科学信号。作者手稿；PMC 2010年12月8日提供。
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美国国立卫生研究院：NIHMS248877
H（H）2通过蛋白质S-硫酸化的S信号
,1 ,2 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,三 ,三和1,2,4,*
阿西夫·穆斯塔法
1所罗门·H·斯奈德美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院神经科学系，邮编：21205
莫塔兹·加达拉
2美国马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯大学医学院药理学和分子科学系21205
尼尔坎塔·森
1所罗门·H·斯奈德美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院神经科学系，邮编：21205
金赛云（Seyun Kim）
1所罗门·H·斯奈德美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院神经科学系，邮编：21205
Weitong Mu公司
1所罗门·H·斯奈德美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院神经科学系，邮编：21205
萨迪娅·加齐
1所罗门·H·斯奈德美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院神经科学系，邮编：21205
罗珊·巴罗
1Solomon H.Snyder美国马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯大学医学院神经科学系21205
广东洋
三加拿大安大略省雷湾湖滨大学生物系P7B 5E1
王瑞（Rui Wang）
三加拿大安大略省雷湾湖滨大学生物系P7B 5E1
所罗门·H·斯奈德
1所罗门·H·斯奈德美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院神经科学系，邮编：21205
2美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院药理学和分子科学系，邮编21205
4美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院精神病学和行为科学系，邮编：21205
1所罗门·H·斯奈德美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院神经科学系，邮编：21205
2美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院药理学和分子科学系，邮编21205
三加拿大安大略省雷湾湖滨大学生物系P7B 5E1
4美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院精神病学和行为科学系，邮编：21205
- 补充资料
补充材料：图S1。蛋白质S-硫水合的改良生物素开关分析。图S2。非PLP-结合CSE突变体不具有催化活性。
图S3。改良的生物素开关试验对硫水合反应具有特异性。
图S4。L-半胱氨酸水平在野生型和CSE公司−/−肝脏。
图S5。野生型和哥伦比亚广播公司−/−肝脏显示类似的H2S生产。
图S6。GAPDH在CSE和L-半胱氨酸的无细胞催化过程中基本上是亚硫酸化的。
图S7。半胱氨酸的GAPDH硫水合作用150使用LC-MS/MS。
图S8。H（H）2硫水合物对HEK293细胞ATP敏感的钾通道。
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摘要
硫化氢（H2S） 胱硫醚γ裂解酶产生的信使分子，作为生理性血管舒张剂。H的机制2S信号一直难以捉摸。我们现在显示H2S通过硫水合作用在生理上修饰大量蛋白质中的半胱氨酸。大约10%到25%的肝脏蛋白质，包括肌动蛋白、微管蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），在生理条件下是含硫的。硫水合增加GAPDH活性并增强肌动蛋白聚合。因此，硫水合作用似乎是蛋白质的一种生理翻译后修饰。
简介
一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）气体是影响各种生理过程的生理信使分子，包括血管舒张和神经传递(1). 最近的证据表明硫化氢（H2S） 还充当信使以引发冬眠状态(2)，抑制胰岛素信号(三)调节炎症(4)和血管口径(5). H（H）2S在生理上由L-半胱氨酸通过胱硫醚β合成酶（CBS）和胱硫苷γ裂解酶（CSE）生成。H（H）2S由血管形成，心脏在年被废除CSE公司−/−显示高血压和内皮依赖性血管舒张功能丧失的小鼠(6). H的分子机制2S影响其目标一直难以实现。NO生理S-亚硝酰化物不同蛋白质(7). 我们现在证明内源性H2生理S-硫水合物（SHY）蛋白（即将半胱氨酸-SH基团转化为-SSH）来调节其功能。亚硝基化似乎会降低半胱氨酸的活性，而硫水合似乎会增强半胱氨酸活性。然而，与亚硝基化类似，硫水合中的共价修饰会被还原剂（如二硫苏糖醇（DTT））逆转。鉴于蛋白质S-硫水合的高丰度，我们认为这种翻译后修饰可能影响多种生物途径。
结果
H（H）2S通过硫水合作用共价修饰半胱氨酸残基
S-硝基化可通过生物素开关试验检测，在该试验中，自由硫醇被高度特异的自由巯基反应化合物甲基甲硫磺酸盐（MMTS）阻断，该化合物不与亚硝化硫醇或任何其他形式的氧化硫醇相互作用(8,9). 然后用抗坏血酸处理选择性地暴露亚硝化硫醇，并用N个-（6-（生物胺基）己基）-3′-（2′-吡啶基二硫代）-丙酰胺（生物素-HPDP），一种与巯基相互作用的化合物。即使在没有抗坏血酸治疗的情况下，野生型和神经元型一氧化氮合酶（NOS）基因敲除的大脑中的蛋白质也有一些生物素标记(无操作系统−/−)动物，也许表明生物素转换测定法也在检测蛋白质S-硫水合作用(9). 我们选择研究肝脏中的硫水合作用，因为它会产生大量的H2S公司(4). 在没有抗坏血酸的小鼠肝裂解物中，我们使用生物素抗体检测到多个蛋白质的基础标记，在用H处理后标记更加显著和丰富2S前体硫化氢钠（NaHS）(和图S1A). NaHS处理后观察到的三个最显著的条带是甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（38 kD）、β-微管蛋白（55 kD）和肌动蛋白（43 kD），通过质谱鉴定，迄今为止已鉴定出39种含硫蛋白。用针对特定蛋白质的抗体进行探测，例如GAPDH、β-微管蛋白和肌动蛋白()，显示出比针对生物素的抗体明显更多的基础硫水合作用()，可能与特定蛋白质反应较少。DTT减少了二硫键，逆转了碱和NaHS诱导的硫水合作用，使MMTS能够阻止新释放的硫醇(). 这意味着改性是共价的，涉及巯基。MMTS相对于改性-SH基团对自由基相对选择性的原因尚不清楚。没有生物素HPDP的信号，表明基础信号不代表蛋白质的内源性生物素化(图S1B). 生物素HPDP与R-SSH反应产物的性质尚未确定；它可能是二硫化物或三硫化物。原则上，生物素HPDP也可以与多硫化物反应。由于含硫半胱氨酸具有高度反应性，它们可能会与分析溶液中的溶解氧发生相互作用。与这个概念一致，我们观察到使用氮气脱氧检测缓冲液可以增强肝脏中的基础硫水合信号(图S1C).
H（H）2S通过半胱氨酸残基的S-硫水合作用共价修饰蛋白质。(A类)用100μM NaHS在37°C下处理30分钟的肝脏裂解物，并用抗生物素抗体（抗生物素抗体）进行改良的生物素转换试验，以检测S-硫水合作用，显示出大量的硫水合蛋白质。(B类)（a）中的一组含硫蛋白质的LC-MS/MS鉴定出39种含硫蛋白质，包括GAPDH、β-微管蛋白和肌动蛋白。(C类)DTT处理（1 mM）10分钟可逆转GAPDH、β-微管蛋白和肌动蛋白的硫水合作用，这些作用是通过每个蛋白质的特异抗体检测到的，暗示着共价巯基修饰。(天)在用编码CSE的质粒转染的HEK293细胞中，暴露于5 mM L-半胱氨酸1小时会导致GAPDH、β-微管蛋白和肌动蛋白硫酸化，这是通过使用三种蛋白中每一种蛋白的特异性抗体的改良生物素开关试验进行评估的。催化失活的CSE不能使蛋白质硫化。
CSE是H的主要来源2肝脏中的硫生成(4–6). 在缺乏内源性CSE的人类胚胎肾（HEK）293细胞中，用表达野生型CSE的质粒转染，而不是非PLP（5′-磷酸吡哆醛）结合催化失活突变CSE，诱导GAPDH、β-微管蛋白和肌动蛋白的硫水合作用(和图S2). 肝脏表现出丰富的CSE，神经元NOS（nNOS）、内皮NOS（eNOS）和诱导型NOS（iNOS）的含量可以忽略不计，而大脑中nNOS和eNOS的含量相对丰富(图S3B). 此外，我们未检测到肝脏中GAPDH硫酸化的变化无操作系统−/−,电子NOS−/−、和iNOS系统−/−小鼠与野生型小鼠的比较(图S3A)，排除了改良生物素开关试验（即不含抗坏血酸的试验）中S-亚硝基化的任何参与，我们用于检测硫水合作用。因此，我们得出结论，大量蛋白质通过H被碱性硫水解2S在肝脏中产生。
硫酸化在生理上改变野生型蛋白质，但不改变CSE公司−/−动物
H（H）2年废除了血管生产硫CSE公司−/−老鼠(6). 我们现在展示一下CSE公司−/−肝脏不能产生H2S、 用H测量2S-选择性电极，与野生型肝脏相比，L-半胱氨酸浓度无明显变化(和图S4). 哥伦比亚广播公司对H的贡献并不显著2肝脏中的S代，因为哥伦比亚广播公司−/−小鼠显示H2与野生动物相似的S生产(图S5). GAPDH、β-微管蛋白和肌动蛋白的内源性硫水合作用在CSE公司−/−肝脏，表明这些蛋白质通过CSE活性在生理上被硫酸化(). 通过对改良生物素开关试验中的硫酸化样品进行密度分析，并对未进行该试验（“负荷”）的同等大小的溶出液等分试样进行相同的印迹，我们估计至少有10%至25%的肝GAPDH、β-微管蛋白和肌动蛋白是基本硫酸化的。其中，GAPDH显示出最高的基础硫水合作用，近25%的GAPDH被硫水合().
硫水合作用是一种生理性翻译后修饰，在CSE公司−/−动物。(A类)H的测量2H的S生产2S选择电极表明CSE公司−/−肝脏不能产生H2S.所有结果均以平均值±SEM表示***P（P）< 0.001. (B类)改良的肝脏生物素开关试验显示野生型中存在内源性GAPDH、β-微管蛋白和肌动蛋白的生理硫酸化，但没有CSE公司−/−动物。(C类)定量肝脏中基础蛋白硫水合作用的密度分析。数据是五到七个独立实验的平均值±SEM，代表性数据如（B）和（D）所示。(天)在37°C条件下，将CSE底物L-半胱氨酸的外源剂量增加培养30分钟，对肝裂解物进行改良的生物素开关试验，结果表明野生型中的硫水合作用呈剂量依赖性增加，而不是CSE公司−/−动物。未经处理的泳道代表内源性肝脏硫水合作用，显示GAPDH的信号明显大于β-微管蛋白或肌动蛋白的信号，与（C）中所示的平均值一致。(E类)（D）定量GAPDH硫水合随L-半胱氨酸外源剂量增加而变化的密度分析。数据是五到七个独立实验的平均值±SEM。
添加H的前体L-半胱氨酸2S、 显著增加GAPDH、β-微管蛋白和肌动蛋白的硫水合作用，在约0.6至1 mM时产生半最大效应()与肝脏中游离L-半胱氨酸的生理浓度相当，约为0.45 mM(图S4). L-半胱氨酸未能诱导蛋白质的硫酸化CSE公司−/−老鼠(). 在这些生理L-半胱氨酸浓度下，活性CSE进行无细胞催化期间，大约50%的GAPDH蛋白可以在体外30分钟内被硫酸化(图S6). 在表达外源性CSE的HEK293细胞中，L-半胱氨酸也能增强蛋白质的硫水合作用。这些细胞含有约46μM的基础L-半胱氨酸，是肝脏中生理水平的十分之一，几乎没有基础硫水合作用。
GAPDH在半胱氨酸150下呈硫水合
我们检测了硫水合对GAPDH的功能性影响，GAPDH是评估蛋白质中最基本的硫水合物。为了进一步证实蛋白质S-硫水合作用，我们对从小鼠肝脏裂解物中免疫沉淀的全长GAPDH蛋白进行了液相色谱，然后进行了串联质谱（LC-MS/MS）。这些实验表明，GAPDH在Cys具有独特的生理硫酸化作用150半胱氨酸，对其催化活性至关重要，在生理上是S-亚硝基化的(10) (). 这与用NaHS处理的纯化全长野生型人类GAPDH蛋白进行的LC-MS/MS一致，该蛋白在Cys处显示出硫水合作用150(和图S7). DTT处理后的样品中消除了含硫GAPDH的质谱信号().
GAPDH的硫酸化发生在Cys150. (A类)小鼠肝脏内源性全长GAPDH蛋白免疫沉淀的HPLC和LC-MS/MS显示Cys的硫酸化150附加质量约为32.058道尔顿。米/z（z）是质荷比；Cys周围的氨基酸序列150显示在底部。(B类)用100μM NaHS在37°C下处理30分钟的纯化全长人GAPDH蛋白的LC-MS/MS显示出与Cys一致的质量偏移150（人体为152）水合硫。用100μM NaHS和1 mM DTT或500μM H处理后，无法检测到硫水合或硫化2O（运行）2分别是。(C类)在37°C下用100μM NaHS处理30分钟的HEK293细胞的改良生物素开关试验。C150S突变体不含硫。(天)放射性标记GAPDH的硫酸化[35S] 37°C下的半胱氨酸和CSE。通过添加1 mM DTT或将CSE蛋白煮沸5分钟来逆转GAPDH放射性标记。数据通过切伦科夫闪烁计数进行量化。所有结果均为平均值±SEM**P（P）< 0.01. (E类)用放射性标记野生型和C150S GAPDH[35S] 半胱氨酸和CSE。C150S突变体未标记。所有结果均为平均值±SEM**P（P）< 0.01.
因为半胱氨酸也可以被氧化成半胱氨酸亚磺酸（-SO2H） 它的质量比硫酸半胱氨酸的质量小约0.067道尔顿，我们使用质量精度约为百万分之三（ppm）的高分辨率LC-MS/MS来区分这两种修饰。即使在用过氧化氢（H2O（运行）2)，一种强硫化剂(11) (). 我们确实观察到了H的最终产物2O（运行）2氧化、半胱氨酸磺化（-SO三H） ，用H处理后2O（运行）2但不适用于NaHS(). 在我们的实验条件下，GAPDH-Cys150似乎优先通过H进行磺化2O（运行）2半胱氨酸-亚硫酸钠可能是一种过渡中间体。这与之前的研究一致，其中在H之后只能检测到磺化GAPDH2O（运行）2处理(10,12).
我们确认了Cys的重要性150通过显示经NaHS处理的HEK293细胞中GAPDH的硫酸化与野生型GAPDH过度表达有关，但与GAPDH突变形式无关150被丝氨酸取代（GAPDH-C150S）(). 我们确定L-半胱氨酸通过H2S通过在存在的情况下用GAPDH培养CSE[35S] 半胱氨酸。这导致了35野生型GAPDH中的S放射性标记在DTT中可逆，在催化活性CSE中不存在().35S放射性标记在GAPDH-C150S突变体中不明显().
硫化生理学上提高GAPDH催化活性
半胱氨酸处GAPDH的S-硝基化150取消其催化活性(10). 相反，与NaHS孵育显著增强了GAPDH催化活性(). 在0.1至1 mM NaHS条件下，GAPDH活性的最大增强为700%，在15μM NaHS.条件下，活性达到一半。H激活GAPDH2S被DTT逆转，与硫水合作用的调节一致(). 虽然在C150S突变株中GAPDH活性降低，但可以可靠地检测到，并且H不会增加GAPDH的活性2S、 与H一致2通过Cys发生S增强150(). H（H）2S增加了V（V）最大值GAPDH对K（K）米(). 生理生成H2S调节GAPDH；在缺乏内源性CSE的HEK293细胞中，L-半胱氨酸不能刺激GAPDH活性(). 然而，在培养基中添加L-半胱氨酸显著增加了表达外源野生型但没有催化活性CSE的细胞的GAPDH活性(). 评估内源性H2CSE产生的S在生理上调节GAPDH，我们监测了CSE公司−/−老鼠(). 我们观察到，尽管GAPDH蛋白含量正常，但与野生型小鼠相比，突变型小鼠的GAPDH活性持续下降25-30%().
硫酸化在生理上增加了GAPDH的催化活性。(A类)在37°C下，随着NaHS浓度的增加，体外测定GAPDH活性。NaHS剂量依赖性地激活GAPDH。(B类)DTT（1 mM）通过10μM NaHS逆转体外GAPDH激活。所有结果均为平均值±SEM**P（P）< 0.01. (C类)用15μM NaHS体外测定野生型与C150S突变型GAPDH活性。NaHS激活野生型（wt）而非C150S GAPDH。所有结果均为平均值±SEM**P（P）< 0.01. (天)GAPDH活性随底物G3P浓度的增加而增加，有或没有10μM NaHS。NaHS总体增加V（V）最大值不影响K米（约0.8毫微米）。(E类)HEK293细胞中GAPDH活性的转染，不含编码野生型CSE或无催化活性CSE的质粒，并在37°C的培养基中与浓度增加的L-半胱氨酸孵育1小时。在野生型CSE存在下，GAPDH以剂量依赖的方式被激活。(F类)野生型与野生型的体内GAPDH活性CSE公司−/−肝脏。生命来自CSE公司−/−小鼠GAPDH活性降低(n个=6只动物）。所有结果均为平均值±SEM*P（P）< 0.05.
硫酸化促进肌动蛋白聚合
肌动蛋白在体外和含有NaHS的HEK293细胞中被亚硫酸化()，DTT治疗后效果逆转(). NaHS处理细胞的免疫细胞化学分析显示肌动蛋白细胞骨架的重排(). 这些重排似乎存在于所有用H处理的细胞中2S捐赠者。NaHS可使肌动蛋白体外聚合特异性增强30%以上，DTT可逆转此效应()而对肌动蛋白解聚没有实质性影响().
硫酸化促进体外和HEK293细胞中肌动蛋白聚合。(A类)肌动蛋白在体外与200μM NaHS在37°C下硫酸化30分钟，DTT（200μM，10分钟）逆转了这一效果。(B类)在HEK293细胞中，NaHS（37°C下100μM持续30分钟）可使肌动蛋白硫酸化。(C类)对用100μM NaHS在37°C下处理1小时的HEK293细胞进行免疫细胞化学分析，发现肌动蛋白细胞骨架发生重排（箭头所示为含有肌动蛋白丝的细突起在单个NaHS处理细胞中的延伸）。肌动蛋白被染成红色。标尺，20μm。(天)NaHS（200μM）在体外增强肌动蛋白聚合，DTT（200μM）可逆转此效应。(E类)NaHS（200μM）对肌动蛋白解聚没有影响。
讨论
总之，我们已经确定硫水合是由H介导的许多蛋白质的生理修饰2CSE从L-半胱氨酸中酶促生成的S。目标蛋白在CSE和半胱氨酸存在下被硫化。据推测，CSE生成H2虽然CSE可能与靶蛋白结合，类似于NOS亚型与S-亚硝化靶的结合(13). 通过结合密度分析和改进的生物素开关分析，我们估计体内有10%至25%的内源性GAPDH、β-微管蛋白和肌动蛋白被硫水合。这与生理上认为发生的蛋白质S-亚硝化程度低得多的情况形成对比(9). 由于硫水合物的丰度和化学稳定性更高，因此可以很容易地用质谱法证明，而质谱法无法确定更不稳定的S-亚硝基化反应。肝裂解物中含硫GAPDH的质谱信号约为天然GAPDH含量的5%。这个值可能代表低估了，因为电负性越强的亚硫酸化物种对电负性检测器的吸引力越小。原则上，H2S可以作为还原剂破坏蛋白质中的二硫键。然而，我们的观察表明H2S主要通过硫化半胱氨酸而起作用，从而形成过硫化物（-SSH基团）。
GAPDH的硫酸化在生理上增强了其催化活性，在CSE公司−/−动物。同样，硫酸化改变了HEK293细胞中肌动蛋白依赖的细胞骨架重排，并直接增强了体外肌动蛋白聚合，DTT可逆转这一效应。这种作用是选择性的，因为肌动蛋白解聚的速率不受H的影响2S捐赠者。欧盟委员会50H的（中值有效浓度）2硫化蛋白靶点的S在H的生理浓度范围内2大多数组织中的S(13).
硫水合作用可能介导H的各种生理作用2S.通过H的内皮衍生舒张因子活性对血管进行生理舒张2S涉及腺苷5′-三磷酸（ATP）敏感性钾通道的开放(6,14). ATP敏感性钾通道也介导H的心脏保护作用2S、 这与生理相关，因为CSE抑制剂会增加心脏损伤(15). 大蒜的血管扩张作用反映了H2S作用于ATP敏感性钾通道(16). CSE抑制剂增加胰岛素分泌和H2S通过同一类通道减少其分泌(三). 我们发现H2S硫酸化ATP-敏感钾通道的Kir6.1亚基在HEK293细胞中外源性表达，DTT可逆转这种作用(图S8).
H（H）2S延长了秀丽隐杆线虫通过sirtuins(17)这一过程可能涉及蛋白质的硫水合作用。饥饿(18)和糖皮质激素治疗(19)诱导CSE活性加倍，这反过来可能导致目标蛋白的硫水合反应发生相应变化。
我们已经证明，肝脏中有大量蛋白质在生理上被硫酸化，硫酸化改变了蛋白质的功能。我们建议将硫水合作为一种生理信号，可能影响多种生物途径。CSE是一种丰富且普遍存在的蛋白质，表明H2S是人体大多数器官的生理生成物(4–6).
为了使翻译后修饰在信号能力中发挥作用，必须对其进行严格监管。蛋白质磷酸化是如此，它由激酶和磷酸酶控制，蛋白质S-亚硝化也是如此，它受一氧化氮和最近确定的包括硫氧还蛋白在内的反硝化酶家族的调节(20). 鉴于蛋白质S-硫水合的稳定性质及其DTT的化学可逆性，类似的脱硫机理可以防止半胱氨酸过硫化物的积累。另一种调节模式可能涉及亚硝基化和亚硫酸化之间对相同半胱氨酸残基的竞争。确实，GAPDH可以被亚硝化(10)或在Cys中含硫150可能代表着此类竞争监管的一个候选人。
材料和方法
动物
对1至2个月大的野生型、，CSE公司−/−,无操作系统−/−,电子NOS−/−、和iNOS系统−/−老鼠。动物在23°C的室温下进行12小时的光暗循环，可以自由获取食物和水。所有动物使用程序均符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南.
试剂
NaHS、L-半胱氨酸和3-磷酸甘油醛（G3P）以及所有其他化学品均购自Sigma。针对GAPDH的抗体从Calbiochem购买，针对β-微管蛋白的抗体从Sigma购买，针对肌动蛋白的抗体来自Chemicon，针对nNOS、eNOS和iNOS的抗体来自BD Biosciences，针对Kir6.1的抗体来自Santa Cruz Biotechnology。针对CSE的多克隆抗体制备如下：在大肠杆菌，通过Talon树脂（Clontech）纯化，并用于抗原。抗血清由研究遗传学公司生产，血清经过免疫纯化。Kir6.1构建物是从Open Biosystems获得的，SUR2B构建物是Y.Kurachi和H.Hibino（日本大阪大学）赠送的礼物。Kir6.1和SUR2B结构均在HEK293细胞中外源性共表达，以产生ATP敏感性钾通道。使用来自Qiagen的Polyfect试剂转染带有特定互补DNA（cDNA）构建物的细胞。
改良生物素开关（S-硫水合）分析
按照前面所述进行分析(8)，进行了修改。简单地说，肝脏组织或细胞在添加100μM去铁胺的HEN缓冲液[250 mM Hepes-NaOH（pH 7.7）、1 mM EDTA和0.1 mM新铜试剂]中均质，并在13000℃离心克在4°C下保持30分钟。用CSE、L-半胱氨酸或NaHS处理的细胞裂解物（240μg）或纯GAPDH蛋白（0.3μg。然后用丙酮去除MMTS，并在−20°C下沉淀蛋白质20分钟。去除丙酮后，蛋白质重新悬浮在HENS缓冲液中（HEN缓冲液调整为1%SDS）。向悬浮液中添加不含抗坏血酸的二甲基亚砜中的4 mM生物素HPDP。在25°C下培养3小时后，生物素化蛋白通过链霉亲和素琼脂糖珠沉淀，然后用HENS缓冲液清洗。生物素化蛋白通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样品缓冲液洗脱并进行Western blot分析。为了定量蛋白质的硫水合作用，将样品与总裂解物（“负荷”）一起进行印迹，并用每种蛋白质特异性的抗体进行免疫印迹。然后，使用软件程序EagleSight 3.2（Stratagene）和Odyssey 2.1（Li-Cor）对样品负载比进行密度分析。
质谱分析
用4μg抗GAPDH单克隆抗体在4℃下过夜，从10 mg小鼠肝裂解液中免疫沉淀内源性GAPDH蛋白，然后再添加50μl蛋白g加琼脂糖珠2小时。用含有20 mM tris-HCl（pH 7.4）、500 mM NaCl和0.1%Triton X-100的缓冲液清洗珠子五次。一些样品在SDS-PAGE凝胶上运行并考马斯染色，以验证样品纯度。将结合到珠子上的免疫沉淀GAPDH蛋白直接在37°C下用5μg胰蛋白酶在20 mM碳酸氢铵中进行胰蛋白酶消化过夜。样品在氮气（N）下处理2)尽可能使用气体，避免长时间暴露在室内空气中，以避免半胱氨酸的人为氧化，包括形成二硫键。第二天早上，添加1μl浓缩甲酸以冷却消化；然后将样本在13000下离心克持续10min，提取上清液并置于500μl离心管中。对于纯人类GAPDH蛋白，样品用或不用100μM NaHS或500μM H处理2O（运行）2胰蛋白酶消化前，在37°C的非还原条件下保持30分钟。然后在快速真空中蒸发样品，并将其储存在−80°C下。在注入光谱仪之前，将样品溶解在8μl 2%乙腈和0.1%三氟乙酸中。样品以100000分辨率注入约翰·霍普金斯大学医学院和哈佛医学院的Thermo Finnegan LTQ Orbitrap XL质谱仪。使用Ultramark、磷酸和牛血清白蛋白（BSA）肽标准溶液校准仪器。两种设备的质量精度均在3 ppm左右，足以区分半胱氨酸硫水合反应（-SSH）和其他氧化反应，如硫化反应（-SO）2H） ●●●●。预期质量/充电比(米/z（z）)表示2+带电肽。
[35S] 半胱氨酸放射性测定
纯化的CSE和GAPDH蛋白与1 mM L-半胱氨酸和40μCi[35S] 不含还原剂的半胱氨酸（Perkin-Elmer）在10 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）和15μM PLP中37°C下放置2小时。然后在非还原性SDS-PAGE凝胶上进行反应并进行考马斯染色，评估蛋白质负荷，并通过带切除和切伦科夫闪烁计数定量放射性。
GAPDH活性分析
纯化的GAPDH、HEK293细胞裂解物或肝裂解物在没有NaHS、L-半胱氨酸、NaCl或H的情况下培养2O（运行）2在37°C下指示30分钟，除非300μl分析缓冲液中另有指示[20 mM tris-HCl（pH 7.8）、100 mM NaCl、BSA（0.1 mg/ml）、1 mM NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）、10 mM焦磷酸钠、20 mM砷酸钠和3 mM G3P]，以及NAD比率的变化+至NADH（NAD的简化形式+)如前所述，在340nm处实时分光光度法监测转化(10).
H（H）2S测量
H（H）2S生产量按前面所述进行测量(6)带有H2按照修改后的制造商说明，在Fisher Accumet 10型pH计（Fisher Scientific）上安装S-选择电极（Lazar研究实验室）。标准品由NaHS溶液制备。
CSE活性测定
通过测量H来评估CSE活动2如上所述的S生产(三). 简言之，在含有10 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）、10 mM l-半胱氨酸、15μM PLP和10%（w/v）匀浆的250μl反应混合物中进行检测。用N冲洗含有反应混合物的高效液相色谱（HPLC）注射瓶（2 ml）2在密封之前。通过将小瓶从冰上转移到37°C的摇晃水浴中，开始反应。在37°C下孵育60分钟后，通过注入125μl 1%乙酸锌和2.5μl 10 N NaOH捕集液的混合物终止反应。将小瓶水平摇晃60分钟，以确保完全捕获H2S从混合物中释放出来。然后，向每个小瓶中加入0.5毫升水。随后，0.1 ml 20 mMN个,N个-二甲基-对-添加7.2 M HCl中的硫酸苯二胺，然后立即添加0.1 ml 30 mM FeCl三·6小时21.2 M HCl中的O。20分钟后，用分光光度计测量所得溶液在670 nm处的吸光度。H（H）2根据标准H的校准曲线计算S含量2用NaHS制备的S溶液。对于纯化CSE的体外实验，还按照制造商的方案（Sigma）使用丙酮酸乳酸脱氢酶分析系统评估酶活性，该系统通过分光光度法监测NADH向NAD的转化+340 nm。
L-半胱氨酸测量
通过在2 N HCl中提取肝脏或HEK293细胞样品，用1%三羟甲基偶氮唑蓝测定L-半胱氨酸-n个-丁基膦（TBP），然后在95°C下孵育30分钟。然后将样品在冰上冷却1小时，并在13500下离心克30分钟后，收集上清液并用等量的NaOH中和，并在含有1 mM EDTA和1%TBP的0.1 M硼酸钠缓冲液（pH 8.0）中用巯基反应化合物7-氟苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-磺酰胺（Aldrich）衍生半胱氨酸巯基。将混合物在50°C下培养60分钟，然后在冰上冷却，并用10至12 N HCl酸化至pH 2.0。ABD-F只有在与硫醇反应后才具有荧光。将每个样品注入CROWNPAK CR（+）HPLC色谱柱（Chiral Technologies Inc.）。使用高氯酸（pH 1.5）进行等量洗脱以进行分离。用荧光检测器检测ABD-F标记的L-半胱氨酸（激发λ=374nm，发射λ=500nm）。使用纯L-半胱氨酸计算实际样品中的氨基酸浓度。
免疫细胞化学
将HEK293细胞与100μM NaHS在37°C下孵育1小时，然后用PBS快速冲洗细胞，并在−20°C下用甲醇固定20分钟。用10%胎牛血清（FBS）封闭1小时后，用肌动蛋白抗体在4℃孵育细胞过夜。然后用PBS清洗细胞，用二级抗体处理1小时，冲洗，并用Vectashield安装介质（Vector Labs）培养，直到在Perkin-Elmer UltraView LCI共焦显微镜中进行共焦成像。
肌动蛋白聚合和解聚分析
为了测定肌动蛋白的聚合活性，我们使用了一种已建立的芘-肌动蛋白聚合试验(21). 将200μM NaHS或200μM含200μM DTT的NaHS添加到10μM芘标记的肌肉肌动蛋白中（Cytosketon Inc.）。我们使用荧光分光光度计（激发λ=360nm，发射λ=407nm）（Perkin-Elmer）每隔30秒监测荧光信号5分钟，发现NaHS对自发肌动蛋白聚合没有影响。接下来，我们加入10倍肌动蛋白聚合缓冲液[50mM tris-HCl（pH 8.0），500mM KCl，20mM MgCl2每30秒读取一次荧光强度读数，持续1小时。对于肌动蛋白解聚分析，我们首先制备了20μM F-actin储备。用普通肌动蛋白缓冲液[5 mM三氯化氢（pH 8.0）和0.2 mM氯化钙将F-肌动蛋白储备稀释至4μM后2]，我们用NaHS或NaHS和DTT混合物处理原料，并立即每隔30秒读取一次荧光读数，持续1小时。所有实验均在室温下进行。
蛋白质纯化
将小鼠全长CSE DNA亚克隆到pET-28c+His载体（Novagen）中，该载体编码六组氨酸标签，并导入BL21密码子加细菌（Stratagene）。0.5 mM异丙基1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷（Sigma）在30°C下诱导CSE表达12小时。通过离心收集细胞，并在含有20 mM三氯化氢（pH 7.4）、15μM PLP、10 mM咪唑和400 mM氯化钠的培养基中通过超声破碎细胞。加入1%Triton X-100后，通过离心（40000克15分钟），根据制造商的说明，通过与泰龙树脂（Clontech）结合，从上清液中纯化CSE。谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）标记的GAPDH蛋白根据制造商的建议（Amersham Biosciences）制备，并通过谷胱甘肽-脑葡萄糖（Amersham Bioscinces）纯化，GST标记在最后纯化步骤中被裂解。
细胞培养
HEK293细胞取自美国型培养物收集中心，在37°C、95%空气和5%CO的湿润环境中，在含有10%FBS、L-谷氨酰胺（300μg/ml）、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μg/ml2根据制造商的方案，用Polyfect转染试剂转染细胞。
统计分析
除非另有说明，否则所有数据均表示为三个独立实验的平均值±SEM，每个实验一式三份。数据由未配对学生的t吨测试(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001).
补充材料
补充材料
图S1。蛋白质S-硫水合的改良生物素开关分析。
图S2。非PLP-结合CSE突变体不具有催化活性。
图S3。改良的生物素开关试验对硫水合反应具有特异性。
图S4。L-半胱氨酸水平在野生型和CSE公司−/−肝脏。
图S5。野生型和哥伦比亚广播公司−/−肝脏显示类似的H2S生产。
图S6。在CSE和L-半胱氨酸的无细胞催化过程中，GAPDH被大量硫酸化。
图S7。半胱氨酸的GAPDH硫水合作用150使用LC-MS/MS。
图S8。H（H）2硫水合物对HEK293细胞ATP敏感的钾通道。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院国家研究服务奖（1 F30 MH074191-01A2）、M.M.G.的医学科学家培训计划奖（T32 GM007309）、加拿大卫生研究院对R.W.的运营拨款以及S.H.S.的美国公共卫生服务拨款（MH18501）和研究科学家奖（DAOOO74）的支持。
参考和注释
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