基因癌症。2010年8月；1(8): 822–835.
抑制Notch信号传导阻滞胶质母细胞瘤细胞株和肿瘤神经球的生长
,1,2,* ,1,2,三，4,5,* ,三 ,6 ,1,2 ,7 ,8和1,2,4 陈杰（音译）
1美国马萨诸塞州波士顿Dana-Farber癌症研究所肿瘤内科
2美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院
桑托什·凯萨里
1美国马萨诸塞州波士顿Dana-Farber癌症研究所肿瘤内科
2美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院
三美国马萨诸塞州波士顿Dana-Farber癌症研究所癌症生物学系
4美国马萨诸塞州波士顿布莱根妇女医院
5美国加州大学圣地亚哥莫尔斯癌症中心神经科学系
克里斯汀·鲁尼
三美国马萨诸塞州波士顿Dana-Farber癌症研究所癌症生物学系
彼得·斯特拉克
6美国马萨诸塞州波士顿默克研究实验室肿瘤系，探索性生物标记
陈继华
1美国马萨诸塞州波士顿Dana-Farber癌症研究所肿瘤内科
2美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院
黄轩申
7中华人民共和国广州中山大学中山眼科中心眼科重点实验室、眼遗传学实验室
吴丽芝（Lizi Wu）
8美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学Shands癌症中心分子遗传学和微生物学系
詹姆斯·格里芬
1美国马萨诸塞州波士顿Dana-Farber癌症研究所肿瘤内科
2美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院
4美国马萨诸塞州波士顿布莱根妇女医院
1美国马萨诸塞州波士顿Dana-Farber癌症研究所肿瘤内科
2美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院
三美国马萨诸塞州波士顿Dana-Farber癌症研究所癌症生物学系
4美国马萨诸塞州波士顿Brigham and Women's Hospital
5美国加州大学圣地亚哥莫尔斯癌症中心神经科学系
6美国马萨诸塞州波士顿默克研究实验室肿瘤系，探索性生物标记
7中华人民共和国广州中山大学中山眼科中心眼科重点实验室、眼遗传学实验室
8美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学Shands癌症中心分子遗传学和微生物学系
*这些作者为这项研究做出了同等贡献。
2010年5月12日收到；2010年8月2日修订；2010年8月12日接受。
- 补充资料
补充材料
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摘要
胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的恶性脑肿瘤，具有高增殖率和侵袭性。由于Notch信号的失调与许多人类癌症的发病机制有关，因此我们研究了Notch信号在GBM中的作用。我们发现在GBM细胞系和人类GBM衍生的神经球中存在Notch信号异常激活。通过表达Notch辅活化因子的显性负性形式mastermind-like 1（DN-MAML1）或治疗γ-分泌酶抑制剂（GSI）MRK-003抑制Notch信号传导，导致GBM细胞生长显著降低在体外和体内单个Notch受体的敲除表明，Notch1和Notch2受体对GBM细胞生长的贡献不同，其中Notch2起主要作用。此外，阻断Notch信号抑制人GBM衍生神经球的增殖在体外和体内我们的总体数据表明，Notch信号通路对GBM的最佳生长有显著贡献，有力地支持了Notch通路是GBM有希望的治疗靶点。
关键词：Notch信号、胶质母细胞瘤、肿瘤神经球、γ-分泌酶抑制剂、细胞生长
介绍
胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的恶性脑肿瘤，具有高增殖率和侵袭性。GBM患者的中位生存期为9至15个月，即使使用最积极的治疗，包括手术、放疗和化疗。1-5据报道，GBM发病机制中存在许多信号通路的失调。这些途径包括细胞周期控制（如P16INK4A（墨水）-CDK4-RB，第18页INK4C（墨水4C）和第19页农业研究基金-MDM2-p53通路）、生长因子受体（如血小板衍生生长因子受体和表皮生长因子受体）、转化生长因子β信号传导、磷脂酰肌醇3-激酶/磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN）信号传导。三,4调节干细胞发育的信号通路也可能在这种疾病的发病机制中发挥作用，因为癌症干细胞已经从GBM中分离出来。6-11对这些信号通路的进一步了解可能会导致新的治疗方法和策略，从而促进GBM的治疗。
Notch信号通路是一种进化上保守的通路，在多细胞和发育过程中起着重要作用。这些过程包括许多组织（包括大脑）中的细胞命运决定、分化、增殖、存活、血管生成、迁移和上皮-间充质转化。9,12-14哺乳动物中鉴定出4个Notch受体（Notch1-4）和5个配体（Jagged1、Jagged2和Delta-like 1、3和4）。12,13Notch受体是保守的I型跨膜受体。Notch受体与邻近细胞上配体之间的结合导致受体的多步蛋白水解裂解，并释放Notch胞内结构域（NICD），该结构域转移到细胞核。在细胞核中，NICD与转录因子CSL结合(C哺乳动物中的启动子结合蛋白-1，S公司无毛抑制剂果蝇属,L（左）ag-1英寸秀丽隐杆线虫)和辅激活因子类主控蛋白（MAML1-3），启动Notch靶基因的转录激活。13-16Notch信号异常与许多肿瘤有关，包括血液肿瘤，如T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）、霍奇金淋巴瘤、一些急性髓细胞白血病、多发性骨髓瘤和实体瘤，如胶质瘤、宫颈癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌和肝细胞癌。13,15,17-19
激活的Notch信号可能是致癌的，也可能是抑制肿瘤的，这取决于细胞和生理环境。13,15,20在正常大脑发育中，已知Notch通路对神经干细胞更新、祖细胞分化、学习、记忆和胶质生成有影响。21-24在脑癌的发展过程中，Notch1曾被报道为致癌物质。25据报道，Notch1及其配体Delta-like 1和Jagged1对GBM细胞生长至关重要。26Notch1和Notch2对髓母细胞瘤的生长有相反的影响。27Notch2缺失是人类胶质脑肿瘤亚组生存率的预测因子。28最近，tenascin-C，一种在迁移中起作用的细胞外基质蛋白，被确定为胶质瘤中的Notch靶基因。29尽管越来越多的证据表明Notch信号在GBM的发病机制中发挥作用，但Notch激活的潜在机制以及特异性Notch受体在GBM生长调节中的重要性仍不明确。
最近，在GBM中发现了肿瘤干细胞。6-8,10,11,30Notch信号也与神经干细胞更新、增殖和分化有关。21,22进一步研究Notch信号在GBM肿瘤干细胞发育中的作用将为该病的发病机制提供新的见解。靶向这些癌症干细胞可能会防止GBM的可预测复发。7
在本研究中，我们确定了Notch信号在已建立的GBM细胞系和人类GBM衍生神经球中的作用。我们在GBM中观察到Notch信号增强，这表现在我们对基因表达序列分析（SAGE）数据库数据的分析中，配体、受体和靶基因的表达水平增强。然后，我们通过Western或定量RT-PCR分析验证了Notch信号成分在GBM细胞和肿瘤神经球中的表达水平。我们还研究了Notch信号和单个Notch受体在GBM细胞系和肿瘤神经球生长中的重要性在体外和体内我们的总体发现揭示了Notch信号激活在GBM发病机制中的关键作用。
结果
GBM细胞系表达高水平的Notch信号成分
Notch信号传导被证明参与了许多肿瘤类型的发病机制。15,17因此，我们使用了一种无偏见的方法，即SAGE分析，来确定不同肿瘤类型与正常同源组织相比Notch通路成分的相对表达水平，并确定Notch成分的表达是否与致瘤性相关。31在分析了17例肿瘤中Notch配体、受体和靶基因的表达后，我们发现DLL1、DLL3、槽口1、槽口2、HES1、HES5、HEY1、DTX2，以及NRARP公司与正常脑样本相比，在脑肿瘤中（补充图S1A和补充表S2）。由于脑肿瘤样本包含6个不同的亚型（28个髓母细胞瘤、20个星形细胞瘤、19个胶质母细胞瘤，12个室管膜母细胞瘤和5个脑膜瘤、2个少突胶质细胞瘤和8个正常脑样本），我们分析了与正常脑相比，每个亚型中Notch信号成分的表达水平（补充图S1B和补充表S3）。我们发现6种亚型中有5种亚型的Notch信号基因表达显著升高，星形细胞瘤的Notch信号基因表达升高DLL3、槽口1、槽口2、HEY1，以及HEY2公司; 室管膜母细胞瘤中槽口2，HES1，以及HEY1型; GBM已提升槽口2和HES1型表达；少突胶质瘤增多HES1、HEY1，以及数据传输X1表达；脑膜瘤隆起HES1型表达式。由于GBM是脑肿瘤中最恶性的，并且通过SAGE分析，其Notch信号相关基因表达水平显著增加，因此我们使用5个GBM细胞系LN827、deltaU87、U87、U251和LN428进一步测试和确认Notch通路成分的表达水平。所有这5种细胞系均表达Notch1、Notch2和Notch3 RNA和蛋白(和). 与相比槽口1和槽口3转录本，RNA水平槽口2分别高出10倍和20倍，而槽口4在这些细胞系中检测不到转录物(). 所有5个细胞株都表达JAGGED-1和JAGGED2蛋白，其中U251和LN428的表达量最高(). 在这些细胞中检测不到DELTA-LIKE-1、DELTA-LIKE-3和DELTA-LIKE-4（数据未显示）。所有5个细胞系均表达Notch靶基因HES1、HEY1，以及C-MYC公司蛋白质(). LN428在蛋白质水平上似乎比RNA水平上具有更高的NOTCH1表达，这可能是由于之前报道的Ras和Akt途径对NOTCH1的翻译调节。32这些数据表明，在GBM中Notch信号被激活，可能在该肿瘤的发病机制中发挥作用。最近，据报道，Notch和Sonic Hedgehog信号在GBM的经典亚型中高度表达，33进一步强调了Notch信号在GBM中的临床相关性。
GBM细胞中Notch信号成分的表达。(A类)GBM细胞Notch受体表达的qPCR分析。结果由2或3个独立的GBM细胞传代产生，每个条代表一个RNA样品的独立制备。(B类)GBM细胞系Notch信号成分蛋白质水平的Western blot分析。星号（*）表示非特定带。
主脑样1显性阴性形式对Notch信号传导的抑制显著降低了GBM细胞的生长在体外和体内
由于我们发现Notch信号在GBM中高度表达，我们接下来确定它对GBM细胞生长是否重要。我们通过用慢病毒转导细胞来阻断5 GBM细胞中的Notch信号传导，慢病毒表达Notch辅激活物mastermind-like 1（DN-MAML1）的显性阴性形式（补充图S2）34并监测细胞生长。DN-MAML1的表达强烈抑制了Notch信号传导，因为Notch靶基因减少了60%-90%C-MYC公司在所有5种细胞系中表达，减少56%至67%HEY1型在LN827、deltaU87和U87细胞中表达，并且HES1型与GFP对照病毒转导细胞相比，DN-MAML1病毒转导的deltaU87、U87、U251和LN428细胞中的表达(). 重要的是，与对照病毒转导的细胞相比，转导后第5天或第6天，DN-MAML1表达的细胞在LN827、deltaU87、U87、U251和LN428细胞中的生长分别减少84%、72%、58%、59%和30%(). GBM细胞生长的时间过程表明，在转导后第8天或第9天，DN-MAML1抑制生长2到29倍（补充图S3）。这些结果表明，抑制Notch信号显著降低GBM细胞的生长在体外.评估功能重要性体内用DN-MAML1或GFP对照病毒转导Notch反应最强的细胞系LN827细胞，然后将感染细胞注入SCID小鼠脑内。与GFP控制病毒转导细胞相比，注射DN-MAML1转导的LN827细胞的小鼠存活时间显著延长(P（P）= 0.0006) (). 在牺牲时从小鼠身上切除肿瘤，并提取RNA。与GFP对照组相比，DN-MAML1感染细胞产生的肿瘤显著减少C-MYC、HES1基因，以及HES5型表达式(). 综上所述，这些数据表明DN-MAML1对Notch信号的抑制显著降低了GBM细胞的生长在体外和体内.
一种主要的负性形式的mastermind-like 1（DN-MAML1）抑制GBM细胞中的Notch信号传导并阻止GBM细胞生长在体外和体内. (A类)qPCR分析表明，DN-MAML1转导抑制了Notch靶基因的表达，C-MYC、HEY1，以及HES1型在GBM细胞中，与GFP相比。在转导后48小时收集总RNA，并进行三次实验(n个= 3). 这个P（P）DN-MAML1转导的细胞和对照之间的值如下所示：*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001. (B类)DN-MAML1抑制GBM细胞生长在体外细胞被DN-MAML1或GFP对照病毒感染两次，转导后第5天用台盼蓝排除法计数感染细胞数。GFP转导细胞的细胞生长被设置为100%*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）与GFP控制病毒感染的GBM细胞相比<0.001(n个≥ 3). (C) (一)DN-MAML1抑制GBM细胞生长体内.携带经DN-MAML1或GFP对照病毒转导的颅内LN827 GBM细胞的小鼠的Kaplan-Meier生存曲线(P（P）= 0.0006). (b条)qPCR分析显示DN-MAML1抑制Notch靶基因的表达水平，C-MYC、HES1，以及HES5型与GFP对照组相比，LN827 GBM异种移植物。在牺牲时间切除脑肿瘤并用液氮快速冷冻。提取由DN-MAML1或GFP控制病毒处理的LN827细胞形成的脑肿瘤总RNA，并进行qPCR分析**P（P）<0.01和***P（P）< 0.001 (n个= 2).
主导阴性形式的mastermind-like 1的表达导致GBM细胞株G0/G1细胞周期阻滞并诱导凋亡
由于DN-MAML1的表达导致GBM细胞的生长抑制，我们通过分析细胞周期和细胞凋亡率进一步确定了细胞生长抑制的分子机制。我们观察到慢病毒介导的DN-MAML1在LN827和deltaU87细胞中的表达导致G0/G1期细胞数量的增加，而对照组GFP的表达（LN827,65.88%v.47.01%）和deltaU87,85.46%v.60.13%）则不同(). 与GFP对照细胞相比，LN827、deltaU87和U87细胞中48小时的DN-MAML1表达导致凋亡细胞数量显著增加(). 作为循环蛋白D1是已知的Notch靶基因35在G1期细胞周期进展中起重要作用，36,37我们通过qPCR和Western分析测定了CYCLIN D1的表达水平。我们发现DN-MAML1表达减少循环蛋白D1表达式(和补充图S4C（a）），这可能导致G0/G1期细胞数量增加。因此，我们的数据表明，显性阴性Notch抑制剂DN-MAML1引起细胞生长抑制，部分原因是下调CYCLIN D1的表达，诱导细胞周期停滞和凋亡。
DN-MAML1表达导致G1期阻滞，下调循环蛋白D1表达，并诱导GBM细胞凋亡。(A类)用DN-MAML1慢病毒或GFP对照病毒转染后第4天GBM细胞的细胞周期分布。细胞周期通过丙碘染色和FACS分析测定(n个≥ 3). (B类)DN-MAML1诱导GBM细胞凋亡。LN827、deltaU87和U87细胞被携带DN-MAML1或GFP的慢病毒感染两次。转导后48小时，采用PI和Annexin-V染色进行细胞凋亡检测，并进行流式细胞术分析*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）从DN-MAML1表达细胞到GFP表达细胞的凋亡细胞百分比比较，<0.001(n个= 3). (C)qPCR分析显示DN-MAML1被抑制循环蛋白D1在LN827、deltaU87和LN428细胞中表达。用DN-MAML1慢病毒或GFP控制病毒转导48小时后，从细胞中收集总RNA。循环蛋白D1GFP转导细胞的表达设置为100%*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）与GFP对照病毒感染的细胞相比，<0.001(n个= 3).
γ-分泌酶抑制剂MRK-003抑制GBM细胞的Notch信号传导，降低细胞生长并诱导凋亡
Notch信号的激活涉及配体结合时蛋白水解裂解的关键步骤。γ-分泌酶蛋白复合物对Notch受体的裂解释放Notch胞内结构域，然后转移到细胞核并激活Notch靶基因。我们使用γ-分泌酶抑制剂（GSI）MRK-003来测试在受体处理步骤抑制Notch信号是否也会抑制GBM细胞生长。GSI有效抑制Notch信号传导，如下调C-MYC公司和HES1型剂量依赖性表达(). 与C-MYC公司RNA水平，我们还观察到10µM和20µM GSI处理24小时后C-MYC蛋白水平下降（补充图S4A）。由于其他信号通路（包括PI3-激酶途径的磷酸化-AKT或MAP-激酶途径的磷化-pp44/42）的磷酸化状态未受影响，GSI效应对Notch信号抑制具有特异性（补充图S4B）。GSI治疗也减少循环蛋白D1RNA水平和蛋白质水平可能导致G0/G1细胞周期阻滞(和补充图S4C（b））。此外，GSI以剂量依赖的方式抑制所有5个GBM细胞系的生长(). IC50这些细胞的细胞生长在7至16µM之间。LN827、deltaU87和LN428是最敏感的细胞系，因为它们的生长在10µM时被抑制50%至80%，在20µM下被抑制100%，这与细胞周期蛋白D1表达式(). 由于Notch抑制剂对细胞生长的影响深远，我们进一步测试了MRK-003对GBM细胞存活的影响。与DMSO对照组相比，MRK-003治疗后24小时和48小时，GBM细胞发生了显著的凋亡(). 这些结果表明，GSI处理对Notch信号的抑制通过诱导细胞周期阻滞和凋亡导致GBM细胞生长抑制，有力地支持了Notch通路在GBM细胞增长中的重要作用。
GSI MRK-003治疗下调Notch靶基因表达，抑制GBM细胞生长，并诱导凋亡。(A类)qPCR分析表明GSI MRK-003抑制C-MYC公司和HES1型表达式。在指示处理48小时后收集U87和deltaU87的总RNA。对照（DMSO）处理细胞的RNA表达设置为100%(n个= 3). (B类)qPCR分析显示GSI MRK-003抑制循环蛋白D1表达式。在指示治疗48小时后，从LN827、detaU87和LN428中收集总RNA。对照（DMSO）处理细胞的RNA表达设置为100%(n个= 3). (C)GSI对GBM细胞株生长有不同的抑制作用。在治疗的第5天进行MTS分析(n个= 3). (D类)MRK-003诱导GBM细胞凋亡。20µM MRK-003处理后24小时和48小时，通过PI和Annexin-V染色进行细胞凋亡测定，并通过流式细胞术进行分析*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001比较了MRK-003处理细胞和DMSO处理细胞的凋亡细胞百分比(n个= 3).
Notch1和Notch2对GBM细胞系生长有不同的影响
这些GBM细胞表达Notch受体1、2和3，其中NOTCH2最丰富。槽口2mRNA比槽口1并且比槽口3在这里研究的细胞中(). 为了进一步研究每个受体在GBM细胞生长中的重要性，我们使用shRNAs敲除Notch1、Notch2和Notch3（未显示）。每个Notch受体的敲除是特定的（即，每个Notch接收器的蛋白质水平不会因其他两个受体的敲减而改变）(). 类似下调槽口1或槽口2在deltaU87和U251细胞中显著减少HEY1型与加扰控制相比的表达式(). 我们观察到槽口1与对照细胞相比，敲除导致细胞生长减少（LN428和U251的生长分别减少60%-80%）(). 与干扰对照感染细胞相比，使用2个shRNAs敲除Notch2显著抑制所有5个细胞系的生长50%-70%(). Notch3敲除只对U251和LN428细胞生长有轻微影响，但对其他3个细胞系没有影响（数据未显示）。因此，这些数据表明，Notch1和Notch2都参与调节GBM细胞的生长，而Notch2对这些细胞的影响更大。
Notch1和Notch2敲除对GBM细胞生长有不同的抑制作用。(A类)Western blot分析显示Notch1和Notch2蛋白水平下调。在转导后第5天制备LN827细胞裂解物并进行Western blot分析。用Notch1、Notch2、Notch3和β-actin抗体剥离并探测同一膜，以显示敲除和负荷控制的特异性。星号（*）表示非特定带。三个独立实验的代表。(B类)qPCR分析显示Notch1或Notch2的敲除受到抑制HEY1型与扰码控制相比，在deltaU87和U251细胞中的表达。在用携带靶向Notch1、Notch2或扰乱对照的shRNA的慢病毒转导48小时后，从细胞中收集总RNA。HEY1型扰乱控制-转导细胞的表达被设置为100%*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）与对照组相比<0.001(n个= 3). (C)敲除Notch1或Notch2可不同程度地抑制GBM细胞生长。用靶向shRNAs的病毒转导细胞两次(一)槽口1（#a和#b）或(b条)Notch2（#a和#b）或加扰对照shRNA，在转导后第5天通过台盼蓝排除计数。扰乱控制病毒感染细胞的细胞生长设置为100%*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）与加扰控制病毒处理的细胞相比<0.001(n个≥ 3).
抑制Notch信号降低人类GBM神经圈的生长在体外
由于DN-MAML1或GSI对Notch信号的抑制阻止了GBM细胞的生长在体外和体内，我们进一步测试Notch信号抑制是否会影响人类GBM神经球的生长。这些神经球来源于原发性GBM肿瘤，并在干细胞培养基中培养。与血清培养细胞系相比，这些神经球具有更真实的肿瘤特征，因此为研究GBM的生物学提供了有用的工具。30一些神经干细胞标记物，例如CD133，内斯廷，以及ALDH1A型，在这些神经球中差异表达，表明这些球的神经干细胞特征（补充图S5）。此外，所有3种神经圈细胞株均在相对较高水平上表达Notch配体、受体和靶基因，表明它们具有完整的Notch信号和活性（补充图S6）。DN-MAML1在神经球细胞系BT70、BT74和BT37中的表达导致C-MYC、HES1，以及HEY1型与GFP对照组相比，这些神经球对Notch抑制反应良好（补充图S7）。与GFP控制病毒感染的神经球相比，DN-MAML1分别抑制BT70、BT74和BT37株系的球体形成29%、39%和30%(). 这一观察结果与Fan的研究一致等世界卫生组织报道，Notch通路阻断会耗尽CD133阳性GBM细胞和神经球生长。38我们还使用GSI进一步证实了这种生长抑制作用。选择BT37神经圈是因为它在DN-MAML1表达后具有最多的Notch靶基因下调（补充图S7）。GSI以剂量依赖的方式抑制BT37神经球的形成。与DMSO对照组相比，10µM MRK-003治疗组在5天内抑制了30%的神经球形成(和).
抑制Notch信号阻止人类GBM衍生的神经球生长在体外和体内. (A类)DN-MAML1抑制人类GBM-衍生神经圈（BT70、BT74和BT37）的形成在体外神经球由DN-MAML1或GFP病毒转导，转导后第10天计算球数*P（P）与GFP对照病毒-转导的神经球相比<0.05(n个= 3). (B类)GSI MRK-003抑制BT37 GBM神经球的形成。(一)GSI以剂量依赖的方式抑制BT37-GBM神经球的形成。在治疗第5天计算神经球数量。二甲基亚砜对照处理的BT37球数设置为1.0（代表三次试验，n个≥ 3). (b条)GSI治疗的代表性图片以剂量依赖的方式抑制BT37神经球的形成。(C)GSI预处理抑制BT37 GBM神经球生长体内.携带用10µM MRK-003或DMSO对照预处理24小时的颅内BT37GBM神经球的小鼠的Kaplan-Meier生存曲线(P（P）= 0.0348).
抑制Notch信号阻止GBM神经圈生长体内
要确定在体外Notch信号的抑制具有功能相关性体内将等量的BT37神经球细胞经10µM GSI或DMSO载体对照预处理24小时后，经脑内注射至SCID小鼠。我们发现，注射经GSI预处理的BT37细胞的小鼠生存期显著延长(P（P）=0.0348）与对照组相比(). 这些数据表明，抑制Notch信号阻止GBM神经圈生长体内().
讨论
Notch信号通路与许多癌症的发病机制有关。15在这里，我们研究了Notch信号和不同Notch受体在GBM中的重要性，GBM是最恶性的脑癌类型。在使用基于网络的SAGE分析确定Notch信号升高后，我们确认了GBM细胞中Notch受体1、2和3、Notch配体Jagged1和Jagged2的表达，表明可能存在Notch激活的并列或自分泌模型。此外，Notch信号成分在人类GBM衍生的神经球中表达。这些发现与之前的其他报告一致，25-28显示Notch信号成分在不同的脑肿瘤中表达，并在其发病机制中发挥重要作用。最近，Verhaak等据报道，Notch信号在GBM的经典亚型中高度表达。39我们进一步表明，DN-MAML1和GSI抑制Notch信号传导，并差异性抑制GBM细胞生长。生长抑制的差异可能是由于这些GBM细胞系的不同细胞背景和异质遗传背景所致。例如，U251和LN827表达p53突变体，而U87和deltaU87细胞包含野生型p53。40LN428单元包含野生型PTEN，而其他4个单元线为PTEN空（数据未显示）。40PTEN突变使T-ALL细胞对GSI处理的Notch抑制产生抗性，41,42PI3-激酶/Akt信号异常有助于细胞生长和存活。PTEN突变是否有助于GBM细胞对GSI的抵抗，尚需进一步研究。
Notch信号在癌症中的参与具有高度的上下文依赖性。在胚胎性脑肿瘤中，Notch1抑制肿瘤生长，而Notch2促进肿瘤生长。27据报道，在GBM中，Notch1及其配体Delta-like-1和Jagged1对肿瘤细胞的生存和生长至关重要。26此外，Notch2的缺失正预示着人类胶质脑肿瘤的存活。28我们的结果表明，Notch2是主要的Notch受体，对所有5个GBM细胞系的生长均有贡献，而Notch1对U251和LN428细胞有贡献。这可能是因为槽口2是10倍于槽口1在这些GBM细胞中，它们具有更活跃的Notch2，因此更依赖于Notch2进行生长。U251和LN428细胞具有相对高的Notch1和配体Jagged1和Jagged2的蛋白质水平。因此，这2个细胞系可能具有比其他3个细胞系更活跃的Notch1，这使得它们也依赖Notch1生长。我们的结果表明，Notch2和Notch1对GBM细胞的最佳生长非常重要，因此代表了潜在的治疗靶点。确定促进其致癌功能的Notch2和Notch1的其他下游靶基因将很有意思。C-MYC是一个有趣的下游候选基因，因为它是Notch信号的直接靶点，在许多肿瘤中具有致癌作用。43,44
由于GBM是最恶性的脑肿瘤之一，迄今为止最有效的治疗方法是手术，其次是放疗，同时辅以替莫唑胺（TMZ）治疗。所有GBM患者都会在几年内复发。GBM的耐药性可能是由于GBM干细胞对这种标准治疗具有耐药性。45,46我们证明DN-MAML1和GSI对Notch信号的抑制阻止了GBM-衍生的神经球生长在体外和体内我们还发现GSI使GBM细胞系和神经球对TMZ治疗和辐射敏感（我们的未发表数据），这是Wang报道的等.47因此，通过Notch抑制结合化疗和放疗靶向GBM可能会导致更持久的临床结果。进一步描述在GBM和癌症干细胞的更新和增殖中发挥作用的Notch信号的下游分子靶点将非常有意义。鉴于最近一份关于GSI（MK-0752）在晚期癌症中的一期临床试验的报告，本文提出的结果可能具有临床相关性，该试验显示GSI对恶性胶质瘤有部分反应。51
此外，MAML1的显性阴性形式对GBM细胞株和肿瘤神经圈的生长有显著影响。由于现在有一种可直接抑制Notch信号传导的细胞渗透稳定肽，33进一步测试这种肽抑制剂对GBM细胞株和肿瘤神经圈生长的影响将非常有意义，因为它是一种潜在的治疗工具，具有较少的非靶向毒性。
总之，我们证明了Notch信号是GBM细胞生长的主要贡献者。Notch2和Notch1是调节这种生长需求的重要Notch受体，其中Notch2起着更重要的作用。此外，DN-MAML1或GSI对Notch信号的抑制阻止了人类GBM衍生的神经球生长。我们的数据表明，抑制Notch通路是一种很有希望的治疗GBM的方法。
材料和方法
基因表达系列分析（SAGE）分析
基于Web的工具SAGE Anatomic Viewer(http://cgap.nci.nih.gov/SAGE/解剖查看器)用于获得16个Notch信号基因的相对表达，包括5个Notch配体、4个Notch受体和7个已知的Notch靶基因在17个肿瘤及其同源正常组织中的相对表达。每种肿瘤类型及其相应的正常组织由SAGE文库中的样本（1-94）组成。这些样本要么是患者肿瘤，要么是已建立的人类细胞系。输入每个Notch信号基因的GeneBank登录号，并使用排名最高的短标签来爆炸SAGE自动查看器（补充表S1）。获得了每200000个标签的平均值，其表示每个肿瘤及其同源正常组织中基因的表达。通过将每200000个肿瘤的标签平均数除以正常值，得出该基因的表达倍数变化（补充表S2）。由于脑肿瘤队列有94个样本（28个髓母细胞瘤、20个星形细胞瘤、19个胶质母细胞瘤，12个室管膜母细胞瘤和5个脑膜瘤、2个少突胶质细胞瘤和8个正常脑样本），我们将每种脑肿瘤亚型中每200000个Notch信号基因的标签与正常脑组织进行比较，以描述Notch的表达（补充表S3）。将折叠变化转换为LOG（2）值。如果一个组织中每200000个基因的标签为0（无表达），则在转换为LOG（2）值时，使用1替换0。使用DNA-Chip Analyzer软件对数值进行分级聚类（平均连锁分析）(网址：www.dchip.org).
质粒和小发夹RNA
标记为1-302aa MAML1的FLAG34克隆到慢病毒载体pCSCGW2-IRES-GFP的NheI位点。靶向Notch1（#a克隆ID TRCN0000003359，#b TRCN000003362）和Notch2（#a clone ID TRCN00004895，#b TRACN0000004896）的小发夹RNA（shRNA）慢病毒构建物从Dana-Farber RNAi筛查设施（马萨诸塞州波士顿Dana-Fabber癌症研究所）获得。pKLO.1–加扰对照载体从Addgene（马萨诸塞州剑桥市）获得。pMD2-VSV-G和pCMV_dr8_91是威廉·哈恩博士（达纳-法伯癌症研究所）赠送的礼物。
TRCN0000003359发夹序列：
CCGGCTTGTTTTCAGGTTCGATATCGAATACTGAACCTGAAAAAGTTTTTT
TRCN0000003362发夹序列：
CCGGCAAAGACATGACCAGTCTACTACTCGAGTGAGCCACTGCATGTCTTTTT
TRCN0000004895发夹序列：
加拿大政府
TRCN0000004896发夹序列：
CCGGCAGGATATGGATGTACTCTCGAGTACCATCATCATCATCATCCTGGTTTT
抗体
Notch1（sc-6014R，一级抗体稀释1:200，Santa Cruz Biotechnology Inc.，加利福尼亚州圣克鲁斯），Notch2（#2420，一级血清稀释1:200；Cell Signaling Technology，丹弗斯，马萨诸塞州），Notch 3（sc-5593，一级抗抗体稀释1:2000，圣克鲁斯生物技术），Jagged2（#2205，一级抗原稀释1:200、细胞信号技术），Jagged1（sc-8303，一次抗体稀释1:200，Santa Cruz Biotechnology），c-Myc（sc-40，一次抗原稀释1:1000，Santa Cruz Bietechnologies），Hes1（ARP32372_T100，一次试剂稀释1:200），Avia Systems Biology，加利福尼亚州圣地亚哥），Hey1（ab22614，一次标本稀释1:400，马萨诸塞州剑桥Abcam），cyclinD1（sc-450，一级抗体稀释1:200，Santa Cruz Biotechnology），磷酸化p44/42 MAPK（T202/Y204）（#4376，细胞信号技术），磷酸-AKT（S473）（#9271，细胞信号科技），抗FLAG M2单克隆抗体（一级抗体1:1000，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO），使用GFP（sc-8334，一级抗体稀释度1:1000，Santa Cruz Biotechnology）和β-肌动蛋白（一级抗体浓度1:5000，Sigma-Aldrich）。
蛋白质印迹分析
在6%至12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳分离50微克蛋白质，并将其电转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore，Bedford，MA）上，并按照制造商的建议使用指示的抗体进行检测。通过化学发光检测抗体结合（马萨诸塞州沃尔瑟姆的佩金-埃默）。用β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich）对负荷进行标准化。
细胞系培养
胶质母细胞瘤细胞系LN827、U87、deltaU87（EGFR vIII过度表达U87）、U251和LN428在杜尔贝科改良的Eagle's培养基（DMEM）（Mediatech，Manassas，VA）中培养，补充10%热灭活胎牛血清（Lonza，Basel，Switzerland）、1%青霉素-链霉素（Mediaech）和2%谷氨酰胺（Mediatech）。293FT细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM中培养。所有细胞系在37°C，5%CO下培养2.
神经层培养
人类GBM干细胞系BT37来源于一名患者，该患者根据批准的方案在Brigham and Women's Hospital接受手术。BT70和BT74系是从C.David James（加利福尼亚大学旧金山分校）的GBM异种移植物中获得的。这些异种移植物来源于胶质母细胞瘤活检，并植入免疫低下小鼠和传代小鼠。将切除的异种移植物在人工脑脊液（CSF）中清洗并手动分离成单个细胞。使用淋巴蛋白酶-M（北卡罗来纳州伯灵顿市雪松）去除红细胞。将细胞在DMEM/F12（含L-谷氨酰胺，Invitrogen，Carlsbad，CA）培养基中培养，该培养基含有葡萄糖（0.3%）、青霉素/链霉素（50µg/mL）、载脂转铁蛋白（0.1 mg/mL）、孕酮（20 nM）、亚硒酸钠（30 nM）、腐胺（60µM）、胰岛素（25µM/mL）、碳酸氢钠（3 mM）、HEPES（10 mM）、20 ng/mL EGF、10 ng/mL LIF，和20 ng/mL FGF。使用血细胞仪和台盼蓝排除法对活细胞进行计数。30,48
次级神经球分析
神经球被机械分解成单个细胞，并使用台盼蓝排除法计数活细胞。每个治疗条件下使用大约20000到100000个活细胞（一式三份），并允许细胞在5天内形成球体，然后通过显微镜计数神经球的数量().
复合处理
对于抑制剂治疗，细胞在其正常培养基中生长，并用10µM或20µM的GSI MRK-003（默克研究实验室，马萨诸塞州波士顿）或DMSO（Sigma-Aldrich）处理24或48小时，如文中所示。
慢病毒转导
为了产生慢病毒，293FT细胞在3×106在100毫米的盘子里。使用Fugene 6试剂（瑞士巴塞尔罗氏公司）以1:1:1的比例将DN-MAML1、PCSCGW2-IRES-GFP慢病毒载体、靶向Notch1、Notch2或PKLO.1–加扰对照质粒的慢病毒载体、包装质粒pCMV_dr8_91和假型包膜pMD2-VSV-G转染到细胞中。在转染后48和72小时收集病毒。用0.8 mL病毒和0.2 mL新鲜完整培养基（含8µg/mL Polybrene（Sigma-Aldrich））感染靶细胞两次，持续6小时，并用新鲜培养基替换。49对于神经球感染，使用SW-28转子通过超速离心浓缩110 mL病毒，并在4°C下以19500 rpm旋转3小时。将颗粒重新悬浮在360µL无血清DMEM中过夜。使用50微升病毒感染10万个活细胞。
定量实时逆转录PCR（qPCR）
通过Trizol方法（Invitrogen）分离总RNA，并从800ng总RNA中产生cDNA（Taqman逆转录试剂盒，Applied Biosystems，Foster City，CA）。使用ABI PRISM 7500序列检测器（Applied Biosystems）对cDNA样本进行qPCR，并使用SYBR绿色法（AppliedBiosystes）对PCR产物进行测量。所有样品均扩增三倍。通过使用GAPDH公司mRNA表达水平。基因的相对RNA表达也与GAPDH公司数量。50引物序列见补充表S4。
细胞生长、MTS分析、细胞周期分析和凋亡分析
用于细胞生长分析，2×105/将2mL GBM细胞置于6孔板中，用慢病毒加新鲜培养基感染2次，持续6小时。感染后第5天，对细胞进行胰蛋白酶化，并将其重新悬浮在500µL培养基中，使用血细胞仪通过台盼蓝排除法对25µL细胞进行计数。将其余的细胞稀释至4 mL，将2 mL细胞（1:2稀释度）放回6孔板，并在第8天或第9天进行计数。
对于MTS增殖试验（Promega，Madison，WI），细胞在1到2×10三/96-well板中为50µL。3小时后添加50微升用MRK-003或DMSO稀释的生长培养基，以达到文中所示的最终浓度。使用Elisa微孔板阅读器（Spectra Max190，Molecular Devices，Sunnyvale，CA）在第5天OD 490时测量MTS活性。
用于细胞周期分析，2×105/将2mL GBM细胞置于6孔板中，用慢病毒加新鲜培养基感染2次，持续6小时。在感染后第4天，对细胞进行胰蛋白酶处理，用冰镇1x PBS（Mediatech）清洗一次，用40%乙醇固定30分钟，用500µL 500µg/mL RNAse A（Sigma-Aldrich）在37°C下处理30分钟，并用0.0046 mg/mL碘化丙啶（Sigma-Aldrich）在室温下黑暗中染色30分钟。通过流式细胞术分析（BD FACScans，BD Biosciences，San Jose，CA）测量DNA量。细胞周期分布由ModFit软件（Verity software House，Topsham，ME）确定。每次实验至少收集了10000个事件。
用于凋亡检测，1×105/将2 mL GBM细胞置于6孔板中。第二天添加两毫升用20µM MRK-003或DMSO稀释的生长培养基，或感染DN-MAML1或GFP慢病毒两次，持续6小时。使用Annexin-V-FLUOS染色试剂盒（印第安纳波利斯罗氏诊断公司）在治疗24或48小时后测量细胞存活率。简单地说，用1x PBS对细胞进行胰蛋白酶化并清洗一次。将细胞颗粒与2µL碘化丙啶（PI）和2µL-Annexin-V一起重新悬浮在100µL缓冲液3中，在黑暗中培养15分钟，并进行流式细胞术分析（BD-FACScans）。
体内小鼠异种移植模型
对于LN827，细胞被DN-MAML1或GFP控制病毒感染两次。转导后第3天，1×106使用立体定向装置将细胞颅内注射到SCID（来自Taconic，Hudson，NY的NOD/SCID小鼠）小鼠中。48对于BT37研究，SCID小鼠侧翼生长的肿瘤被解剖、分离、电镀并立即治疗在体外使用DMSO或MRK-003 24小时。然后手动分离细胞并计数。细胞以2×10的浓度重新悬浮在PBS中4活细胞/5µL，并如前所述植入右侧纹状体。48当小鼠患病时，将其处死，并记录日期以进行生存分析。切除DN-MAML1或对照小鼠的脑肿瘤，在液氮中快速冷冻，并在-80°C下储存。
统计分析
数值显示为平均值±标准偏差。使用学生进行比较t吨测试（GraphPad软件公司，加利福尼亚州圣地亚哥）。重要P（P）值显示为P（P）< 0.05 (*),P（P）<0.01（**），以及P（P）< 0.001 (***). 为了进行生存分析，使用Prism 4软件（GraphPad software Inc.）进行了对数库测试。
致谢
作者感谢默克研究实验室提供的MRK-003和Martin Sattler博士的科学建议。这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，此物品必须标记为广告根据《美国法典》第18卷第1734节，仅为了表明这一事实。
脚注
这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）RO1 CA66996向J.D.G.、NIH K08CA124804和ABC2向S.K.提供的部分资助。
S.K.是GSI MK-0752一期临床试验的共同研究者。P.R.S.是默克研究实验室的全职员工。J.D.G.由诺华顾问/咨询委员会提供资金。不存在进一步的潜在利益冲突。
本文的补充材料可在基因与癌症网站位于http://ganc.sagepub.com/supplemental.
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