抑制刺猬信号增强胰腺癌小鼠模型化疗药物的传递

摘要

胰腺导管腺癌（PDA）是人类最难治疗的恶性肿瘤之一。几十年的努力见证了许多化疗方案的失败，而目前的标准疗法吉西他滨仅将患者生存期延长了几周(1–三)。肿瘤药物的开发在很大程度上依赖于携带移植肿瘤的小鼠模型来测试新药物的疗效。然而，这种PDA模型对许多化疗药物都有反应，包括吉西他滨(4–9)这表明它们的预测效用可能有限。PDA的基因工程小鼠（GEM）模型为临床前治疗评估提供了一种替代移植模型的方法。我们之前描述过KPC小鼠，其有条件地表达内源性突变喀斯特和第53页胰腺细胞中的等位基因(10)胰腺肿瘤的病理生理和分子特征与人类PDA相似(11)。我们用KPC小鼠研究PDA对化疗不敏感的原因。

我们首先比较了吉西他滨对四种小鼠模型胰腺肿瘤生长的影响：KPC小鼠和三种不同的肿瘤移植模型(12)(13)。吉西他滨抑制所有移植瘤的生长，无论其来源于人类还是小鼠(图1A)但未诱导细胞凋亡(图1B)。相反，所有移植瘤的增殖都显著减少(图S1A)。相反，吉西他滨治疗的小鼠中大多数KPC肿瘤（15/17）的生长速度与盐水治疗的对照组相同(图1C)。这与临床结果一致，在接受吉西他滨治疗的患者中，只有5-10%的患者在原发肿瘤部位表现出客观的放射反应(三)。两个KPC肿瘤经高分辨率超声显示为短暂反应(13)与高水平的凋亡相关(图1D)(图S1)。此外，治疗后不久，经吉西他滨治疗的KPC肿瘤的增殖减少，但程度低于移植模型(图S1).

在单独的窗口中打开

图1

KPC小鼠胰腺肿瘤对吉西他滨有很大抵抗力

用吉西他滨对患有胰腺肿瘤的小鼠进行全身治疗。*P<.05，Mann-Whitney U。实线=平均值；虚线=无应答器的平均值。(一个)移植模型中肿瘤体积的变化百分比（参见补充在线材料)用生理盐水（蓝色）或100mg/kg吉西他滨，Q3Dx4（红色）处理。(B类)用裂解半胱天冬酶3（CC3）的免疫组织化学（IHC）测定，吉西他滨治疗在移植模型中未诱导肿瘤细胞凋亡。(C类)用生理盐水（蓝色）、50mg/kg（绿色）或100mg/kg吉西他滨、Q3Dx4（红色）治疗的KPC小鼠肿瘤体积的百分比变化。超声检查评估，17例KPC肿瘤中有2例对吉西他滨有短暂反应（黄色）。(天)。凋亡增加仅在对药物有短暂反应的KPC肿瘤中明显（黄色）。

移植来源于KPC肿瘤的低流量细胞产生对吉西他滨治疗敏感的皮下肿瘤（见“同系物”，图1A)这表明先天性细胞差异不太可能解释KPC肿瘤的化疗耐药性。因此，我们通过高压液相色谱法（HPLC）评估了吉西他滨（2′，2′-二氟脱氧胞苷，dFdC）对其活性细胞内代谢产物吉西他滨三磷酸（2′，2′-二氟脱氧胞苷三磷酸，dFdCTP）的代谢。与临床研究结果一致(14)在野生型小鼠体内循环的吉西他滨被迅速脱氨基为其非活性代谢物2′2′-二氟脱氧尿苷（dFdU），导致吉西他宾的半衰期较短(图S2A-B)。dFdCTP存在于移植瘤组织和对照组织中，但在KPC肿瘤中未检测到(表S1)。因此，胰腺肿瘤组织中dFdCTP的积累区分了PDA的移植和KPC模型，并与吉西他滨的反应性相关。吉西他滨转运相关基因表达的变化不太可能解释移植性和KPC胰腺肿瘤中吉西他宾积累的差异(图S2C-D).

药物输送受损是化疗耐药的另一种可能机制(15,16)。我们通过表征每个模型中的肿瘤灌注来研究药物递送。首先，我们通过静脉输注植物凝集素来描述功能性血管系统(焦糖乳杆菌）在麻醉小鼠中，然后用CD31抗体联合免疫荧光检测收获组织中的血管(图S3)。我们发现，移植瘤显示了未闭的血管系统，而KPC肿瘤显示了功能失调的血管系统。事实上，只有32%的CD31⁺KPC肿瘤中的血管用凝集素标记，而移植肿瘤和正常胰腺中的血管分别为78%和100%。其次，为了评估小分子药物在KPC肿瘤中的血管内传递和渗透是否受阻，我们静脉注射凝集素和自身荧光药物阿霉素(图2A-B)(图S4)(17)。共聚焦显微镜显示，与邻近对照组织和移植肿瘤相比，KPC胰腺肿瘤中阿霉素的释放显著减少，证实了药物在短时间内的低效释放。第三，使用高分辨率对比超声，我们发现5μm充气脂质体（微泡）在移植性肿瘤中的传递效率高于KPC肿瘤(图2C-D)(图S5)。最后，我们对移植瘤和KPC肿瘤进行了动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）(图2E-F)(图S6)。在给予钆二乙基三胺五乙酸（Gd-DTPA）后，我们观察到移植瘤周围显著增强（什么？？？），而肿瘤核心表现出不同的异质性增强模式，与组织学观察到的中央坏死一致(图S6C)。相反，我们观察到Gd-DTPA能有效地传递到KPC肿瘤周围组织，尽管这些肿瘤几乎没有坏死，但瘤体内几乎没有增强（什么？？）(图S6D)。总之，这些结果表明KPC胰腺肿瘤的药物传递受损。

在单独的窗口中打开

图2

KPC小鼠胰腺肿瘤灌注不良

植物凝集素（红色）和阿霉素（绿色）注入移植体内的直接免疫荧光检测(一个)和KPC(B类)肿瘤，以及H&E染色的邻近切片（插图）。比例尺，200μm。阿霉素对移植性肿瘤有效（N=5），但相对于周围组织，对KPC肿瘤（N=4）的有效性较差。将微泡（绿色）灌注到移植体内(C类)和KPC(天)超声造影显示肿瘤。与KPC肿瘤（N=8）相比，移植肿瘤灌注良好（N=6）。肿瘤轮廓为黄色。比例尺，1mm。DCE-MRI显示移植瘤中Gd-DTPA的灌注和外渗增加（高灌注=白色/黄色）(E类，N=6）与KPC肿瘤相比(F类，N=6）。肿瘤轮廓为蓝色。比例尺，2mm。

接下来我们研究了移植瘤和KPC肿瘤中的血管内容和组织结构。移植瘤的活（外围）部分血管密集(图S7A)肿瘤细胞与血管直接接触(图3A)。相比之下，在KPC和人类胰腺肿瘤的实质内，血管密度显著降低，血管嵌入突出的基质基质中，这是这些肿瘤和原发性人类导管胰腺癌的特征(图3B-D)(图S7)(图S8)。与移植性肿瘤相比，KPC和人胰腺肿瘤中的肿瘤细胞与血管的间距较大，反映了基质含量的差异(图3E)。使用计算机辅助图像分析，我们在一个由18例人类PDA样本组成的独立队列中，与正常胰腺组织和慢性胰腺炎（CP）样本相比，证实了血管系统的缺乏(图3F)(图S9)。我们的研究结果表明，血管内容物的增加并不是导管胰腺癌进展的先决条件，并表明PDA肿瘤的血管生成不足和血管构筑可能会对治疗提供带来额外的限制。

在单独的窗口中打开

图3

KPC小鼠和人类胰腺肿瘤的血管减少

移植CD31 IHC(一个)，千帕(B类)和人类(C类)胰腺肿瘤（标尺，20μm）。箭头表示血管。移植肿瘤的肿瘤细胞与血管直接接触，而KPC和人类肿瘤中的肿瘤细胞由于基质突出而间距较远。(天)测量KPC肿瘤（KPC）、同种异体自体移植（Syn）、原位异种移植（Ortho）、KPC肿瘤邻近组织（Adj）、人类胰腺肿瘤（PDA）和小鼠和人类正常胰腺（Norm）的平均血管密度（MVD）。与移植肿瘤和正常组织相比，KPC和人类胰腺肿瘤的血管化较差（*P<.004，Mann-Whitney U）。(E类)KPC肿瘤和人PDA中血管和肿瘤细胞之间的距离明显高于移植肿瘤。(F类)MVD的计算机辅助图像分析发现，与正常胰腺（N=5）和慢性胰腺炎（N=6）样本相比，人类胰腺肿瘤（N=18）的血管密度较低（*P<0.0015，**P<0.0001，Mann-Whitney U）。区分组织的外周（P）和中央（C）区域。

我们假设破坏胰腺肿瘤的基质可能会改变血管网络，从而促进化疗药物的输送。我们研究了一种hedgehog（Hh）通路抑制剂，因为从肿瘤细胞到基质细胞的旁分泌Hh信号传导促进了基质结缔组织形成(18,19)。Hh配体与Patched1受体的结合可减轻12-跨膜蛋白Smoothened（Smo）的抑制，从而激活Gli家族的转录因子。而Sonic Hedgehog（Shh）在人类肿瘤细胞中过度表达(20)和KPC(10)胰腺肿瘤，Gli活性仅限于间质室(21).

IPI-926是环胺的半合成衍生物（化学结构如图S10)有效抑制Smo（EC₅₀=7nM），半衰期长（10.5小时，CD1小鼠），分布量大（11L/kg，CD1鼠）。IPI-926在细胞和体外测定中的详细表征将另行公布。每天向KPC小鼠口服40mg/kg IPI-926导致药物在PDA组织中的可测量累积(图S11A)Hh途径的转录靶点Gli1的表达显著下降(图S11B)。用IPI-926或吉西他滨单独或联合治疗（IPI-926/gem）8-12天后，研究Smo抑制对KPC小鼠肿瘤组织病理学和灌注的影响。与使用载体或吉西他滨治疗的小鼠相比，使用IPI-926或IPI-926/gem治疗的小鼠表现出大量促结缔组织增生性肿瘤基质，导致促结缔细胞增生性基质耗尽，导致导管肿瘤细胞密集堆积(图S12A-D)。Smo抑制对基质的影响也可以通过I型胶原含量的降低来证明(图S12E-H)。有趣的是，这些差异在只治疗了四天的小鼠中并不明显(图S13I-L)。然而，对使用载体或IPI-926治疗四天的肿瘤进行联合免疫荧光检测发现，α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）阳性基质肌成纤维细胞的增殖减少(图S11C)(图S13A-B)。这种增殖减少与αSMA阴性细胞增殖增加相平衡(图S11D).

Smo抑制也对肿瘤血管系统产生了深远的影响，IPI-926治疗小鼠的肿瘤中的平均血管密度（MVD）显著升高(图4A)(图S14A-D)。这种作用在IPI-926/gem治疗的小鼠中最为显著，其MVD接近正常胰腺组织。治疗4天后，CD31含量也增加(图S14E-H)。在这一早期点，发现大量分离的CD31阳性细胞，这与Smo抑制后新内皮前体的活跃形成一致。事实上，增殖和内皮标记物的联合免疫荧光证实IPI-926治疗后增殖内皮细胞显著增加(图S11E)(图S13C，D)。在IPI-926治疗小鼠中观察到的MVD增加也与阿霉素更有效地输送到肿瘤组织有关(图4B)(图S14I-L)。重要的是，我们发现用IPI-926/gem预处理10天后，KPC肿瘤中吉西他滨代谢物的浓度升高了60%(图4C)（P=.04，Mann-Whitney U）。这些数据表明，胰腺肿瘤基质的耗竭刺激血管生成，从而增加药物输送。有趣的是，全组织mRNA微阵列分析显示，促血管生成VEGF表达在what和what之间没有显著差异？？？？(表S2).

在单独的窗口中打开

图4

平滑抑制促进吉西他滨的交付并延长生存期

KPC小鼠接受8–12天的治疗：不治疗（NT）、溶媒（V）、吉西他滨（G）、IPI-926（I）或IPI-926+吉西他宾（IG）。(一个)IPI-926或IPI-926/Gem治疗后MVD升高（P<0.05，Mann-Whitney U）。(B类)单独使用IPI-926或IPI-926/Gem治疗后，阿霉素荧光增强（*P<.02，Mann-Whitney U）。(C类)按照指示的方案进行治疗后，给所有小鼠服用单剂量吉西他滨，并通过以下方法测定提取样品中含氟代谢物的浓度：¹⁹F核磁共振。IPI-926/gem治疗的肿瘤中吉西他滨代谢物浓度升高（P=0.04，Mann-Whitney U）。(天)裂解caspase 3的IHC显示IPI-926/gem治疗的肿瘤细胞凋亡增加（P=0.008，Mann-Whitney U）。(E类)IPI-926/gem治疗显著延长了KPC小鼠的生存期（P=0.001 Log-Rank试验，危险比=0.157±0.458 95%CI 6.36）。(F类)IPI-926/gem KPC小鼠的肝转移较少（*P=0.015，Fisher's Exact）。

然后我们研究了Smo抑制对细胞增殖和凋亡的影响。尽管IPI-926单独降低基质肌成纤维细胞的增殖，但它对整体细胞增殖几乎没有影响，这与胰腺细胞中条件Smo缺失不会改变突变Kras诱导的胰腺肿瘤的进展这一发现相一致(23)。重要的是，IPI-926/gem治疗的肿瘤含有许多死亡和濒临死亡的细胞，凋亡标记物Cleaved Caspase 3的染色显著增加证明了这一点(图4D).

最后，我们对KPC小鼠进行了干预生存研究，通过三维超声监测肿瘤体积。与车辆治疗对照组相比，单独使用吉西他滨或IPI-926治疗的KPC小鼠没有显示出生存益处。相比之下，IPI-926/gem联合治疗将KPC小鼠的中位生存期从11天延长到25天（P=0.001，对数秩检验），产生的危险比为0.157±0.458 95%可信区间(图4E)。大多数经IPI-926/gem治疗的肿瘤（14/17）在治疗后1-2周内表现出短暂的缩小(图S15)。相比之下，只有少数吉西他滨（2/10）和IPI-926（2/10。有趣的是，IPI-926/gem治疗显著降低了肝转移(图4F，P=.015，Fisher's Exact）。研究终点肿瘤生物学，我们发现IPI-926/gem治疗的肿瘤中与吉西他滨耐药相关的基因表达没有差异(图S11G)。然而，由于IPI-926中的MVD与对照组相似，IPI-926/gem治疗的肿瘤在终点处血管新生不足得到恢复(图S11H).

胰腺癌对系统治疗的一般耐药性在常见癌症中并不常见，临床前模型也无法预测(24)。化疗药物具有两个特性：半衰期短和治疗指数小（药效和毒性之间的浓度范围）。不良的组织灌注必然会大大减少半衰期短的药物的总暴露量。我们假设胰腺肿瘤相对于正常组织和其他肿瘤灌注不良，这是由于KPC模型和人类PDA特有的肿瘤结构方面的原因。事实上，最近有两组研究报告称，使用对比增强内镜超声检查，人类胰腺导管腺癌灌注不良，并且这种特征将PDA与胰腺内分泌肿瘤和炎症疾病区分开来(25,26)。限制药物输送的非血管生成性血管系统缺陷也可能有助于解释胰腺癌患者对抗血管内皮生长因子治疗反应不佳的原因(27).

为了消除药物传递的障碍，我们建议半衰期长、治疗指数高的药物应成为胰腺癌临床前研究的重点。我们已经提供了一个基本证据，即一种药物可以破坏PDA灌注不良的拟议决定因素，即促结缔组织增生基质，从而促进吉西他滨的给药并提高其疗效。出乎意料的是，这种通过对Smo的作用抑制Hh信号通路的药物也增加了肿瘤血管密度，这与早期证明Hh信号在发育过程中和成人中具有促血管生成作用的研究形成了对比(28,29)。最终，KPC肿瘤的血管含量恢复到较低水平，表明肿瘤可以适应持续的Smo抑制。虽然KPC小鼠中的大多数肿瘤在短暂反应后同样恢复生长，但我们的研究结果可能会为改善胰腺癌患者的治疗药物输送和疗效开辟新的途径。

补充材料

致谢

参考文献和注释