美国国家科学院院刊。2010年11月16日；107(46): 20009–20014.
自分泌TGF-β和基质细胞衍生因子-1（SDF-1）信号传导驱动促肿瘤乳腺基质肌成纤维细胞的进化
,一 ,一 ,b条 ,一 ,b条 ,b条 ,b、，c（c） ,d日 ,e（电子） ,b、，c、，f、，1和a、，b、，1
小岛安史
一癌症研究——英国曼彻斯特大学帕特森癌症研究所UK间质瘤互动小组，曼彻斯特M20 4BX；
艾哈迈特·阿卡尔
一癌症研究——英国曼彻斯特大学帕特森癌症研究所UK间质瘤互动小组，曼彻斯特M20 4BX；
埃莉诺·恩·伊顿
b条马萨诸塞州剑桥市怀特海生物医学研究所02142；
基兰·梅洛迪
一癌症研究——英国曼彻斯特大学帕特森癌症研究所UK间质瘤互动小组，曼彻斯特M20 4BX；
克里斯蒂娜·谢尔
b条马萨诸塞州剑桥市怀特海生物医学研究所02142；
Ittai Ben-Porath公司
b条马萨诸塞州剑桥市怀特海生物医学研究所02142；
Tamer T.Onder公司
b条马萨诸塞州剑桥市怀特海生物医学研究所02142；
c（c）麻省理工学院生物系，马萨诸塞州剑桥市，邮编02139；
王志刚
d日马萨诸塞州剑桥市达纳-法伯癌症研究所癌症生物学系，邮编02139；
安德烈亚·理查森
e（电子）马萨诸塞州剑桥市哈佛医学院布里格姆女子医院病理科，邮编02139；和
罗伯特·A·温伯格
b条马萨诸塞州剑桥市怀特海生物医学研究所02142；
c（c）麻省理工学院生物系，马萨诸塞州剑桥市，邮编02139；
（f）麻省理工学院路德维希分子肿瘤学中心，马萨诸塞州剑桥02139
阿基拉·奥里莫
一癌症研究——英国曼彻斯特大学帕特森癌症研究所UK间质瘤互动小组，曼彻斯特M20 4BX；
b条马萨诸塞州剑桥市怀特海生物医学研究所02142；
一癌症研究——英国曼彻斯特大学帕特森癌症研究所UK间质瘤互动小组，曼彻斯特M20 4BX；
b条马萨诸塞州剑桥市怀特海生物医学研究所02142；
c（c）麻省理工学院生物学系，剑桥，马萨诸塞州02139；
d日马萨诸塞州剑桥市达纳-法伯癌症研究所癌症生物学系，邮编02139；
e（电子）马萨诸塞州剑桥市哈佛医学院布里格姆女子医院病理科，邮编02139；和
（f）麻省理工学院路德维希分子肿瘤学中心，马萨诸塞州剑桥02139
撰稿人：Robert A.Weinberg，2010年9月17日（2010年7月22日送审稿）
作者贡献：A.O.设计的研究；Y.K.、A.A.、E.N.E.、K.T.M.、C.S.和A.O.进行了研究；I.B.-P.、T.T.O.、Z.C.W.和A.L.R.提供了新的试剂/分析工具；Y.K.、A.A.、R.A.W.和A.O.分析数据；K.T.M.、R.A.W.和A.O.撰写了这篇论文。
- 补充资料
支持信息
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摘要
目前，人们对支持肿瘤进展所必需的肿瘤-基质相互作用的新作用十分关注。癌相关成纤维细胞（CAF）通常存在于人类乳腺癌的基质中，包括大量肌成纤维细胞，这是活化成纤维细胞的标志。这些成纤维细胞具有显著促进肿瘤发生的能力。然而，CAF的确切细胞起源以及这些细胞进化为促肿瘤肌成纤维细胞的分子机制尚不清楚。利用共植入乳腺肿瘤异种移植模型，我们发现在肿瘤进展过程中，常驻人类乳腺成纤维细胞逐渐转化为CAF肌成纤维细胞。这些细胞越来越多地获得由TGF-β和SDF-1细胞因子介导的两个自分泌信号回路，这两种细胞因子都以自动刺激和交叉传播的方式发挥作用。这些自分泌分泌环启动并维持成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化以及同时存在的促肿瘤表型。总的来说，这些发现表明，在肿瘤进展过程中，自持TGF-β和SDF-1自分泌信号的建立导致肿瘤促进性CAF肌成纤维细胞的产生。这种自分泌机制可能被证明是一种有吸引力的治疗靶点，可以阻止促肿瘤CAF的演变。
关键词：CXCR4、Smad、肿瘤微环境、α-平滑肌肌动蛋白
肌成纤维细胞常见于包括乳腺癌在内的各种人类癌的基质中(1). 这些细胞的大量存在也与患者的恶性程度较高和预后不良有关(2——4). 肌成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），将这些细胞与成纤维细胞区分开来，是活化成纤维细胞的标志(5——10). 基质成纤维细胞激活的肌成纤维细胞状态也与它们促进肿瘤生长的能力相关(11——14). 虽然不同类型的间充质细胞和上皮细胞被认为是肿瘤中肌成纤维细胞的前体(15——20)，其确切的细胞起源和对肿瘤生长的功能贡献仍不清楚。
近年来，研究了基质成纤维细胞和α-SMA阳性肌成纤维细胞（统称为癌相关成纤维细胞）的促肿瘤作用(21). CAF与癌细胞接种后，能有效促进小鼠异种移植模型中癌细胞的体内增殖和肿瘤生长(14,21——25). 我们之前证明，直接从侵袭性人类乳腺癌中制备的CAFs含有大量的肌成纤维细胞，这些细胞分泌高水平的促血管生成趋化因子，即基质细胞衍生因子-1（SDF-1，也称为CXCL12）(14). SDF-1信号通过其在癌细胞表面表达的同源受体CXCR4直接促进这些细胞的增殖，并通过向肿瘤基质中招募循环内皮祖细胞（EPCs）来刺激新生血管生成(14,26).
先前的研究对介导肌纤维母细胞状态形成的分子机制以及CAF的相关促肿瘤能力几乎没有阐明。肿瘤相关肌成纤维细胞与存在于伤口愈合和慢性纤维化部位的肌成纤维细胞之间的相似性早已被认识到(5,27,28). 虽然TGF-β-Smad自分泌信号明显与纤维化中肌成纤维细胞的激活状态有关(29——31)目前尚不清楚肌纤维母细胞CAF是否也依赖TGF-β自分泌信号和/或额外信号来维持其独特的表型。
因此，我们研究了CAF促肿瘤肌纤维母细胞表型的生化改变以及这些细胞的细胞起源。我们的研究结果表明，由TGF-β和SDF-1细胞因子介导的两个自分泌信号环的建立，赋予了常驻成纤维细胞促肿瘤的肌纤维母细胞表型，从而推动其分化为CAF肌纤维细胞。
结果
人乳腺成纤维细胞CAF的实验生成。
肌成纤维细胞在体外通过TGF-β暴露后的转分化而生成(32,33). 此外，已知肿瘤相关基质中的CAF人群包括成纤维细胞和肌成纤维细胞(14,34). 基于这些原因，我们推测先前存在的正常基质成纤维细胞可能在体内转化为肌成纤维细胞，特别是在肿瘤进展过程中。这种转换以前没有被证明过。
为了验证这一假设，从缩小乳房成形术组织中分离出原代正常人乳腺成纤维细胞，并用端粒酶全酶的催化亚单位hTERT永生化(35). 编码GFP和嘌呤霉素耐药蛋白的逆转录病毒构建物也被引入这些成纤维细胞。然后将产生的成纤维细胞与表达活化的MCF-7-ras人乳腺癌细胞混合ras（拉斯维加斯）癌基因(36)将混合物注射到免疫缺陷裸鼠体内。
如中所述移植后42、70和200d分别切除肿瘤移植物，分离成单细胞悬液。然后将这些细胞在嘌呤霉素存在下体外培养5天，以消除任何污染的癌细胞和宿主基质细胞。由此产生的耐嘌呤霉素细胞被称为实验生成的CAF1（exp-CAF1）细胞。这些细胞在植入42天后被切除，再次与MCF-7-ras细胞混合，并像以前一样将皮下注射到宿主小鼠体内。再次对产生的第二组肿瘤进行解剖、分离，并在嘌呤霉素的存在下进行培养。分离的耐嘌呤霉素细胞称为实验生成的CAF2（exp-CAF2）细胞（242天龄）。
exp-CAFs模拟乳腺癌患者制备的CAF的促肿瘤行为。(A类)exp-CAF的隔离。将正常GFP标记、耐嘌呤霉素、永生化人类乳腺成纤维细胞与MCF-7-ras乳腺癌细胞皮下注射到裸鼠体内。在指定日期解剖肿瘤并分离。注射的人成纤维细胞在培养中根据嘌呤霉素选择进行分离，称为exp-CAFs。有关详细信息，请参见结果。(B类)exp-CAF2细胞和对照成纤维细胞-2细胞（对照f.）的免疫荧光检测α-SMA（红色）和tenascin-C（TN-C，红色）。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）染色。（比例尺，50μm）误差线表示SEM(C类和D类)使用抗α-SMA抗体对成纤维细胞进行免疫印迹。膜也被抗α-微管蛋白抗体探测。指出了α-SMA信号强度与α-微管蛋白的比值。PD，人口翻倍。(E类)单独注射MCF-7-ras乳腺癌细胞(n个=12）或与对照成纤维细胞-2细胞（对照f。；n个=10），42天exp-CAF1细胞(n个=12），或242天龄的exp-CAF2细胞(n个=10）皮下注射到裸鼠体内。肿瘤体积(我)在指定日期测量微血管密度(ii（ii）)注射后150天，在肿瘤中与各种成纤维细胞混合进行定量*P（P）< 0.05. 误差线，SE。
作为对照，将正常GFP标记的、耐嘌呤霉素的永生化人乳腺基质成纤维细胞作为无MCF-7-ras细胞的纯培养物经皮下注射到裸鼠体内。用同样的方法分离出注射部位存活时间与exp-CAF-2细胞相同的成纤维细胞，称为对照成纤维细胞-2细胞（242天龄；图S1A类). 免疫荧光分析证实了exp-CAFs和对照成纤维细胞的间充质性质和人类起源(图S1B类).
肿瘤内常驻成纤维细胞转化为促肿瘤CAF肌成纤维细胞。
为了确定最初混合的正常人成纤维细胞在肿瘤生长过程中是否转化为富含肌纤维母细胞的人群，我们使用抗α-SMA抗体进行免疫荧光。我们观察到，242倍exp-CAF2细胞总细胞群中约48%的细胞α-SMA染色呈阳性，远远大于42d exp-CAF1细胞群中的约14%的肌成纤维细胞和242倍对照组的约2.5%的肌纤维母细胞(). 肌成纤维细胞的另一标志物细胞外基质糖蛋白tenascin-C的表达水平(11,37)，在exp-CAF2细胞中也显著高于对照成纤维细胞-2细胞()为支持这些细胞的肌纤维母细胞状态提供了额外的证据。
Western blot分析进一步证实，相对于对照成纤维细胞2，42日龄exp-CAF1细胞和exp-CAF2细胞中α-SMA的表达逐渐上调，分别为5.6倍、27.2倍、29.1倍(). Exp-CAF2细胞从肿瘤中提取出来后，在体外以纯群体的形式繁殖14倍群体（PD）时，其α-SMA表达也保持增加(). 此外，从四种不同的肿瘤异种移植物中提取的exp-CAF2细胞群也显示出类似的α-SMA蛋白表达水平的增加(图S1C类).
我们希望确定肌成纤维细胞分化是否是由于ras（拉斯维加斯）来自混合MCF-7-ras细胞的癌基因。因此，我们检查了是否存在致癌ras（拉斯维加斯）通过PCR和Western blot分析在exp-CAFs中。无致癌性ras（拉斯维加斯）在这些细胞中可以检测到基因和蛋白质的表达(图S1D类). 总之，这些观察结果表明，在肿瘤进展过程中，肌成纤维细胞分化逐渐增加，一旦建立，所产生的细胞群的分化状态以细胞自主的方式稳定维持。
为了确定exp-CAFs促进肿瘤生长的能力，我们进行了肿瘤异种移植试验。根据之前的观察(14)与含有对照成纤维细胞-2细胞的肿瘤相比，注射后147天，MCF-7-ras细胞与42天龄的exp-CAF1或exp-CAF2细胞混合的肿瘤的生长动力学和体积分别增加1.4或2.2倍(). 此外，免疫荧光检测显示，150天龄肿瘤中仍存在大量GFP-阳性exp-CAF2和对照成纤维细胞-2细胞(图S1E类,e（电子）和（f）). 含有42天exp-CAF1和exp-CAF2细胞的肿瘤的微血管密度也分别比对照组的成纤维细胞肿瘤增加2.2倍和5.5倍(和图S1E类). 综上所述，这些不同的观察结果表明，exp-CAFs密切模拟了从实际人类浸润性乳腺癌中提取的CAF的促肿瘤行为(14).
TGF-β自分泌信号在外周CAF肌成纤维细胞分化中的作用。
由于TGF-β自分泌信号调节纤维化期间的肌纤维生成，我们想知道这是否也是CAF中观察到的肌成纤维细胞分化的情况。因此，我们通过实时PCR分析测量了这些细胞中TGF-βmRNA的表达。与对照成纤维细胞-2相比，42天（分别为1.6倍和1.6倍）、70天（2.0倍和2.2倍）和200天（2.4倍和2.4倍）的exp-CAF1细胞和exp-CAF2细胞（2.7倍和4.4倍）的TGF-β1和β2表达水平逐渐增加(). 然而，TGF-β3的表达保持不变(图S2A类). 我们还观察到，与对照成纤维细胞2相比，由42天exp-CAF1（2.7倍）和exp-CAF2（4.5倍）细胞调节的培养基中TGF-β的生物活性增加().
TGF-β自分泌信号足以诱导和维持外周CAF中肌成纤维细胞的分化。(A类,我)实时PCR检测成纤维细胞中TGF-β1和TGF-α2 mRNA的表达。(ii（ii）)荧光素酶测定法测定成纤维细胞条件培养基中TGF-β的活性浓度。误差线，SE(B类)Smad2/3的免疫荧光。成纤维细胞与对照DMSO孵育(一和b条)，SB431542，TGF-βI型受体激酶抑制剂(c（c）)或重组TGF-β1(d日). 箭头(b条，黑色；d日，白色）表示核Smad2/3染色。（比例尺，100μm）(C类)使用抗pSmad2和抗β-肌动蛋白抗体的成纤维细胞的蛋白质印迹。指出了pSmad2信号强度与β-肌动蛋白的比值。(D类)用所示shRNAs或SB431542（10μM）处理的成纤维细胞的蛋白质印迹。用不同的抗体探测剥离的膜，以检测α-SMA、pSmad2、Smad2/3和α-微管蛋白。(E类)上述成纤维细胞的实时PCR分析。误差线，SE。
鉴于在exp-CAF肌成纤维细胞中观察到TGF-β表达和生物活性的增加，我们推测TGF-？配体可能通过其受体以自分泌方式诱导Smad信号传导，从而促进这些细胞的肌成纤维状态。事实上，使用抗Smad2/3抗体的免疫荧光显示exp-CAF2细胞中有强烈的核染色()正常成纤维细胞用TGF-β1（10 ng/mL）处理1 h(). 相反，在对照组成纤维细胞-2细胞中很少观察到核Smad2/3染色(). 此外，用转化生长因子-βI型受体（TβRI）激酶抑制剂SB431542（10μM）处理exp-CAF2细胞24小时后，细胞核染色水平显著降低()，表明Smad信号通过激活这些细胞中的TβRI而构成诱导。Western blot分析进一步证实，与对照成纤维细胞-2细胞相比，42（2.9倍）、70（6.2倍）和200（7.1倍）日龄exp-CAF1细胞和exp-CAF2细胞磷酸化Smad2的表达逐渐升高(). 综上所述，这些观察结果表明，exp-CAF-分泌的TGF-β以自分泌方式激活这些细胞中的Smad2/3信号，表面上是通过TGF-？I/II受体。
为了确定TGF-β自分泌信号是否有助于维持成肌细胞状态和上调外周CAF中TGF-(图S2B类). 与相关对照组相比，TβRII-shRNA、Smad4-shRNA或SB431542（10μM）治疗5 d后Smad信号的抑制使exp-CAF2细胞中α-SMA（分别降低85%、99%或85%）、TGF-β1（降低68%、48-74%或65%）和TGF-？的表达水平降低（降低66%、71%或75%）(). 此外，通过表达组成活性TGF-β1结构激活Smad信号(38)或通过添加重组TGF-β1诱导正常乳腺成纤维细胞中α-SMA和TGF-(图S2C类)，与之前的文献一致(39). 综上所述，这些发现表明，exp-CAFs中TβR-Smad信号的激活可诱导并维持其肌成纤维细胞分化和TGF-β合成，从而产生正反馈TGF-α信号回路。
自我刺激SDF-1-CXCR4自分泌信号在肌成纤维细胞分化中的作用。
SDF-1在体外和体内的CAF肌成纤维细胞中的表达水平升高(14,40——42). 一致地，实时PCR分析显示，相对于对照成纤维细胞-2，42天（5.9倍）、70天（10.3倍）和200天（38倍）的exp-CAF1细胞和exp-CAF2细胞（34倍）中SDF-1的表达逐渐上调(). ELISA还显示，42天龄exp-CAF1（2.3倍）和exp-CAF2（20倍）细胞释放的SDF-1水平增加(图S3A类). 此外，Western blot和免疫荧光分析显示，与对照成纤维细胞相比，exp-CAF2细胞（～14个PDs）中SDF-1同源受体CXCR4的表达增加了五倍()，与以前的文献一致(43). 因此，我们推测释放的SDF-1可能通过CXCR4以自分泌方式作用于这些细胞，从而促进其肌纤维母细胞表型。
SDF-1自分泌信号与TGF-β信号相互作用，进一步促进外周CAF中肌纤维母细胞分化。(A类)实时PCR检测成纤维细胞SDF-1 mRNA表达。误差线，SE(B类,我)使用抗CXCR4和抗α-微管蛋白抗体对成纤维细胞进行免疫印迹。(ii（ii）)使用抗CXCR4抗体的免疫荧光（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。（比例尺，50μm）(C类)表达所示shRNAs的成纤维细胞的Western blotting检测CXCR4。还使用抗α-SMA和α-微管蛋白的抗体探测膜。显示了α-SMA或CXCR4相对于α-微管蛋白的信号强度比值。(D类)用或不用SDF-1处理的表达GFP或CXCR4的人乳腺成纤维细胞的免疫印迹。(E类)到期CAF2(n个=12）或对照成纤维细胞-2(n个将表达CXCR4-或GFP-shRNAs的细胞与MCF-7-ras细胞皮下注射到裸鼠体内*P（P）< 0.05. 误差线，SE(F类,我)TGF-β1处理的正常乳腺成纤维细胞的实时PCR分析。(ii（ii）)用指示的shRNAs处理成纤维细胞的实时PCR。误差线，SE(三)表达GFP-或CXCR4-shRNA的乳腺成纤维细胞经TGF-β1处理或不处理后的Western blotting。用不同抗体探测剥离的膜，以检测α-SMA、CXCR4和α-微管蛋白。CXCR4-shRNA-表达细胞中观察到的CXCR4信号只能通过增强化学发光底物检测到。(G公司)表达CXCR4-或GFP-shRNA的成纤维细胞的实时PCR分析。误差栏，SE。
我们使用两种针对SDF-1或CXCR4的不同shRNA构建物检测了这种可能性。与对照GFP-shRNA的作用相比，在exp-CAF2细胞中，SDF-1和CXCR4蛋白表达水平分别被显著抑制72-76%和66-78%(图S3B类和). 免疫印迹和免疫荧光分析还显示，表达SDF-1-shRNA（67-77%）、CXCR4-shRNA（62-75%）或经CXCR4特异性抑制剂AMD3100处理的exp-CAF2细胞中α-SMA表达水平减弱(44)持续6天(和图S3C类). 这些数据表明，SDF-1-CXCR4自分泌信号是维持exp-CAF2细胞肌纤维母细胞表型所必需的。
为了确定触发SDF-1-CXCR4信号是否诱导肌纤维母细胞表型，一种编码CXCR4 cDNA的逆转录病毒构建物(45)被引入人类乳腺成纤维细胞(图S3D类). 我们观察到，与表达GFP的成纤维细胞相比，当暴露于SDF-1（200 ng/mL）72小时时，表达CXCR4的细胞中α-SMA的表达增加了约100倍(). 配体诱导的CXCR4活化也足以诱导并持续维持外周CAF中SDF-1表达水平的升高(图S3E类). 综上所述，这些发现表明，与所描述的TGF-β自分泌信号一样，SDF-1自分泌信号通路也以自我刺激的方式运作，并有助于外周CAF中肌纤维母细胞的分化。
重要的是，与含有对照GFP shRNA表达细胞的肿瘤相比，含有表达CXCR4 shRNA的混合exp-CAF2细胞的MCF-7-ras肿瘤在注射后128天的肿瘤体积分别减少49%或52%，新生血管生成减少45%(和图S3F类,一). 相反，与含有GFP表达的成纤维细胞的肿瘤相比，在注射后116天，在CXCR4表达的成细胞存在下生长的MCF-7-ras肿瘤的肿瘤体积增加了56%(图S3F类,b条). 总之，这些数据表明SDF-1-CXCR4自分泌信号传导负责诱导和维持这些间充质细胞在体内加速肿瘤生长的能力。
实验性CAFs中TGF-β和SDF-1自身分泌信号环之间的串扰。
由于TGF-β和SDF-1自分泌信号通路对exp-CAFs的肌成纤维细胞分化都是必需的，因此我们推断这些通路可能相互沟通并激活，以进一步促进肌成纤维表型。事实上，PCR分析表明，乳腺成纤维细胞暴露于TGF-β1（10 ng/mL）24小时后，SDF-1（四倍）和CXCR4（2.5倍）表达上调(和图S4A类). 与对照GFP-shRNA相比，TβRII-（70%）或Smad4-（62-70%）shRNA对TβR-Smad信号的抑制减弱了TGF-β1对这些细胞中SDF-1表达的诱导(图S4B类). 在表达TβRII或Smad4-shRNA的exp-CAF2细胞中，SDF-1 mRNA的表达也分别减少了67%或74-83%()表明SDF-1的表达是由这些细胞中的TβR-Smad信号介导的。相反，Smad4-shRNA对Smad信号的抑制未能抑制TGF-β1（10 ng/mL）诱导的乳腺成纤维细胞CXCR4表达24小时(图S4C类). 总的来说，这些数据表明TGF-β信号通过Smad-依赖途径提高SDF-1表达，并通过Smad-independent途径增加CXCR4表达，从而诱导并维持SDF-1-CXCR4自分泌信号。
我们进一步证明，TGF-β诱导的SDF-1-CXCR4信号转导介导TGF-α诱导的肌成纤维细胞形成。用TGF-β1（10 ng/mL）孵育72 h后，CXCR4-shRNA抑制乳腺成纤维细胞中CXCR4的表达，导致α-SMA表达的诱导减弱3.4倍，而对照组GFP-shRNA表达细胞的诱导为10.8倍(). 这些数据表明了CXCR4信号对TGF-β诱导的肌纤维母细胞状态的需求。因此，我们得出结论，TGF-β自分泌信号不仅直接通过TβR-Smad信号通路，而且通过随后诱导的SDF-1-CXCR4自分泌信号通路，促进了exp-CAFs中肌成纤维细胞的分化。
我们还观察到，SDF-1-CXCR4信号的激活诱导并帮助维持外周CAF中TGF-β表达的升高。与对照GFP shRNA相比，CXCR4 shRNA对CXCR4表达的抑制导致exp-CAF2细胞中TGF-β1（46%–59%）和TGF-β2（47%–51%）mRNA表达减弱，表明TGF-β表达对SDF-1-CXCR4自分泌信号有一定依赖性(). 相反，表达CXCR4的成纤维细胞暴露于重组SDF-1蛋白（100 ng/mL）24小时，与未培养SDF-1的对照GFP表达成纤维细胞相比，内源性TGF-β1（4.4倍）和TGF-α2（4.2倍）mRNA表达上调(图S4D类). 综上所述，这些发现强烈表明TGF-β和SDF-1自分泌信号回路在exp-CAF内聚合以相互刺激。
侵袭性乳腺癌肌成纤维细胞中存在SDF-1和TGF-β自分泌信号环。
为了确定SDF-1和TGF-β自分泌信号环是否在实际的人类乳腺癌中起作用，我们对两种表现为非三重阴性表型的浸润性导管乳腺癌的肿瘤切片进行了免疫染色。SDF-1、CXCR4和磷酸化Smad2蛋白很容易在肿瘤相关的α-SMA阳性肌成纤维细胞中检测到，但在正常人类乳腺组织中未检测到基质成纤维细胞(和图S5). 重要的是，我们还观察到从三个不同乳腺癌患者中提取的原发性CAF肌成纤维细胞显示SDF-1和TGF-βmRNA表达升高，TGF-(图S6A类). 我们进一步证实了交叉通讯、自我刺激SDF-1和TGF-β自分泌信号通路在使用shRNAs维持这些细胞的肌成纤维细胞状态中的重要性(图S6B类). 综上所述，我们得出结论，浸润性人类乳腺癌中存在的基质肌成纤维细胞需要SDF-1和TGF-β自分泌信号环以自我刺激和相互交流的方式维持肌成纤维蛋白的分化。
TGF-β和SDF-1自分泌信号在侵袭性乳腺癌CAF中起作用。(A类)抗SDF-1抗体对侵袭性乳腺癌切片的免疫组织化学研究(一，棕色），CXCR4(b条，棕色；e（电子）和（f），红色），pSmad2(c（c），棕色；小时和我，红色）和α-SMA(d日,（f）,克、和我，绿色）。切片也用苏木精染色(a–c，淡蓝色）或DAPI(d–i日，蓝色）。染色阳性的细胞用箭头突出显示。一组癌细胞用星号表示。（比例尺，50μm）(B类)在肿瘤进展过程中，肿瘤内的基质成纤维细胞越来越多地获得两个涉及TGF-β和SDF-1的自分泌信号环，介导转分化为促肿瘤的CAF肌成纤维细胞。(C类)示意图描述了由TGF-β和SDF-1介导的CAF肌成纤维细胞中的两个自我刺激和交叉通信信号回路。CAF分泌的TGF-β和SDF-1配体分别以自分泌方式作用于TβR和CXCR4。TβR-Smad2/3和CXCR4信号通路的随后激活驱动肌成纤维细胞分化和内源性TGF-β和SDF-1表达，从而产生以前馈方式作用的自我刺激自分泌信号回路。重要的是，TβR-Smad2/3信号也增加SDF-1表达，从而增强SDF-1-CXCR4自分泌信号。这反过来又提高了内源性TGF-β的表达。因此，这些自分泌信号回路之间的交叉对话相互刺激，并进一步促进CAF中肌成纤维细胞的分化。粗直箭头表示直接刺激修改，细直箭头表示转录贡献。
讨论
从人类肿瘤中提取的富含肌纤维母细胞的细胞群CAF具有促进肿瘤发生的能力。这些细胞在体外经过10次PDs的传代，没有与癌细胞发生持续的相互作用，当与癌细胞一起注射到免疫缺陷小鼠体内时，它们仍然能够促进肿瘤生长(14,46). 然而，其促肿瘤能力的分子机制尚不清楚。一些人报告了体细胞遗传改变在形成促肿瘤基质中的重要性，但它们的存在仍有争议(47——49). 肿瘤相关肌成纤维细胞的细胞起源以及调节其肌成纤维细胞状态的分子过程也尚不清楚。
在目前的实验中，我们表明肿瘤内的乳腺成纤维细胞可以通过其肌成纤维细胞的分化，实质上转化为促肿瘤的CAF。我们不能正式排除正常乳腺成纤维细胞中存在少量α-SMA阳性细胞作为肿瘤相关肌成纤维细胞前体的可能性。然而，事实上，这种肌纤维母细胞转化可以在暴露于癌细胞调节的培养基中的基质成纤维细胞中有效诱导，因此这种替代来源的可能性较小(50,51).
在肿瘤进展过程中，先前存在的基质成纤维细胞以自我维持的方式获得逐渐增强的TGF-β和SDF-1自分泌信号回路，调节其肌成纤维细胞分化和相关的促肿瘤能力(). 这种自刺激信号可能满足表观遗传机制的先决条件，该机制可以在本例中稳定维持细胞表型，即肌成纤维细胞分化状态。我们顺便注意到，例如，正反馈回路用于维持胚胎干细胞和造血祖细胞的未分化状态(52,53).
我们认为，在肿瘤进展过程中，自分泌信号最初是由癌细胞大量释放TGF-β触发的(54——57). TGF-β可以通过TβR-Smad信号诱导内源性TGF-α和SDF-1的生成，并诱导基质成纤维细胞CXCR4的表达，从而促进由TGF-。这种自分泌信号回路自我刺激并相互交叉通讯，以维持肌纤维母细胞表型。
我们不能排除在肿瘤内孵育过程中最初存在的正常成纤维细胞中获得的基因改变影响观察到的自分泌信号和肌成纤维细胞分化的可能性。然而，我们发现两种类型的CAF（从人类浸润性乳腺癌中制备的CAF和从实验性异种移植瘤中提取的CAF）抑制了正常的核型，并且当其自身植入时，是非肿瘤原性的(14). 我们还表明野生型p53在两种CAF中继续表达(图S7)强烈提示p53信号的改变并不是诱导或维持促肿瘤肌成纤维细胞中这种自分泌信号的原因。
目前的观察结果表明，促癌CAF肌成纤维细胞可通过在肿瘤进展过程中以细胞自主方式建立TGF-β和SDF-1自分泌信号，从先前存在的基质成纤维细胞起源。靶向和破坏这种阻止促肿瘤肌成纤维细胞形成和维持的自分泌信号的药理学方法可能是未来有用的抗肿瘤治疗策略。
材料和方法
如前所述，从健康人类乳腺组织中提取原代基质成纤维细胞(14). 表达hTERT和GFP的逆转录病毒pMIG（MSCV-IRES-GFP）载体和编码嘌呤霉素耐药基因的pBabe-puro载体被感染到这些成纤维细胞中，然后与乳腺癌细胞共植入裸鼠体内以生成exp-CAFs。
根据标准程序进行细胞培养、免疫印迹、免疫染色、实时PCR、流式细胞术、ELISA、病毒感染、致瘤性分析和血管生成评估。详细信息见SI材料和方法。所使用的抗体、化学品和DNA结构也在SI材料和方法。
致谢
我们感谢Joseph Sodroski博士、Daniel Rifkin博士、Lalage Wakefield博士和Luciano Zardi博士提供的试剂；Garry Ashton、Tsukasa Shibue博士和Paul Chantry提供技术援助；David Sabatini博士进行了有益的讨论；尼克·琼斯博士批判性阅读这份手稿；以及R.A.W.和A.O.实验室的成员。这项工作是利用帕特森癌症研究所的核心设施和怀特黑德研究所的W.M.凯克基金会生物成像设施进行的。这项工作得到了国家卫生研究院/国家癌症研究所拨款R21CA87081-02（发给R.A.W.）、德国学术交流服务（C.S.）、国家卫生研究所拨款P01 CA080111和R01 CA078461（发给R.A.W.）以及乳腺癌研究基金会（R.A.W）的支持，麻省理工学院/路德维希癌症研究基金（发给R.A.W.）和英国癌症研究基金C147/A6058（发给A.O.）。R.A.W.是美国癌症协会研究教授和Daniel K.Ludwig癌症研究教授。
工具书类
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