水凝胶作为三维细胞培养的细胞外基质模拟物

摘要

引言

哺乳动物细胞的体外培养为研究生物体外的细胞和组织生理学以及病理生理学提供了一个明确的平台。传统上，这是通过在二维（2D）底物上培养单个细胞群来实现的，例如组织培养聚苯乙烯（TCPS）或组织类似物的表面。这些二维细胞结构的实验为我们对复杂生物现象的初步解释奠定了基础，包括分子生物学、干细胞分化(Jaiswal等人，1997年)和组织形态发生(Schnaper等人，1993年). 此外，2D实验在细胞功能和与细胞微环境的相互作用之间的动态关系方面产生了开创性的发现。Discher及其同事证明，人类间充质干细胞（hMSCs）的分化依赖于2D培养平台的机械刚度(Engler等人，2007年,2006). 此外，Ingber及其同事已经证明，细胞在2D支架上的机械膨胀程度决定了相对生长和凋亡率(Chen等人，1997年;Singhvi等人，1994年). 因此，体外细胞构建可用于检测表观遗传因子如何影响生理现象；然而，最近的研究表明，当细胞从天然三维组织中切除并局限于单层时，细胞往往表现出非自然行为。

在他们的开创性工作中，Bissell及其同事证明，人类乳腺上皮细胞在二维培养时会像肿瘤细胞一样发育，但在三维模拟其自然微环境中培养时会恢复正常生长行为(Petersen等人，1992年). 此外，与单层培养相比，在3D类胚体中培养细胞时，胚胎干细胞的软骨生成增强(Tanaka等人，2004年). 这些肿瘤发生和干细胞分化方面的发现阐明了2D和3D培养之间细胞功能的严重差异，并表明仅从两个维度检查层次生物学是不够的。

因此，生物学家和生物工程师都研究了许多三维支架，这些支架能够再现体外细胞培养所需的天然细胞微环境的各个方面。其中，具有高含水量的水凝胶交联网络显示出作为3D细胞培养基质的独特功效。目前，用于哺乳动物细胞培养的水凝胶范围从纯天然材料到纯合成材料不等，每种水凝胶系统都有其自身的优势和局限性。随着该领域的发展，对结合天然和合成水凝胶优点的基质的需求越来越明显，同时还需要识别必要的生物物理和生化信号，以纳入这些合成细胞外基质（ECM）类似物中。从这个角度来看，3D细胞构建的必要性是合理的，水凝胶作为细胞培养支架的现状得到了解决，并展望了新兴的合成-生物水凝胶。

背景很重要

细胞支架仅作为被动载体来研究基因表达和细胞功能之间的关系的范式已经过时。现在很明显，细胞微环境对指导细胞表型的空间和时间复杂信号域起作用。事实上，比塞尔的工作确立了表型可以仅仅由于与ECM的相互作用而取代基因型。因此，细胞不能再被认为是由其基因组定义的孤立实体，而必须在ECM、可溶性生长因子、激素和其他调节器官并最终调节生物体形成和功能的小分子的背景下进行评估。这种动态的细胞外环境协调了细胞内信号级联，通过改变基因和最终蛋白质表达影响表型命运(Birgersdotter等人，2005年). 2D和3D培养物之间观察到的细胞行为差异来自基因表达的扰动，这源于细胞在两个维度上体验其微环境的方式与自然3D环境不同(图1).

在单独的窗口中打开

图1

细胞在2D和3D培养中经历了截然不同的环境。例如，单层培养的神经细胞(A类)受限于在平面中扩展进程。细胞体被染成绿色，轴突延伸部分的β-微管蛋白被染成红色。当在水解可降解的聚乙二醇水凝胶中培养时(B类)相同的细胞形成神经球，并在三维上各向同性地延伸过程。图片由M.J.Mahoney拍摄。

例如，2D培养使细胞极化，使得只有细胞膜的一部分可以与ECM和相邻细胞相互作用，而细胞的其余部分暴露于大量培养基(Zhang等人，2005年). 这导致非自然、极化的整合素结合和机械传递，这两者都影响细胞内信号传递和表型命运(Gieni和Hendzel，2008年). 固有的极性也会导致与可溶性因子的非自然交互作用。在2D培养中，细胞经历大量培养基中存在的营养素、生长因子和细胞因子的均匀浓度，其中膜的与周围培养基接触的部分。相反，影响细胞迁移、细胞间通讯和分化的可溶性因子浓度在体内具有动态空间梯度(阿什和布里斯科，2006年).

形态学本身已被证明影响精细的细胞过程，如全局组蛋白乙酰化(Le Beyec等人，2007年)以及增殖、凋亡(Chen等人，1997年)分化和基因表达(Birgersdotter等人，2005年). 二维培养将细胞限制在平面环境中，并限制在体内观察到的更复杂的形态。

此外，2D曲面和3D环境之间的移植存在差异。细胞不仅局限于二维平面内，而且对周围ECM的迁移几乎没有阻力。这适用于发生在较长尺度上的其他现象，如癌症转移和组织组织，其行为受与周围细胞微环境的机械相互作用的调节。因此，为了在体外正确研究细胞生理学、机械转导和组织形态发生，细胞应在3D模型微环境中培养，该微环境再现了天然ECM中存在的关键机械和生物化学线索，同时促进了迁移和组织组织等层次过程。

3D文化平台

在过去几十年里，组织工程师和细胞生物学家已经开始开发材料系统，在3D ECM模拟物中培养哺乳动物细胞，以规避传统2D细胞培养带来的限制。为此，细胞被包裹在微孔中(Levenberg等人，2003年;Shea等人，1999年;Yim和Leong，2005年)，纳米纤维(Semino等人，2003年;Silva等人，2004年)和水凝胶支架(Peppas等人，2006年). 微孔支架可以方便地封装细胞，但其孔隙率（~100µm）大于平均细胞直径（~10µm；因此，它们可以有效地用作具有曲率的二维支架。纳米纤维支架提供了一种3D拓扑结构，更好地模拟了纤维ECM蛋白形成的结构；然而，许多人身体太弱，无法承受适当的机械传导所需的压力。这些局限性在水凝胶中没有发现，水凝胶捕获了天然细胞微环境的结构和力学的许多特征(Saha等人，2007年).

由于水凝胶能够模拟大多数软组织的性质，因此它是开发合成ECM类似物的极具吸引力的材料。这些交联聚合物链的网状结构具有高含水量，易于运输氧气、营养物质和废物，以及可溶解因子的实际运输(阮和韦斯特，2002年). 此外，许多水凝胶可以在温和的细胞相容条件下形成，并且易于修饰以具有细胞粘附配体、所需的粘弹性和降解性(Lutolf和Hubbell，2005年).

用于细胞培养的水凝胶可以由大量的天然和合成材料形成，具有广泛的机械和化学特性。有关用于水凝胶合成的材料和方法的优秀综述，请参见Lee和Mooney（2001）在最简单的解构中，水凝胶在由天然材料形成时促进细胞功能，而在由合成材料形成时允许细胞功能(图2).

在单独的窗口中打开

图2

容许水凝胶(A类)由合成聚合物（黄色网格）组成，为培养细胞提供3D环境；然而，它们不能激活整合素（棕色）和其他表面受体（橙色）。当细胞重塑其周围的微环境时，合成环境只允许存活。另一方面，促进水凝胶(B类)由天然衍生聚合物形成的具有无数与ECM（黄色纤维）协调的整合素结合位点（绿色）和生长因子（红色），它们通过与细胞表面受体结合事件引发的信号级联来指导细胞行为。

许可和促进水凝胶

细胞培养用天然凝胶通常由蛋白质和ECM成分（如胶原蛋白）组成(Butcher和Nerem，2004年)、纤维蛋白(Eyrich等人，2007年)、透明质酸(Masters等人，2004年)或Matrigel，以及来自其他生物来源的材料，如壳聚糖(Azab等人，2006年)，藻酸盐(Barralet等人，2005年)或丝原纤维。由于它们来源于天然，这些凝胶具有固有的生物相容性和生物活性(Dawson等人，2008年). 由于存在大量内源性因子，它们还促进许多细胞功能，这有利于许多细胞类型的生存、增殖和发育。然而，这种支架很复杂，而且往往定义不清，很难准确确定哪些信号促进了细胞功能(库欣和安塞思，2007年). 此外，调整其材料属性（如力学和生物化学呈现）可能很困难，存在污染风险，可能会降解或收缩过快，并且具有固有的批间可变性，这会混淆支架对细胞增殖、分化和迁移的影响。

另一方面，水凝胶可以由纯非天然分子形成，例如聚乙二醇（PEG）；Sawhney等人，1993年)，聚乙烯醇(Martens和Anseth，2000年)和聚甲基丙烯酸甲酯（2-羟基乙基）(Chirila等人，1993年). 聚乙二醇水凝胶已被证明能够维持被包裹细胞的生存能力，并允许ECM在降解时沉积(布莱恩特和安塞思，2002年)，表明即使没有整合素结合配体，合成凝胶也可以作为3D细胞培养平台发挥作用。这种惰性凝胶具有很高的重现性，可以方便地调节机械性能，并且易于加工和制造。然而，它们缺乏促进细胞行为的内源性因子，主要作为允许细胞功能的模板(库欣和安塞思，2007年).

这些合成支架为体外培养哺乳动物细胞提供了一种最低限度的方法，并已用于临床应用和细胞生理学的基础研究(Shu等人，2006年). 然而，为了正确模拟天然ECM，必须将其复杂性整合到这些允许的水凝胶中。

天然细胞外基质

在体内，细胞生长在一个复杂且具有生物活性的水凝胶支架内，该支架提供机械支持，同时指导细胞粘附、增殖、分化、形态和基因表达（ECM）。三维细胞培养的功能性支架在促进功能和组织组织的同时允许细胞生长，应该模仿这种典型的水凝胶(西部，2005年)在多重长度尺度上(图3).

在单独的窗口中打开

图3

天然ECM是在许多长度尺度上调节细胞功能的典型水凝胶。A类：整合素与ECM蛋白（绿色配体和tan受体）结合，生长因子在蛋白聚糖（红色）中的隔离，以及通过钙粘蛋白（紫色）的细胞-细胞接触，发生在几十纳米到微米的范围内。B类：迁移在组织再生、癌症转移和伤口愈合中起着关键作用，其初始规模为几十至数百微米。引导分化（粉红色生长因子）和增殖（红色生长因子）的旁分泌信号也在这个长度尺度上被介导。C类：组织稳态、发育和伤口愈合的调节范围为数百微米至厘米。在这里，我们展示了中性粒细胞被招募到上皮细胞的伤口部位。

ECM的主干是一种结构复杂的纤维蛋白结构，如纤维连接蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白，提供了基质的机械性能。细胞通过细胞表面整合素和ECM蛋白的结合基序之间的结合事件来感知这些机制。水合蛋白多糖填满骨架的间隙，隔离可溶性生物分子：生长因子、小整合素结合糖蛋白（SIBLINGS）和基质细胞蛋白。细胞动态重组微环境以释放信号分子，允许迁移，或通过金属蛋白酶（MMPs）等ECM-裂解蛋白和ECM成分的沉积调节细胞功能，两者均受整合素介导的信号通路调节(Daley等人，2008年). 这种重塑对于适当的组织内稳态是必要的，并且在病理和发育状态下变得更加明显。尽管细胞外基质的组成在生物体内各组织间存在显著差异，但了解其一般组成以及在发育和伤口愈合中重塑功能的方式，是3D细胞培养平台的重要设计标准。有关ECM重塑的完整审查，请参阅Daley等人（2008年）.

设计标准

开发用于3D细胞培养的生物活性水凝胶是一个典型的工程问题，需要控制从微米到厘米的长度尺度和从秒到周的时间尺度上的物理和化学特性。为了开发功能性ECM模拟物，凝胶的机械特性、粘附配体和生长因子的呈现、运输和降解动力学必须以细胞相容、可靠和经济有效的方式预先适应给定培养物的需要(格里菲斯和诺顿，2002年;Saha等人，2007年). 此外，这些凝胶的化学性质及其降解产物不会对封装细胞产生有害影响。

传统上，支架的机械和化学特性是在封装过程中设置的，很少有用户或细胞定义的控制后期制作。为了真正模拟ECM，有必要开发一些材料，这些材料的机械和化学特性可以根据细胞发育的时间和长度尺度进行调节，可以由用户外源性调节，也可以由细胞内源性调节。虽然支架的设计是为了模拟天然ECM，但原始培养条件并不是预先精确知道的，因此可以改变凝胶的一个或多个方面的表达，以接近理想细胞反应的适当条件。最终，我们的目标是合理设计生物材料支架，将合成凝胶和天然凝胶的优点融合在一起，以满足强健支架中特定培养系统的需要。

弥合差距

最近在支架工程方面的工作表明，可以设计3D合成微环境来提高细胞活力和直接细胞粘附(Lee等人，2008年)，差异化(Salinas和Anseth，2008年b)，扩散(曼恩和韦斯特，2002年)、和迁移(West和Hubbell，1999年)通过机械和生物化学线索的受控呈现。这些有指导意义的材料通过将仿生信号纳入合成材料中，从而引发所需的细胞-凝胶相互作用，从而弥合了促进凝胶和允许凝胶之间的差距。这些支架可以根据特定的细胞培养要求和设计标准进行定制，并为细胞生物学和再生医学中的受控假设测试提供了新颖且定义明确的ECM模拟物(库欣和安塞思，2007年).

在体内，ECM为细胞粘附提供了一个结合配体的环境，将细胞骨架连接到细胞微环境(Wang等人，1993年). 这些配体鼓励整合素结合事件，将ECM的机制传达给细胞，并通过细胞内信号通路指导细胞命运(Giancotti和Ruoslahti，1999年). 因此，整合素结合事件不仅在细胞粘附中起关键作用，而且在大多数细胞过程中也起关键作用(Howe等人，1998年). 在最简单的情况下，这些结合配体通过物理包裹ECM蛋白（如胶原、层粘连蛋白或纤维连接蛋白）到网络中，在合成水凝胶中被重新组合。这些大蛋白为整合素粘附提供了结合域，并已被证明可提高细胞活力和功能(韦伯等人，2008年). 然而，包埋的蛋白质可以变性、聚集、引入多种结合基序，并且通常在凝胶中不均匀分布，所有这些都混淆了它们的作用。

蛋白质工程的发展使我们能够从所需蛋白质中识别活性肽序列，并将其并入合成水凝胶中(Ruoslahti，1996年). 这允许在生物惰性背景上控制特定结合域的位置(鲁托夫和哈贝尔，2005年)研究RGD和IKVAV等粘附肽序列与细胞功能的相互作用。在PEG支架中，已知纤连蛋白结合结构域RGD的掺入已被证明可以增加包封细胞的活力和粘附力(Nuttelman等人，2005年;Park等人，2005年;Patel等人，2005年). 将RGD连接到合成凝胶上的进一步研究表明，细胞扩散的理想聚集和配体密度(Massia和Hubbell，1991年)和迁移(戈宾和韦斯特，2002年). 新型聚合机理，如光引发的丙烯酸硫醇和硫烯化学(Khire等人，2006年;Rydholm等人，2008年;Salinas和Anseth，2008年a)，允许在常规使用的合成凝胶中方便地加入肽。

从本质上讲，这种结合域的呈现受到空间和时间的调控。例如，在软骨形成过程中，hMSCs通过上调基质金属蛋白酶13（MMP-13）的生成，分化为软骨细胞后7-12天内，纤维连接蛋白被下调，基质金属蛋白酶-13分解纤维连接到蛋白(Sekiya等人，2002年). 为了模拟这种时间控制，将一个对MMP-13裂解敏感的RGD肽序列构建到PEG凝胶中，以便hMSCs能够像自然一样去除RGD，即纤维连接蛋白类似物。这成功地上调了合成环境中的软骨生成，就像体内去除纤维连接蛋白一样(萨利纳斯和安塞思，2008b). 这并不是一个单一的时间呈现示例，设计复杂的凝胶龛来提供这种指导性线索的时间调节变得越来越重要。

类似的概念可以扩展到其他功能肽序列。在原生ECM中，在特定时间向特定位置传递趋化因子（如生长因子）是通过控制储存和释放来介导的(拉米雷斯和里夫金，2003年). 与ECM蛋白一样，生长因子可以简单地被包裹在水凝胶支架内，并在网络降解时释放，因此释放取决于扩散和降解速率(陈和穆尼，2003年). 为了在ECM的蛋白聚糖中复制生长因子的天然窝藏，合成了水凝胶，将肝素与随后释放的蛋白质网络相结合(山口和基克，2005年). 通过将蛋白质特异性配体共价连接到凝胶的骨架上，对该系统进行了改进(Willerth等人，2007年). 这项工作表明需要含有结合配体的凝胶，这些配体可以选择性地结合所需的生长因子，并根据细胞吸收释放因子。此外，控制栓系肽配体的局部浓度会产生趋化因子可用性的空间梯度。在体内，多种可溶性因子协同或拮抗作用，形成更复杂的信号系统，指导组织发育和体内平衡(阿什和布里斯科，2006年). 为了概括这些信号域，凝胶中需要结合多种功能，以在所需时间点隔离并呈现多个正交线索。

通过将生长因子封装在网络主干中具有MMP可切割序列的凝胶中，实现了细胞所需的生长因子释放(Zisch等人，2003年). 具体而言，Michael加成已被用于构建末端功能化PEG和巯基标记MMP可裂解肽序列的网络。当细胞通过切割MMP敏感肽序列暴露VEGF时，将血管内皮生长因子（VEGF）并入该网络诱导血管形成(Zisch等人，2003年). 这种细胞介导的释放更好地模拟了天然生长因子的隔离，可以与肽结合系统结合，形成更具活力的系统。

随着生化技术的进步和新的小分子靶点，如微RNA（mRNA）、小干扰RNA（siRNA）和RNA适配体，得到了更好的理解，用于传递大可溶性因子的方法需要扩展，以呈现能够在3D环境中帮助精确调节基因表达的小分子。

虽然这些方法模拟ECM的生物化学方面，但合成水凝胶通常无法捕获细胞微环境的生物物理结构（例如，胶原蛋白的纤维结构和ECM的细胞重塑潜力）。为了重建细胞微环境的原生结构，通常需要将其降解为合成ECM类似物，以便活细胞能够沉积自己的ECM(布莱恩特和安塞思，2002年)，迁移(Raeber等人，2007年)并经历形态发生(马奥尼和安塞斯，2006年). 合成水凝胶已被设计为通过掺入聚乳酸进行水解降解(Metters等人，2000年)或聚己内酯(Nuttelman等人，2006年)单元接入网络骨干网。在这些支架中，水解键的初始数量决定了降解速度，但一般来说，降解速度比正常细胞过程慢。末端功能化PEG和巯基标记的MMP可裂解肽序列的Michael加成和光引发反应也可用于创建合成水凝胶，其降解是由细胞驱动的(鲁托夫等人，2003年)而且时间跨度要短得多。MMPs的增加使细胞能够重塑这种合成环境，迁移和沉积自己的ECM，就像在体内一样。这种在微环境结构和细胞行为之间具有动态反馈的系统对于研究迁移、肿瘤形态发生和肿瘤转移将非常有用。

即使使用可降解的合成水凝胶，网络的亚细胞孔隙度也会对细胞迁移、增殖和分化以及可溶性因子的正确分布造成障碍。这些网络通常不具有ECM蛋白质主干的纤维网络结构。为了解决这一问题，需要设计一种能够连接牢固自组装的支架(Hartgerink等人，2001年)或使用可降解合成水凝胶的纳米制造技术，以更好地再现天然ECM生物力学结构的关键方面。

期待

虽然聚合物化学的进步正在推动复杂合成生物凝胶的发展，但在这种微环境中哺乳动物细胞的3D培养并非没有挑战。首先，氧的可用性需要特别注意，因为细胞距离代谢活跃组织中的高氧源小于100µm(Palsson和Bhatia，2004年). 第二，与2D表面相比，向三维移动夸大了合成细胞微环境中存在的异质性。在3D支架中，材料特性可能会出现梯度和缺陷，蛋白质可能会受到扩散限制，导致异质分布，并且随着培养基在凝胶中扩散，会出现氧气和营养梯度。第三，调节影响细胞分化和组织稳态的可溶性生长因子的分布在3D网络中变得更加复杂，因为分布取决于介质中的体积浓度、凝胶中的扩散和细胞摄取。最后，用于成像和分析细胞功能和蛋白质分布的标准技术更多地涉及3D环境。在3D网络中工作时，细胞的免疫染色或DNA/RNA提取的可及性有限，分泌的蛋白质可能难以从凝胶中提取。细胞成像通常很复杂，因为光散射、折射和衰减发生在3D复合材料中，即细胞凝胶。

这些挑战表明，需要复杂的技术以及复杂的水凝胶环境，以将实时生物分析能力与材料环境的实时操作相结合。原生ECM远非静态的；因此，为了促进复杂的细胞行为，ECM模拟也必须是动态的。为了使用这些系统进行假设测试，必须对整合素结合配体的时空呈现、生长因子释放和生物力学特性进行用户定义的控制(图4). 该领域为动态脚手架制造提供了基础，新兴工作提供了用户定义的控制。例如，“点击”化学被用来封装细胞并将粘附配体附着到网络后加工上，而光敏化学被用来在空间和时间上调节凝胶的机械和生物化学特性(Kloxin等人，2009年). 将这些化学物质与其他细胞相容的正交化学物质结合起来，将为在规定的三维体外合成环境中测试细胞与ECM的相互作用和机械传递提供一个模板。最后，从3D材料环境中释放细胞、蛋白质和其他生物分子的方法需要构建到这些平台中，以便复杂的生物分析能够更好地了解基质相互作用对细胞功能的作用。

在单独的窗口中打开

图4

合成-生物水凝胶包含几种定义明确的正交化学物质，可作为强大的ECM模拟物用于3D细胞培养。根据应用程序的不同，将材料属性的单元或用户定义的规则结合起来以模拟本地动态环境可能是有利的。然而，在许多情况下，结合细胞和用户定义的化学物质的合成水凝胶是必要的。在这里，我们展示了一种细胞裂解MMP可降解交联物（黄色圆圈），使其能够访问隔离的生长因子（红色）和整合素结合位点，如RGD（绿色圆圈）。最终，这种分裂允许细胞运动和ECM蛋白（橙色纤维）的沉积。用户定义的化学物质，如光降解交联物（蓝色椭圆）和RGD在凝胶后附着到网络主干，可以方便地控制凝胶的动态生化和生物物理性质，从而指导细胞附着和运动。此外，外源性应用酶（棕色）可以允许用户定义的螯合生长因子的释放。

结论

当使用合成水凝胶作为ECM模拟物时，有必要了解细胞的自然环境，即细胞与ECM相互作用、重塑和迁移。为了从体外细胞培养中获得生物学相关的结论，必须在3D环境中重述关键基质因子。在组织发育的情况下，让细胞像在体内一样控制自身环境的变化可能是有利的；然而，用户自定义的机械和生化特性控制有助于测试3D组织模型中特定细胞与ECM相互作用的复杂假设(图4). 设计理想ECM模拟物的途径取决于手边的培养物，但可能需要多种正交化学反应。例如，可使用光稳定性化学物质侵蚀凝胶区域，随后可在新暴露的表面涂上粘性配体，以鼓励细胞粘附和迁移。由细胞和用户控制的化学物质相互渗透网络形成的更复杂的支架将出现。最终，没有一个单一的网络可以模拟每种组织类型的复杂ECM，但将生物灵感线索合理地结合到合成凝胶中，可以为许多细胞培养系统提供强大而多样的支架。

工具书类