡方面的广泛功能相一致(海登和戈什2004)，以ChIP-seq识别的NF-κB结合位点注释的基因在炎症相关的功能通路中广泛分布（23%）；细胞骨架和细胞粘附（19%）；细胞信号（18%）；分化、凋亡和癌症（15%）；代谢（9%）；和其他各种功能（16%）(图2C). 当我们检测NF-κB和Bcl-6之间的调节关系时，进一步揭示了Bcl-6号机组基因本身。在LPS刺激后，p65结合以分布方式出现在50 kb区域内和侧面Bcl-6号机组基因，证实Bcl-6号机组是一个直接调控的NF-κB靶点（补充图3C）。因此，Bcl-6是一种基础和诱导性抑制剂，可对抗NF-κB定向调控。

在进一步探索Bcl-6和NF-κB相互调节的方面时，我们观察到数千个NFκB和Bcl-6位点在一个核小体窗口（200个碱基对）内共定位，共有2422个位点与Bcl-6与NF/κB共现结合（补充图3D）。这些Bcl-6/p65位点分别占Bcl-6刺激或静止池的45%和32%(图2A). 尽管两者结合起来仅占NF-κB池蛋白的8%(图2A)，Bcl-6/p65核小体模块对LPS转录程序显得尤为重要。由于NF-κB p65是Tlr4信号的关键转录介质，我们将基于ChIP-seq数据的p65结合位点注释的基因与LPS改变表达的基因进行了比较。NF-κB p65注释为LPS刺激诱导或抑制的基因>70%(图2D). 令人惊讶的是，Bcl-6/p65模块在差异表达的LPS靶基因（626个基因）中严重过度表达(图2D（左），特别是在那些由脂多糖诱导的人群中。相比之下，只有一小部分（80个基因）NF-κB非依赖性Tlr4定向基因程序包含可指定的Bcl-6-结合位点(图2D，右侧）。因此，尽管Bcl-6/p65位点仅占NF-κB p65池蛋白的8%(图2A; 补充图3D），Bcl-6/p65位点出现在25%的Tlr4–NF-κB控制的基因网络中，总跨度为18%的Tlr 4应答基因(图2D). 重要的是，Bcl-6/NF-κB模块的功能分析揭示了在炎症途径中特别丰富的基因（47%）(图2C). 因此，Bcl-6和NF-κB之间的实质性近端融合表明，池重叠可能是Bcl-6限制NF-κ的B导向巨噬细胞炎症反应程度的有效方式。有趣的是，BCL-6也被报道在弥漫性大B细胞淋巴瘤中抑制NF-κB活性，这增加了BCL-6–NF-κ）B顺反流拮抗作用在其他细胞类型中可能很重要的可能性(Perez-Rosado等人，2008年).

通过检测其对包括Il-1在内的关键炎症靶基因的潜在影响，进一步说明了所提议的顺反流拮抗作用的基础(图3A)和Ccl2/Ccl7/Ccl11（补充图4A）基因簇。这些测序轨迹的可视化显示，在没有刺激的情况下，Bcl-6与巨噬细胞增强子的多因素和组蛋白标记形成共定位关系，包括Pu.1、p300、RNA聚合酶II（pol II）、单甲基化H3K4和组蛋白乙酰化岛(Heintzman等人，2007年;Visel等人，2009年;Ghisleti等人，2010年;Heinz等人，2010年)而NF-κB p65的检出率最低。在LPS刺激3小时后，沿着Pu.1标记的增强子检测到强大的NF-κB占用，p300同样被诱导招募到许多（即Il-1α）(图3A)，但并非所有NF-κB结合位点（即Ccl2）（补充图4A）。ChIP qPCR分析显示野生型或敲除型细胞中p65和p300的占有率相似（补充图4B，C）。或者，在LPS暴露后，Bcl-6随这些基因的变化而减少，但没有完全丢失(图3A; 补充图4A）。总之，这些研究结果表明，Bcl-6和NF-κB通过与增强子区域的近端结合发挥作用，在Tlr4刺激后，它们分别相互减弱或增强。

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图3。

ChIP-seq和表观遗传学分析揭示了炎症基因的Bcl-6和NF-κB协同调节。(一)ChIP-seq沿着Il-1基因簇追踪未刺激BMDM中乙酰化H3、单甲基化H3K4（H3K4me1）和RNA聚合酶II（RNA pol II），以及未刺激或LPS刺激（100 ng/mL，持续3小时）BMDM中p300、Pu.1、NF-κB p65和Bcl-6。对于有LPS暴露和无LPS暴露的因素排序，轨迹高度标准化为对齐读取数。(B类,C类)乙酰化H3归一化为H3的ChIP qPCR(B类)，以及在Bcl-6/p65结合位点暴露于或不暴露于LPS（100ng/mL，3小时）的野生型和敲除型BMDM中相对于输入染色质的Hdac3富集(C类). 列出了Bcl-6-结合位点相对于转录起始位点的注释基因名称和位置。36b4是一个阴性对照DNA区域，缺乏Bcl-6或p65结合位点。数值表示为平均值±标准偏差。使用单向方差分析和Tukey多重比较测试进行统计测试。(+)P（P）< 0.05; (#)P（P）< 0.01; (*)P（P）< 0.001. 乙酰化有显著差异(B类)或Hdac3富集(C类)相对于非模拟野生型BMDM，除非括号中另有说明。

接下来，我们通过比较野生型和敲除型BMDM中H3K4单甲基化和H3乙酰化状态以及组蛋白修饰因子对Bcl-6/p65结合位点的补充，探讨了Bcl-6和NF-κB拮抗的表观遗传学意义。H3K4单甲基化是增强子的标志性标记，受Bcl-6或LPS刺激的影响最小（补充图5A、B）。相反，ChIP qPCR证明Bcl-6的缺失在这些位点引起持续的高乙酰化(图3B; 补充图5C，橙色和红色列）。在LPS暴露后，我们还观察到野生型和敲除型BMDM中细胞因子基因附近的组蛋白H3和H4显著丢失（补充图5D；数据未显示）。这些观察结果表明，急性激活可能促进沿着增强子的Bcl-6/p65结合位点的核小体失稳，类似于在其他位点观察到的TLR诱导的重塑(Ramirez-Carrozzi等人，2006年). 因此，我们发现敲除BMDM中Bcl-6/p65位点的乙酰化H3密度增加，特别是在LPS刺激的敲除细胞中（例如，Il-1-和Il-6-结合位点），尽管不是普遍存在(图3B). 与乙酰化的这些变化类似，LPS暴露导致组蛋白乙酰转移酶p300在许多炎症基因附近诱导结合（补充图4C）。与这种酶活性相反，Hdac3，而不是Hdac1或Hdac2，被发现以Bcl-6-依赖的方式出现在Bcl-6/NF-κB结合位点，并被LPS刺激增强(图3C; 数据未显示）。总之，这些发现表明，Bcl-6表达模块通过限制基础组蛋白和Tlr诱导的组蛋白乙酰化来限制NF-κB和p300的激活。

定义在正常条件下维持炎症基因处于反应但抑制状态或解决急性炎症反应的遗传机制，是确定先天免疫反应中的检查点以及设计治疗炎症疾病的新方法的关键。在这里，我们确定了转录阻遏物Bcl-6在维持巨噬细胞静止和限制炎症反应强度方面的一个先前未知但不可或缺的作用，其作用是通过以顺反子为基础的NF-κB拮抗作用实现的。Bcl-6抑制和NF-κB激活的池是动态的，Bcl-6的缺失通过Hdac3的缺失和p300活性的缺失导致炎症前去抑制和对LPS刺激的超敏反应(图4，上部通道）。这些发现表明，NF-κB和Bcl-6顺反子之间的动态平衡通过将对立的表观遗传调控因子共定位到共享的核小体结构域来调节先天免疫反应(图4，下部通道）。

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图4。

炎症控制中的巨噬细胞Bcl-6模型。Bcl-6通过组蛋白去乙酰化在炎症基因增强子处的转录抑制抑制炎症反应，靠近Tlr4刺激后NF-κB和组蛋白乙酰转移酶p300诱导结合的位点。在TLR信号的设置中，Bcl-6及其共抑制物Hdac3的丢失导致NF-κB转录激活和炎症反应的无对抗性。

ChIP和ChIP序列

按照其他说明进行ChIP分析(Nelson等人2006)经过修改。有关详细信息，请参阅补充材料。使用生物三倍体和补充表8中列出的引物进行ChIP qPCR分析。对于ChIP-seq，用抗IgG顺磁性小球（Invitrogen）沉淀染色质-抗体复合物。根据制造商说明制作文库，并使用Illumina基因组分析仪II进行测序。补充材料中描述了分析。