一种突出肺癌组织复杂性的自动分割方法

摘要

介绍

世界卫生组织（WHO）制定并定期修订肺癌分类指南。¹肺癌分类的原则是将预后相似的患者群体分组，以便开发和应用最有可能改善临床结果的治疗方法。世卫组织指南有助于根据癌细胞的起源及其结构对肺癌进行系统分类。然而，癌结节是一种复杂的生物量，包含癌细胞以及各种其他细胞组织类型，包括但不限于纤维化和坏死组织。这些不同细胞组织类型在比例、毗邻和混合方面的排列对于理解癌症的生长很重要，并可能对患者的诊断、预后和治疗计划产生重大影响。

为了全面了解整个根瘤生物量中组织类型分布的含量和结构，需要确定和分割根瘤的细胞含量。开发一种肺结节结构的可控评估方法有利于临床和研究环境。为了扩展对癌症生长模式的了解，澄清肺癌分类和结果，以及为基于生物病理学的诊断方法制定抽样标准，有必要清楚了解构成肺结节生物量的组织学组织类型之间的组成和关系。

最近的研究发现，肺结节内组织类型（如纤维化成分）的比例与预后之间存在有价值的联系。^{6,12,16,20,23–25}前岛等。发现结节内容物的纤维化比例是一个独立的预后因素，纤维化成分的增加与生存率的降低直接相关。¹²铃木等。报道了一个类似的发现，在直径小于3cm的原发性肺腺癌患者中。他们发现直径小于5mm的中心纤维化患者的5年生存率为100%，而中心纤维化区域较大的患者的5年间生存率不到74%。²³在井上进行的一项检查小型（<2cm）肺腺癌的研究中，发现坏死是一个消极的预后因素等。⁶此外，发现含有坏死成分的肿瘤具有较高的淋巴结侵袭发生率。

然而，所有这些研究都依赖于组织病理切片的定性评估来对特定组织类型的外观进行评分或分级，而这只对结节的完整组成提供了有限的了解。本文介绍了使用自动分割方法评估肺癌结节，对这些先前报道的研究进行了极具价值的扩展。所开发的分割方法本质上是定量的，不依赖于人工观察。此外，该方法不仅可以评估组织类型比例，还可以评估整个结节体积中现有组织类型之间的关系。

癌症结节复杂结构含量的表征仅限于二维（2D）金标准组织病理学数据的采样，假设二维透视图可以外推来表示体积。随着体积成像技术的进步，如多排探测器计算机断层扫描（MDCT）、磁共振成像（MRI）和正电子发射断层扫描（PET）成像，相应的体积组织病理学将越来越受到重视。肺癌结节的综合体积组织病理学数据集将克服结构特征的采样限制，需要评估使用随机组织学采样推断真实结节组织结构的有效性。

已经开发了一个广泛的过程模型，用于肺结节多模态容积数据集的采集、操作和图像采集。²¹设计过程模型的一个挑战是需要专家病理学家手动分割组织学数据集中感兴趣的组织类型，这是一项耗时且主观的任务。在这项研究中，我们报道了一种从组织学上自动分割和标记肺结节组织类型的技术。

以前研究肿瘤组织病理学自动分析的重点是使用标准苏木精和伊红（H&E）染色鉴定和评估核形态^7,8,18,27或免疫组织化学染色²用于区分良性和恶性组织样本。这些研究的结果旨在纳入临床环境，以帮助自动分析活检样本，尤其是乳腺癌活检样本。然而，这项研究的目的是开发一种方法，不仅可以通过肺结节的癌变部分，还可以通过完整生物量中的含量和关系来获得更深入的了解。

为了帮助癌结节和非癌结节内容的自动分割，我们探索并建立了一种特殊的染色方法，该方法结合了免疫组织化学和基于Masson三色法的反染色。Masson’s Trichrome是一种有用的三色染色方法，用于在组织学数据中产生高水平对比，尤其是胶原蛋白和其他嗜酸性结构之间的对比。²⁶它已广泛应用于突出疤痕组织的领域，如肾脏的肾小球硬化^11,13,22或肝硬化。^三,10,19免疫组织化学和Masson三色染色相结合已被用于辅助使用两种连续切片评估心肌梗死¹⁷并将免疫组织化学与Masson’s Trichrome作为副染色相结合。⁹然而，这种联合染色方法在癌症数据中的应用，以帮助自动分割，以前还没有描述过。

方法

手动细分

用于肺癌临床诊断的最广泛的染色方法是H&E。一位在肺部病理学方面具有亚专业专长的外科病理学家分析了数字化H&E组织学图像（J.W.）。使用Intuos图形板和笔（Wacom，Vancouver，WA）生成对应于不同组织类型的图像遮罩。肺腺癌H&E切片的手动分割生成的组织型掩模示例如所示图1识别和分割的细胞组织类型包括：；癌细胞、支气管肺泡癌（BAC）结构中的癌细胞、坏死细胞、活性成纤维细胞基质组织、非活性（透明）纤维化、血液和正常组织的固体区域。

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图1

一位拥有肺亚专业的病理学家手动追踪数字化H&E组织切片，生成一组单独的组织类型图（二进制图像），这些图像可以组合成单个代表性图像。病理学家确定的组织类型包括癌性肿瘤（实体和支气管肺泡表现）、坏死、活动和非活动纤维化组织、红细胞和正常组织。此图像分割需要大约两个半小时才能完成（原始图像放大20倍）。

为了手动追踪这些组织类别，建立了一组定义，以促进数据集之间的一致性。癌症（固体）被鉴定为癌细胞的固体分组。癌症（BAC）被定义为遵循BAC侵袭模式的癌细胞，这是一种非实体的肺泡模式。任何来源的死细胞，包括癌细胞，都被认定为坏死。超过50%的细胞为成纤维细胞的组织区域被归类为活动性纤维化。非活动性纤维化定义为成纤维细胞与胶原混合，其中不到50%的细胞是成纤维细胞。血液被确定为红细胞群（红细胞）。

手工追踪组织切片的任务非常耗时，每个切片需要1到3小时才能完成。这是一个昂贵的过程，因为由于定义组织边界的复杂性，需要具有肺部病理学专业知识的病理学家进行这些追踪。由于人类观察者的组成，组织类型边界的定义可能存在一些不一致，并且在细节水平和完成追踪图所需的时间之间也存在权衡。

自动细分

专业染色方法

细胞角蛋白（CK）存在于上皮细胞的细胞骨架中，可有效识别上皮源性癌。此外，20种不同形式的人类CK的不同组合可以用来表征低分化癌。¹⁴因此，CK被选为突出癌细胞的免疫组织化学靶点。值得注意的是，CK免疫组织化学并不选择性地靶向肿瘤上皮细胞（与正常上皮细胞相比）；然而，在本研究队列中，正常、非肿瘤细胞在生物量中所占比例很小，因为我们几乎只位于外周肺的肺泡区。为了确保任何非小细胞肺癌结节中所有癌细胞的免疫组织化学染色呈阳性，我们将一些CK权重作为目标。CK鸡尾酒由抗CK 7（1:50，Dako Corporation，Carpindia，CA）、CK 8/18（1:200，Abcam，Cambridge，MA）的单克隆小鼠抗体和pan-CK抗体组成；AE1/AE3（1:200，Chemicon Int，Tenegula，CA）。用山羊抗鼠辣根过氧化物二级抗体进行定位，并与DAB反应。为了产生尽可能一致和可靠的免疫组织化学染色，使用了自动免疫染色系统（Dako Corporation，Carpindia，CA）。每次染色都伴随着一张玻片，玻片上标记有与主要抗体相同的同型和浓度的非特异性IgG抗体，作为对照。

苏木精和马尾松三色色素的变异被用于反染色的适用性。苏木精是一种简单的细胞核染色，因此突出了所有细胞类型的细胞核。马森三色染色是一种更复杂的染色过程，涉及多种染料，用于分化肌肉、胶原、纤维蛋白和红细胞。该染色技术的试剂包括：Bouin固色剂、Biebrich猩红、Weigert铁苏木精、磷钨酸-磷钼酸溶液和苯胺蓝，当依次应用时，得到的染色颜色为核素黑、细胞质粉红色、红细胞和肌红以及胶原蛋白蓝。对传统的Masson三色染色法进行了两种改进。第一种方法（Mod 1）排除了Bouin的固定步骤，第二种方法（Mod 2）包括Bouin固定步骤，但排除了Weigert的铁苏木精。在这些染色组合中，用Masson’s Trichrome（Mod 2）复染的pan-CK混合物被发现在感兴趣的组织类型之间产生最大的对比。特别的优点是，非活动性和活动性纤维化区域之间的对比度增加，致密的胶原纤维染色为蓝色，主要是弹性型基质染色为粉红色。为了增加复染过程的一致性，使用了一种自动滑动染色器DRS-601（美国加利福尼亚州樱花Finetek）。将免疫组织化学与改良的Masson’s三色染色相结合，形成的染色方案需要大约八倍的处理时间，制作成本大约是标准H&E玻片的六倍。

算法设计

免疫组织化学染色方法用于增强结节内不同组织类型之间的对比。所选择的染色方法使用免疫组织化学（pan-CK鸡尾酒染色法），然后使用改良的Masson三色染色法，产生最大的颜色对比度。自动染色设备用于应用已开发的染色方法，以尽量减少切片之间以及结节数据集之间的染色强度变化。虽然这些努力在最小化单个数据集各部分之间的染色差异方面取得了成功，但数据集之间的染色差别很大。事实证明，这对自动分割方法的开发是一个重大挑战，因为数据集中染色强度的变化大于基于颜色的特征集的分离。

开发的算法使用门诊化验室和高速列车颜色空间作为用于组织类型的分割的特征。这两种颜色系统都不同于RGB（RGB）色彩空间是为了更紧密地代表人类对色彩的感知而发展起来的。这个一和b条的轴门诊化验室系统分别标记从红色到绿色和从黄色到蓝色的变化，而第三个通道(L（左）)反射亮度。在高速列车颜色模型三个通道表示色调、饱和度和值（强度）。对于免疫组织化学染色样品的分类特征门诊化验室颜色空间的优点在于可以排除亮度并且通过正交轴来解释颜色。这个高速列车当需要单个值来表示图像中的色调时，模型更可取。图2显示了开发的免疫组织化学染色方法中颜色表示的示例RGB（RGB）,门诊化验室、和高速列车色空间。

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图2

一个小的组织学样本，用pan-CK免疫组织化学染色，用Masson’s Trichrome（Mod 2）复染，以及相应的红-绿-蓝表示(RGB（RGB）)，CIE L*a*b*(门诊化验室)和色调-饱和度-值(高速列车)颜色空间。

不同结节病例的染色差异较大，排除了用于分割完整的多结节免疫组织化学数据集的监督分类方法。A类k-means聚类方法被选为一种合适的无监督算法，能够适应结节数据集中染色的变化。^4,5,7这个k-意味着聚类算法试图将数据最优地划分为一组自然组，k.⁵通常，这是通过初始化来实现的k质心，c（c）。数据中的每个点都根据其与组形心的接近程度分配给组。一旦分配了所有点，则计算每个组的更新质心，并重复该过程，直到质心的位置没有变化，这表明数据被稳定地划分为k组。开发的分割方法的第一步是使用k-是指使用一和b条来自的频道门诊化验室色空间。欧几里德距离测量用于确定每个点的最近质心。为了避免在局部极小值处出现分区，聚类被重复了五次。在每次重复时，计算所有点到其质心的总距离，并选择总距离最小的分区结果。

组的数量，k，已由用户初始化，但仅限于3个或4个组。所有完整的组织病理切片至少包含三个组织类别以及背景数据(k= 4). 然而，并非所有用于验证的小样本图像都包含背景像素(k= 3). 数据集中的所有组织病理切片都包含癌性肿瘤、非活动性纤维化和活动性纤维化。基于设计的染色方法，这些组织类型的分色效果最好，因此与聚类算法的划分直接相关。但是，从k-均值聚类算法是随机分配的，没有参考特征集的属性。因此，创建了一个基于色调的标签步骤，以基于区域的平均色调分配标签。

每个区域的平均色调由k-计算means聚类算法，并将这些值按降序排序。平均色调最高的区域被分配一个像素值为1的“混合”类标签。“活性纤维化”和“非活性纤维化”类别标签被分配给以下排序的色调值，并分别通过像素值2和3进行识别。最后，如果k在4个区域中，根据平均色调排名最低的区域被分配给“背景”，像素标签为4。该过程总结于图3.

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图3

用于识别免疫组织化学染色肺癌结节组织学中组织类型的自动分割方法的总结图。

自动分割技术的首要任务是准确标记癌组织；然而，基于k-方法采用聚类方法，将血液和肿瘤像素点进行聚类。采用二次标记法进一步将混合类划分为癌性肿瘤和血液。创建的二值掩模图像仅包含带有“混合”组织类型标签的像素。这个二元掩模包含许多亚区域，其中大部分对应于癌肿瘤，少数对应于红细胞。连接的元件标签用于将新标签指定给每个单独的区域。对于每个新区域一通道（来自门诊化验室颜色空间）并计算面积。具有模式的区域一大于0.65的值和大于5像素的区域被指定为“红血球”，并在原始标签图像中给定5像素值。模式的阈值为0.65一通过定位模式的平均最小值，根据经验确定癌症肿瘤和血液分类的分离值一一些样本图像的直方图。

对最终标记的图像应用具有两个两个邻域的模式滤波，以便删除单个像素区域。需要对图像进行一定程度的平滑处理，因为许多单像素区域会干扰数据集的进一步分析。为了便于说明，生成的分段数据集中的每个标签都被指定了与手动分段结果相同的颜色，从而使类之间的区别更清晰可见。

出于验证目的，创建了一个测试集。在完整的多结节免疫组化数据集中随机选择了25个测试样本图像。两名外科病理学家（J.W.和A.B.）使用Intuos图形板和笔手动追踪测试样本中的组织类型。测试样本图像被限制为200 x 200像素，因此可以通过手动跟踪获得高水平的细节，每个样本图像大约需要15分钟。图4演示了测试集中的五个示例案例。此图显示了五个染色样本图像以及相应的三个分割图像，这些图像是通过观察者1的手动跟踪、观察者2的手动跟踪以及自动分割方法的结果实现的。测试集不仅允许在分割方法之间进行定性比较（如图4对于五个图像），而且还使用混淆矩阵进行定性评估。

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图4

用于验证目的的测试样本图像的一些示例。两名外科病理学家观察员手动追踪不同组织类型的区域。将这些结果与自动分类方法的输出进行了比较。

结果

开发的算法有效地克服了跨数据集调节不同染色强度的挑战，并能够使用开发的免疫组织化学染色方法成功分割癌肿瘤、非活动性纤维化、活动性纤维化和血液。该方法具有时间效率，在不到1分钟的时间内为完整的组织病理切片提供分割结果。图5示出了来自两个不同结节病例的两个样本切片的自动分割结果。

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图5

自动分类方法的示例应用于两个不同腺癌病例的大规模数据。结节的完整横截面被染色并数字化(左边)原始放大倍数为20倍，自动分类方法应用于整个视野，允许将完整结节横截面的分割显示为彩色编码地图(正确的). 案例1(顶部)癌区免疫组化染色强，而病例2(底部)癌区免疫组织化学染色弱得多。然而，基于聚类的自动分割技术能够适应这种染色变化，并在不到1分钟的时间内为两个数据集生成准确的分割。

生成混淆矩阵，用于评估和比较观测器性能以及基于验证测试集自动生成的分割。混淆矩阵通过两种方法对分类进行了比较，并清楚地说明了测试集中达到组织类别标签一致性的像素百分比（沿矩阵对角线的百分比）。也许更具洞察力的是分类之间的百分比差异的说明。这有助于突出显示难以区分的纸巾类别。生成了三个矩阵，比较了从观察者1到观察者2、观察者1和自动结果以及观察者2和自动结果的分类(表1).

通过对角线求和，可以很容易地从混淆矩阵中确定分类精度。两个观察者轨迹的比较显示，所有组织的像素分类之间的准确度为73%。观察者1的像素分类与自动结果之间的准确度为72%，观察者2与自动结果间的准确率为69%。

还计算了各组织分类的相对敏感性和特异性。灵敏度在数学上定义为真阳性数除以真阳性数加上假阴性数。因此，灵敏度计算为两种评估方法（两种方法标记为同一组织类别的像素数）之间的一致性除以一种或两种评估方式分配给该组织类别的总像素数。特异性在数学上定义为真阴性数除以真阴性数加假阳性数。与手动追踪相比，使用自动分割技术获得了类似的敏感性和特异性结果。每个组织类型类别的分割结果的平均灵敏度和特异性（带标准误差）如图所示图6和​和77.

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图6

每个组织类型类别相对于三种分割方法的灵敏度比较：观察者1的手动分割、观察者2的手动分割和开发的自动分割算法。

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图7

比较各组织类型类别相对于分割方法的特异性。

通过在测试集上重复运行算法六次并比较混淆矩阵，测试了自动分割方法的重复性。所有组织类别的标准误差为0±0像素，所有测试图像的标准误差均表明算法的重复性为100%。

讨论

我们提出了一种手动和自动方法，用于生成肺癌结节的详细体积组织病理切片。结节的分割旨在从视觉和定量上突出常见的各种组织学组织类型的相对比例和分布。

所述的特殊染色方法结合了免疫染色，靶向多加权CK，并对经典的Masson三色染色进行了修改。这种染色方法在用于分割的组织学组织类别之间产生了高度的颜色对比，包括癌性肿瘤（褐红色）、红血球（红色）、活动性纤维组织（主要被确定为弹性型基质）（粉红色）和由致密胶原纤维组成的非活动纤维组织（蓝色），非常适合计算机控制这些组织的分割。所示染色的一个弱点是整个肺结节病例的染色强度存在差异，这主要是由于多种抗体与不同加权CK的特异性肿瘤结合所致。通过为自动分割算法选择聚类方法，克服了染色方法的这一弱点。与标准H&E处理相比，使用这种染色技术制备载玻片需要更长的处理时间和更昂贵的试剂。然而，出于研究目的，自动分割这些数据的优点超过了幻灯片准备所增加的时间和费用。将基于该技术的策略纳入临床环境可能会对这些优点和缺点进行不同的评估。

数据自动分段的可能方法非常广泛，每种方法都有特定的优点和局限性。作为组织类型分割基础的聚类方法是有利的，因为尽管染色强度不同，但该技术仍能提供一致的结果。此外，分割并不依赖于训练数据。训练数据用于监督分割方法，并且需要一个分配了标签的广泛数据集。对于组织学数据的自动分析，生成一个准确描述各种结节病例和染色变化的标记训练数据集实际上是不可能的，标签的分配可能必须由人类观察员手动执行。因此，无监督聚类方法避免了对任何先验的了解组织类型，是一个很大的好处。

将自动方法的性能与两名外科病理学家观察员手动追踪组织区域的性能进行了比较。从两位病理学家生成的分割结果分析中可以看出(图4和表1)分割组织类型的任务是主观的。自动分割和两个观察者之间的准确度、敏感性和特异性水平相当。与手动跟踪相比，自动化方法的其他优点包括在减少的处理时间内执行一致和可重复的结果。数字化幻灯片的分割需要1到3个小时才能进行手动跟踪，而自动结果则不到1分钟。

除了优势外，所开发的方法也有局限性。该算法是为了分割肺部恶性结节而开发的，它依赖于结节内至少存在三种组织类型的假设。这个假设是建立在先验的了解肺癌结节的组织成分，并对迄今为止检查的病例进行了有效的治疗；然而，这是该算法的潜在局限性。特别是，如果出现良性结节病例，此算法将无法正常执行。

目前确定的获取人类肺癌结节的方法是通过肺叶切除术对活检诊断为癌结节的患者进行手术切除。因此，我们目前的方案不提供非癌结节的获取途径。计划在未来对该方案进行修改，以扩大结节病例的范围，将非癌性和癌性结节包括在内，为此，将在方案中增加第一次分类步骤，以确定结节是癌性还是非癌性。

所开发的自动分割算法方法的第二个限制是无法分割坏死和正常气道和血管壁组织。目前，人们的兴趣在于癌组织和纤维化组织，因此该算法适用于此目的。最近，肿瘤坏死部分与预后有关，因此我们将进一步开发自动分割方法，以提高坏死的区分能力。⁶无论是否对染色方案进行调整，都将对这种修改进行纹理分析。

所开发的分割方法有助于以一致、可靠和高效的方式量化肺癌结节的组织学内容，其准确性与专家人类观察员相似。这种方法将在未来研究中非常有用，以探索肺癌组织学组织类型组成的预后意义，并为定量检查组织类型之间的关系提供机会。

鸣谢

脚注

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