TFF2 mRNA转录表达标志着胃粘膜的腺体祖细胞

摘要

介绍

组织干细胞在形态学上很难识别，也不容易与其他上皮细胞区分开来。他们的特点是多潜能和自我更新能力。组织干细胞或祖细胞位于“生态位”内，该区域为正常分化提供最佳微环境。¹干细胞数量很少，被认为基本上保持静止或以非常缓慢的速度分裂，因此它们的增殖标记为阴性。相反，Ki67、增殖细胞核抗原（PCNA）或5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）等增殖标记物标记的是传递扩增祖细胞，即位于干细胞附近的干细胞的直接后代。转运扩增祖细胞分裂迅速，负责大部分细胞分裂，但似乎寿命有限，并定期被真正干细胞的后代取代。然而，最近的数据表明，某些类别的肠干细胞可能正在积极分裂，细胞周转率高于先前的推测。²

在胃含氧腺中，包含假定胃干细胞的增殖区定位于腺峡部。细胞从峡部双向迁移，向上分化为覆盖胃凹坑的胃表面粘液细胞，向下分化为胃壁细胞和产酶细胞。^三遗传嵌合体小鼠的分析^4,5人的体细胞线粒体突变⁶表明大多数胃单位都是单克隆的，大多数上皮细胞都来源于单个干细胞。⁷尽管几十年来胃干细胞一直是研究的对象，但可能除了通过氚-胸腺嘧啶标记、电子显微镜放射自显影和化学诱变的研究外，还没有发现胃干细胞。^8–12这些研究有助于确定前凹坑、前颈部和前壁细胞，这些细胞来源于一种更未分化的无颗粒细胞，即胃上皮的潜在干细胞。正如EM最初定义的那样，这些罕见的细胞位于峡部中心，通常是静止的，很少分裂产生祖细胞。^8–11因此，在这些早期研究中，酶原或主细胞来源于颈部细胞，而壁细胞来源于单独的祖细胞，尽管该模型最近被修改，以表明人类的主细胞和壁细胞起源有一些重叠。^三

一个经过验证的干细胞标记物LGR5在一些胃窦腺中显示谱系标记，并可能标记胃窦干细胞或祖细胞。^13,14在含氧粘膜中，虽然激光捕获显微切割小鼠胃和小肠上皮祖细胞的测序中发现了潜在候选物Dckl1，但尚未实现类似的谱系追踪。¹⁵然而，迄今为止，关于长寿祖细胞存在的直接证据有限，尽管一项涉及随机上皮细胞化学诱变的研究表明，克隆仅包含单一成熟细胞类型，表明胃上皮中存在承诺祖细胞。¹²

三叶因子家族2（TFF2），也称为解痉多肽，是一种在离散细胞群中与Mucin 6（Muc6）共表达的小肽。TFF家族有三个已知成员（TFF1、-2和-3），它们都包含类似于三叶三叶的三圈结构基序。在正常条件下，TFF2由胃粘膜颈细胞和胃窦深层腺粘液细胞表达和分泌，来自敲除小鼠的数据表明它在胃细胞保护和修复中起着重要作用。¹⁶上皮损伤后强烈诱导三叶，通过刺激细胞迁移促进短期（恢复）和长期（腺体再上皮化）修复过程，¹⁷抑制细胞凋亡¹⁸减少抗原进入愈合上皮。¹⁹此外，它们受促炎和抗炎细胞因子表达的调节，^20,21并被假设通过调节免疫细胞迁移，可能通过CXCR4受体参与粘膜免疫反应。²²虽然已经报道了TFF2的一些潜在生物学作用，但对TFF2功能的准确理解仍然很难。TFF2基因的表达与粘膜增殖区的扩张似乎有关系，这增加了TFF2可能参与调节上皮增殖或分化以应对损伤的可能性。此外，壁细胞的丢失会在小鼠和人类中诱导TFF2表达的化生谱系（SPEM）的发育。²³

虽然TFF2蛋白的表达仅限于黏液颈细胞，但原位杂交研究表明，TFF2 mRNA的表达位于胃峡部颈部以上，²⁴提高TFF2 mRNA转录表达是胃干细胞或祖细胞标记物的可能性。使用由TFF2启动子控制的他莫昔芬诱导的Cre重组酶，我们确定了一群TFF2转录表达（TTE）细胞是壁、粘液颈和产酶细胞系的特异性祖细胞，但不适用于含氧胃粘膜中的凹坑或ECL细胞系。因此，虽然先前的研究表明，体粘膜干细胞产生三个二级转运扩增细胞群（前窝、前颈和前顶叶），但这些结果与一个模型一致，即TTE细胞代表一个腺体谱系祖细胞群，然后产生粘膜颈和顶叶细胞。

方法

为了进行Bac重组，将CreERT2FltNeoFrt盒连接到ATG上游的p451质粒和下游的40bp质粒中，替换198bp的外显子1。在CBA×C57BL/6J受精卵母细胞的原核内微量注射BAC DNA。在回交（F6）到C57BL/6后，三个创始人中的两个与B6.129S4交配-Gt（ROSA）26Sor公司^tm1索尔/J、 称为Rosa26R-lacZ或B6；129-Gt（ROSA）26Sor公司^tm2位置/J、 称为Rosa26R-GFP（Jackson Laboratories），并进行组织学分析。有关详细方法，请参见 补充信息.

结果

TFF2启动子依赖性Cre在胃、肺、肾和十二指肠中的表达

利用可诱导的Cre重组酶进行谱系追踪，已成为分析干细胞后代的一种强大策略。使用重组方法，我们用三苯氧胺诱导的Cre产生了三个阳性的转基因小鼠创始株^ERT2系统由BAC-TFF2启动子驱动(图1A). 获得的转基因TFF2-Cre^ERT2系统RT-PCR分析小鼠胃体和胃窦中TFF2和Cre的表达(图1B)和IHC(图1C)，通常位于已知的TFF2蛋白表达定位之上就地TFF2的杂交和蛋白染色(图1E). 转基因小鼠在肝脏、脾脏、肌肉和胰腺中没有Cre表达（数据未显示）。总的来看，TFF2-Cre^ERT2系统小鼠的Cre表达模式与内源性TFF2 mRNA表达一致，位于TFF2蛋白表达之上。

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图1

（A） 将CreERT2FltNeoFrt盒插入含有TFF2基因的BAC中。（B） TFF2-Cre胃体和胃窦的RT-PCR^ERT2系统以肝脏为阴性（−）和TFF2-plasmid为阳性（+）对照的小鼠。（C） 未诱导TFF2-Cre中的Cre（绿色）和TFF2（红色）IHC^ERT2系统小鼠（DAPI蓝色）。（D） 三苯氧胺连续三天给药后，在胃窦腺、十二指肠Brunner腺、肺、肾近端小管和肾小球的1至4个位置观察到LacZ+细胞。（E） 在C57BL/6小鼠的体和胃窦中，通过IHC（右）和通过原位杂交（左）的TFF2 RNA表达TFF2蛋白的特征。

在回交到C57BL/6J背景后，我们将TFF2-Cre^ERT2系统转Rosa26R-lacZ或Rosa26R GFP报告小鼠的转基因小鼠。注射三苯氧胺激活Cre^ERT2系统TTE细胞中的酶，以及C介导的对Rosa26报告者中漂浮的STOP盒的切除，然后不可逆地标记TTE细胞和这些细胞的任何后续后代，从而促进谱系追踪(图1A).

为了可视化胃体腺体中TTE细胞的位置，我们分析了三苯氧胺诱导48小时后2–3个月大的小鼠。带有GFP或LacZ信号的单个细胞仅在胃体中胃腺的峡部区域很少出现(图2A和B). 大多数情况下，地峡中的几个细胞（5-10）被标记。在非诱导小鼠中未观察到LacZ或GFP的表达(图2B)，不包括Cre表达式的任何泄漏。单剂量三苯氧胺可激活高达10%胃腺中Cre的表达，连续三天给药可使其增加至约30%的腺体（数据未显示）。三苯氧胺治疗本身并没有引起胃内任何细胞变化。先前在肠道血统追踪实验中观察到的所有腺体中都没有统一表达，这是由于服用三苯氧胺或Cre的不完全或镶嵌表达有关的问题^ERT2系统转基因。在语料库中，所有Cre-GFP或Cre-LacZ标记的细胞都出现在峡部或上颈部区域，与过去观察到的TFF2 mRNA类似，而标记的细胞则出现在窦腺的1到4个位置(图1D). 因此，在这些早期时间点，GFP和LacZ的表达等同于TFF2 mRNA，但不一定是蛋白表达。

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图2

（A） 用三苯氧胺治疗2-3月龄小鼠，48小时后处死。胃体胃腺峡部出现单个GFP+和LacZ+细胞（箭头所示）。（B） （左）语料库中特征性TFF2抗体染色；TFF2-核心^ERT2系统无三苯氧胺诱导的体；TFF2-Cre的LacZ染色^ERT2系统三苯氧胺脉冲（底部的方案）后，小鼠的胃体腺中LacZ+细胞数量增加。

我们还观察到十二指肠Brunner腺体中LacZ的表达(图1D)，其中蛋白质表达已在前面描述过。我们在肺部检测到罕见的LacZ阳性细胞，其中TFF2在显示粘液细胞表型的气道细胞亚群中表达，并且已知TFF2表达在过敏性气道炎症期间上调(图1D).²⁵我们观察到LacZ在肾脏近端小管和肾小球中的表达，尽管缺乏蛋白表达，但仍描述了TFF2 mRNA的表达(图1D).²⁶令人惊讶的是，尽管我们和其他人之前已经描述过淋巴细胞中TFF2基因的表达，但我们并没有观察到脾脏中LacZ的表达。²²然而，我们在胃组织中观察到GFP阳性淋巴细胞（数据未显示）。

胃中TFF2谱系追踪

接下来，三十（30）个2-3个月大的TFF2 Cre^ER2公司用三苯氧胺诱导转基因小鼠，并在第1天至第10天每天处死，每隔一天处死直至20天(图2和数据未显示）。诱导后第1天，在下丘脑峡部偶尔检测到单个LacZ阳性细胞，但在腺体下部不存在。诱导后5至10天，我们在粘液颈细胞区和胃腺中部观察到多个LacZ阳性细胞，偶尔在胃腺上部发现LacZ阴性壁细胞(图3&4). 20天内，大多数胃体腺体显示多个LacZ阳性细胞延伸至腺体底部。在每个时间点，对语料库中的50个腺体进行计数，以确定含有LacZ+细胞的百分比。第1、5、10和20天后，胃腺中LacZ+的百分比分别为5%（+/-0,7%）、12%（+/-2,1%）、24%（+/-4.3%）和32%（+/−3,8%）。因此，随着时间的推移，TTE细胞似乎能够在胃含氧粘膜中产生越来越多的细胞和多个腺体谱系。相反，在胃窦或十二指肠中未观察到谱系追踪，在第1、5、10和20天，在相同位置观察到类似数量的LacZ阳性细胞。有趣的是，我们从未观察到胃体腺体表面细胞的谱系追踪，这表明TFF2转录的表达标志着腺体细胞的祖细胞，而不是小窝细胞。

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图3

不同特征细胞标记物（TFF2-Cre）的双重染色^ERT2系统无性系：绿色；AB：红色；DAPI蓝；TFF2-Ab：绿色）。TM后20天，（A）TFF2在体部和（B）在胃窦部的代表性图片）。（C） 三苯氧胺在体内5d后Ki67染色。（D） 表达TFF2蛋白的黏液颈细胞不会与Ki67共同染色。（E） 三苯氧胺后3d的GFP克隆位于体中TFF2蛋白表达细胞的上方。在TM后40天，（F）固有因子+（IF）和（G）H/K-ATPase+细胞对GFP-reporter进行双重染色。（H）Dclk1、（L）细胞角蛋白-19、（K）嗜铬蛋白-A（CgA）、（J）生长抑素和（I）胃泌素没有与GFP共定位。箭头表示单个GFP+克隆（绿色）、单个AB阳性克隆（红色）和双阳性克隆（黄色）。

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图4

长寿壁细胞和主细胞的标记：（A）三苯氧胺诱导TFF2+后5天，但没有内源性因子+（IF）染色GFP+克隆。三苯氧胺诱导20天后，标记腺体中的克隆细胞染色为H/KATPase，而内源性因子（IF）染色较少。箭头表示单个GFP+克隆（绿色）、单个AB阳性克隆（红色）和双阳性克隆（黄色）（B）10个标记腺体中表达GFP的粘液颈（TFF2）、壁（H/K-ATP酶）和主细胞（IF）的定量评估（SEM平均值）。

主细胞和壁细胞系的寿命

接下来我们分析了祖细胞及其后代的寿命。如上所述，三苯氧胺诱导20天后，标记腺体中的大多数壁细胞来自TTE祖细胞，但此时峡部以下只有少数IF阳性主细胞被标记(图4A). 三苯氧胺诱导后五十（50）天，大多数表达IF的主要细胞为GFP（+），表明TTE细胞向主要细胞的分化相对于颈部和顶叶细胞的分化延迟。因此，我们诱导了三十（30）个TFF2-Cre^ERT2系统/连续3次注射三苯氧胺的Rosa26R-GFP小鼠，在5、50、80、100、120、160和180天后分析GFP的表达(图5)阐明TTE细胞子代的时间依赖性迁移。

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图5

TTE祖细胞的长期标记：连续三次服用三苯氧胺后，在TFF2-Cre中分析GFP的表达^ERT2系统/Rosa26R-GFP在第5、10、50、80100120和160天（底部的方案），以跟踪表达TFF2的细胞后代的迁移。

正如早期实验所预期的那样，我们观察到GFP的表达(图5)5天后在颈部粘液细胞中。三苯氧胺诱导五十（50）天后，近100%的壁细胞和大多数主细胞被GFP染色(图5). 相反，在三苯氧胺诱导后80天，仅能检测到罕见的GFP（+）壁细胞，而胃腺中的大多数主要细胞仍为GFP（＋）(图5，未显示与IF共同染色）。在三苯氧胺诱导后100、120和160天，我们观察到胃体腺体中GFP的表达随着时间的推移而逐渐减少，这些腺体从上到下标记，反映出主细胞向腺体底部迁移，并不断被未标记的主细胞取代。最后，180天后，只有5%的细胞被标记，200天后，只有2%的腺体显示出GFP表达细胞，这表明标记细胞在随后的时间点完全消失(图5).

图4E显示了不同时间点表达GFP的黏液颈细胞（TFF2）、壁细胞（H/K-ATP酶）和主细胞（IF）的定量评估。三苯氧胺诱导五（5）天后，在10个GFP标记和双重染色的腺体中平均发现10个壁细胞、2–3个黏液颈细胞和0–1个主细胞。GFP克隆中的黏液颈细胞数量在三苯氧胺诱导后20天增加（12个细胞/腺），壁细胞数量在诱导后50天增加（49个细胞/腺体）。随后，在三苯氧胺诱导后第80天，主要细胞最大限度地来源于GFP标记的祖细胞（47个细胞/腺体），在随后的时间点，GFP标记主要细胞减少，如上所述。这些观察结果表明，单个壁细胞平均存活30-50天，单个主细胞存活约120-140天。此外，数据表明，GFP标记的TFF2 mRNA转录表达的祖细胞可能存活约20天，然后被新的祖细胞取代。

TFF2 mRNA转录表达的祖细胞不是SPEM的起源细胞

在小鼠胃中，慢性继发性氧化性萎缩H.猫科动物感染与壁细胞丢失和表达解痉多肽的化生（SPEM）的出现有关。²⁷TFF2在异型增生细胞中的表达表明，SPEM可能是异型增生和肿瘤形成的前体H.猫科动物–受感染的小鼠。²³虽然SPEM与异型增生转化之间的联系尚待进一步阐明，但许多研究支持这样一种观点，即SPEM并非完全由黏液颈细胞的扩张引起，而是可能由主细胞的脱分化引起。³¹

我们小组先前的研究表明，DMP-777的短期治疗会导致高胃泌素血症、顶叶细胞损失、小凹增生以及SPEM的出现。²⁷有趣的是，SPEM谱系的特征之一是同一细胞中TFF2 mRNA转录物和TFF2蛋白的高水平表达。^32,31因此，我们试图评估DMP-777对胃氧化粘膜中TFF2谱系的影响。DMP-777给两组三个TFF2-Cre^ERT2系统/Rosa26R-GFP小鼠持续7天，以评估氧化性萎缩发病期间发生的变化，因为发现在DMP-777治疗的7天内出现了表达TFF2的SPEM。一组在给药DMP-777前一天用三苯氧胺诱导，另一组在第7天给药DMP 777后诱导。两组均于第10天处死。与未经处理的小鼠相比，在所有DMP-777处理的小鼠中观察到TFF2表达SPEM(图6). TFF2抗体染色显示，在DMP-777治疗前诱导Cre时，腺体底部表达TFF2蛋白的SPEM细胞不表达GFP。然而，当三苯氧胺在DMP-777治疗7天后诱导Cre时，我们观察到SPEM中有较强的GFP表达(图6). 这些数据表明，SPEM至少部分起源于底部的转分化主细胞，而不是胃体腺体峡部的祖细胞。

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图6

DMP-777对胃氧化粘膜TFF2谱系的影响：TFF2-Cre体中的TFF2染色^ERT2系统/Rosa26R-GFP无DMP-777治疗和有DMP-777d治疗。TFF2-Cre中TFF2染色的代表性图片（N=3）^ERT2系统/在DMP-777给药前一天和DMP-777给药后第7天用他莫昔芬诱导Rosa26R-GFP小鼠。两组均于第10天处死。

讨论

虽然已经鉴定了用于肠道、结肠和胃窦的活性分裂干细胞（Lgr5+），¹³与干细胞不同的特异性短寿命氧化腺祖细胞尚未被鉴定。胃含氧粘膜的血缘关系已经被假定，但到目前为止还没有被证实。TFF2肽在移出胃峡部的黏液颈细胞中明确表达。然而，在本研究中，我们证实了早期观察结果，即表达TFF2肽的黏液颈细胞中不存在TFF2 mRNA转录物，²⁸而是在胃峡部干细胞区内的祖细胞中。TFF2转录表达（TTE）祖细胞增殖并向下迁移至氧化腺底部，产生黏液颈部、壁细胞和主细胞，但不产生凹陷或肠内分泌谱系。因此，TFF2 mRNA表达定义了一类新的腺祖细胞。

虽然TTE细胞是多潜能祖细胞，但它们显然不是干细胞，因为它们在峡部的存活时间不会超过20天，而是经常被新的祖细胞所取代，而新的祖电池很可能来源于尚未定义的干细胞。此外，与TFF2蛋白表达细胞相比，它们似乎具有高度增殖性，因为细胞增殖在胃体TFF2腺体颈部上方峡部的TTE细胞中最明显。值得注意的是，识别一个独特的短寿命祖细胞标记似乎是一个新的观察结果，支持了先前研究中提出的活性或静止干细胞产生短寿命祖或转运扩增细胞的概念。¹²然而，我们观察到TTE细胞与表达Dclk-1（一种相对较新的假定干细胞标记物）的细胞非常接近。³³在肠道上皮祖细胞中发现了Dclk-1，¹⁵和Karam等人。^三描述了一个位于同一位置的体粘膜干细胞，它在峡部产生祖细胞作为无颗粒细胞，但这仍有待验证。

虽然之前的研究使用氚-胸腺嘧啶核苷和放射自显影术来追踪祖细胞，^8–11目前的研究使用了一种可诱导表达Cre的转基因来确定谱系关系的性质和胃腺细胞周转的动力学。在三苯氧胺诱导后，我们观察到峡部下方快速出现TTE细胞衍生的LacZ或GFP阳性子代细胞，证实了这些细胞的活跃增殖状态。在5–20天内，LacZ或GFP阳性的子代可分布在腺体底部，但不分布在体单位的凹坑中，从而提供了胃此区域自我更新发生率的估计值。TTE细胞产生（1）存活约20天的黏液颈细胞，（2）存活约40天的壁细胞，以及（3）存活长达140天的主细胞或产酶细胞。如前所述，这些发现和时间进程与黏液颈细胞产生主细胞的模型一致。^三然而，TTE细胞的谱系追踪不能准确区分黏液颈细胞的寿命，也不能最终证明颈细胞产生主细胞，因为我们不能明确排除TTE细胞向下迁移并直接分化为主细胞（绕过黏液颈阶段）。胃窦部的结果不同，其中TFF2蛋白和TFF2-Cre诱导的LacZ或GFP表达具有很好的相关性。胃窦中的TTE细胞似乎没有迁移，存活了40天，因此在远端胃中不代表任何类型的干细胞或祖细胞。

虽然粘液颈的祖细胞和主要细胞之间的密切关系已经被人们认识了很多年，但顶叶细胞也起源于同一祖细胞的发现已经被假设，但以前没有被证明。因此，根据先前的观察，^三我们提出了一个模型(图7)其中一个共同的祖细胞，即TTE细胞，产生三种主要的氧化腺细胞类型，即壁细胞、粘液颈细胞和主细胞。TTE祖细胞不作为窝表面黏液细胞谱系的祖细胞，³⁴也不适用于肠内分泌细胞，因此目前的模型表明，这些细胞类型直接或通过单独的祖细胞来源于干细胞。Karam等人已经证明颈前细胞是增殖的，正如我们已经证明的TTE祖细胞。这两种细胞都产生壁细胞系和主细胞系，因此我们得出结论，TFF2-Cre转基因标记了颈前细胞。该模型为胃萎缩的发展提供了一些有趣的可能性，胃萎缩是一种与壁细胞和主细胞丢失相关的组织病理学条件。理论上，这种损伤可能是由于TTE分化停滞所致，尤其是因为胃萎缩中幸存的谱系是肺泡谱系和内分泌谱系。萎缩还与化生黏液颈细胞的积聚有关，这被称为假幽门化生或SPEM。在目前的研究中，我们发现DMP-777治疗后，SPEM似乎部分来自胃腺底部的第二个增殖区。²⁷我们的数据表明，腺体底部表达TFF2的细胞最初可能来自主细胞的转分化，而不是来自峡部的祖细胞迁移，然而，还需要进一步的工作来证实这些观察结果。³¹这一发现也反映了表达TFF2蛋白的黏液颈细胞与不表达TFF2，但能随着微环境条件的改变而重新激活TFF2表达的主细胞之间的密切关系。有趣的是，最近一项使用Mist1 cre谱系追踪的相反实验证明了在用DMP-777处理后主要细胞转分化为SPEM的类似发现（Nam和Goldenring，提交).

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图7

提出的氧化谱系模型：共同祖细胞（TTE）产生壁细胞、黏液颈细胞和主细胞，但不产生窝细胞谱系。干细胞，无论是活跃的还是静止的，都会产生窝谱系祖细胞和TTE氧化腺祖细胞。

最后，观察到TFF2转录表达代表一个氧化祖细胞的标记，这本身并没有阐明TFF2蛋白的任何特定功能。对TFF2基因敲除小鼠的研究表明，随着基因功能的丧失，细胞分化和增殖率发生了轻微变化。¹¹因此，我们推测TFF2 mRNA和蛋白功能可能在某种程度上对祖细胞水平的细胞命运决定作出贡献。胃祖细胞中TFF2蛋白表达缺失的发现也引发了对祖细胞特异性蛋白翻译阻滞机制的质疑。需要进一步研究来阐明这些机制。

补充材料

致谢

本文中使用的缩写

脚注

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