RB肿瘤抑制途径在造血系统氧化应激反应中的作用

摘要

哺乳动物细胞周期检查点被激活以应对细胞内和细胞外应激，如生长因子缺乏、核苷酸耗竭和DNA损伤，以及视网膜母细胞瘤(皇家银行)肿瘤抑制因子是执行这些检查点的核心^1–三RB的压力响应函数是理解BMI1公司–INK4A（墨水）–cyclin D–RB–E2f轴在防止异常增殖和肿瘤生长中的作用^4–6(图1). 调节RB去磷酸化和活化以响应血清剥夺和DNA损伤并导致细胞周期阻滞的信号通路已被很好地描述^6–8(方框1). 特别是，Ras活性的生长因子刺激促进激活蛋白1依赖的转录诱导细胞周期蛋白D1，而血清依赖性诱导MYC公司具有类似的交易激励作用细胞周期蛋白D2（参考。9). D型细胞周期蛋白表达促进细胞周期蛋白依赖性激酶4的活性(川东北4)以及川东北6磷酸化RB，导致其失活和E2f转录因子的去表达^6,10相反，DNA损伤通过促进RB去磷酸化（部分通过诱导第53页-依赖性表达第21页结合并抑制CDK2型活动¹¹也通过激活蛋白磷酸酶2A（PP2A）^12,13最近的报告表明活性氧（ROS）的积累与细胞周期进展之间存在联系¹⁴但活性氧水平增加与细胞周期控制之间的机械联系尚未建立。新的数据将ROS增加与造血系统中RB通路的激活联系在一起，本综述侧重于我们目前对BMI1–INK4A–cyclin D–RB–E2f轴在通过与其他调控通路的串扰来确定细胞增殖速率以应对氧化应激中的作用的理解，血液系统中的干细胞自我更新和终末分化。

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图1

视网膜母细胞瘤（RB）通路在应激反应和癌症中的作用

正如温伯格最初提议的那样¹³⁸，RB肿瘤抑制因子在大多数人类癌症中被功能性灭活，或者直接通过RB1型缺失或突变，或通过解除对RB通路上游成分的调控而间接导致，如D型细胞周期蛋白、细胞周期依赖性激酶（Cdk）抑制剂INK4A或多梳蛋白BMI1（参与抑制CDKN2A型基因座，编码INK4A和ARF）^4,132指出RB通路成分被解除调控的人类肿瘤类型。在癌症中消除了使RB失活的选择性压力，从而破坏了RB通路的上游成分，如INK4A¹⁵⁸或细胞周期蛋白D1（参考。159)或下游事件，如E2F3型在人体内膀胱和前列腺癌症^160,161通过RB通路的信号传递决定了调节细胞周期进展的E2f靶基因表达的变化，包括E型细胞周期蛋白、细胞分裂周期6（CDC6）、胸腺嘧啶激酶（TK）和EMI1（REF）。10). 在缺乏促生存信号的情况下，E2f可以激活私有的促凋亡靶基因，包括凋亡蛋白酶激活因子（APAF1）（REF）。162)，半胱天冬酶¹⁶³，AMPKα2（参考。164)和关键的BH3-唯一蛋白质，如BIM¹⁶⁵外源信号和应激直接输入RB途径，通过各种机制调节细胞周期，包括D型细胞周期蛋白的转录激活，以响应通过Ras和MYC的血清刺激信号⁹以及它们被Foxo转录因子（TF）的转录抑制。RB的去磷酸化和活化由蛋白磷酸酶2A（PP2A）和Cdk抑制介导，以响应DNA损伤^12,166而INK4A的诱导是对活性氧物种的反应（通过p38丝裂原活化蛋白激酶进行信号传递⁵⁴或通过染色体易位的蛋白质产物，如E2A–PBX1（REF）诱导BMI1。167)). 急性髓性白血病；急性早幼粒细胞白血病；MCL，套细胞淋巴瘤；非小细胞肺癌；小细胞肺癌。

活性氧与细胞周期

活性氧是由氧的单电子还原产生的高活性分子。它们包括氧阴离子，如超氧物和羟基自由基，以及过氧化氢和过氧亚硝酸盐，这是由超氧物与一氧化氮反应产生的^15,16它们主要是在线粒体处电子传输链的复合物I和复合物III释放电子后产生的^17,18过氧化物酶体和质膜上NADPH氧化酶（Nox）的活性¹⁹(方框2). 一般来说，它们在细胞信号传递中具有重要功能，但对其在调节细胞周期进展中的作用却知之甚少。随着细胞从G1期进入细胞周期的S期，活性氧水平显著增加^14,20和活性氧是进入S期所必需的，如活性氧猝灭引起的细胞周期阻滞所示^14,21然而，ROS增加也会激活细胞周期检查点²²表明细胞增殖依赖于将活性氧水平维持在功能范围内。活性氧被提议以多种方式调节细胞周期，包括通过影响酶的活性，使酶的催化位点具有氧化还原敏感氨基酸²⁰细胞周期进展所必需的。其中包括对核苷酸生物合成至关重要的核糖核苷酸还原酶²³ROS也被提出通过迄今未知的机制抑制关键细胞周期进展因子的周转。例如，ROS可以稳定F-box纯蛋白5的水平(FBXO5型，也称为EMI1）¹⁴是一种E2f靶基因，通过充当假底物来抑制细胞周期S和G2期的后期合成物（APC），从而防止过早进入有丝分裂²⁴.

细胞周期控制与造血系统

通过对缺乏关键细胞周期调节蛋白（如INK4A、p21、D型细胞周期蛋白和RB）表达的基因工程小鼠进行表型分析，强调了适当的细胞周期控制对造血稳态，尤其是干细胞自我更新的重要性^25–32(表1). 生物体对诸如贫血、感染和短命细胞的自然损耗等生理应激的反应能力依赖于对造血干细胞（HSC）从其主要的静止状态进入细胞周期，以补充干细胞池，并提供可扩展和分化产生功能性终末期血细胞的祖细胞^32,33细胞周期抑制分子（如p21）的丢失会导致干细胞耗竭，这是细胞周期进入和分化增加的结果，但会破坏细胞的自我更新^26,32相反，由于干细胞增殖失败，三种D型细胞周期蛋白的失活导致造血功能不全²⁷细胞周期素依赖性激酶抑制剂INK4A在HSC自我更新中的作用是年龄依赖性的，这与小鼠干细胞中随着时间的推移INK4A表达增加一致²⁵不仅在造血系统中，而且在胰腺和神经干细胞中^34,35来自衰老小鼠的INK4A缺陷HSC细胞在注射到致命辐射的受体小鼠中时显示出增加的细胞周期进入和自我更新，但来自年轻小鼠的相应细胞显示出降低的自我更新能力，可能反映了INK4A在与供者骨髓细胞移植到消融的宿主血液系统相关的增殖应激反应中的需求²⁵在HSC中以年龄依赖的方式促进INK4A表达的机制尚不清楚，但如下文所述，可能涉及氧化应激诱导的信号通路，氧化应激随着年龄的增长而积累，这与“衰老自由基理论”一致¹⁵(方框2). 例如，负性调节INK4A和ARF表达的多梳蛋白BMI1的活性可能受到氧化应激的调节，如下所述(图2)BMI1的靶向性缺失导致骨髓造血干细胞中INK4A和ARF的表达增加，干细胞自我更新能力显著丧失^36,37.

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图2

氧化应激反应连接视网膜母细胞瘤（RB）通路和Forkhead box O（Foxo）转录因子

Foxos在氧化应激反应中的激活由活性氧物种（ROS）激活的激酶介导，如JUN N-末端激酶（JNK），以及由ROS诱导的β-连环蛋白与Foxos的相互作用。活性Foxos通过抗氧化基因的转录诱导抑制细胞活性氧水平，如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶2（REF）。49). 除了调节ROS水平外，Foxos还调节增殖和细胞死亡^49,168响应传入信号，例如通过PTEN和Akt介导的信号⁴⁹Foxos的关键细胞周期调控靶点包括细胞周期依赖性激酶（Cdk）抑制剂p21和p27，它们由Foxos正向调节⁴⁹和D型细胞周期蛋白，它们被负调控⁴⁹RB是这两组Foxo靶基因的下游效应器。Foxo转录因子也调节转录共激活物CITED2（REF）的表达。122)调节BMI1水平¹⁶⁹，通过抑制INK4A进入RB通路的调节。Foxos还可能通过影响p38有丝分裂原活化蛋白激酶的活性氧依赖性激活来影响RB活性，该蛋白激酶通过Ets转录因子诱导INK4A转录。此外，p38促进环氧合酶2（COX2）表达，通过转化生长因子β（TGFβ）或INK4A介导诱导RB依赖性细胞周期阻滞。有趣的是，E2f活性反馈以诱导ASK1的表达，ASK1调节p38^MAPK公司活性氧活度¹⁷⁰据报道，FOXO3A与共济失调毛细血管扩张症突变（ATM）直接相互作用可促进细胞对DNA双链断裂的反应，而Foxo或ATM的丢失会导致细胞DNA损伤和ROS增加⁵⁸DNA损伤诱导ROS的机制尚不清楚，但可能是由聚ADP核糖聚合酶1（PARP1）活性增加介导的，PARP1会耗尽NAD⁺并抑制戊糖磷酸途径^72,74.

RB在造血稳态中的作用

由于微环境在造血表型中的明显作用，使得理解RB肿瘤抑制因子本身及其上游调节因子在造血中的作用变得复杂，而这种造血表型的缺失与RB肿瘤的上游调节因子有关1卢比在鼠标中(表1). 从第一次研究1卢比-零嵌合体小鼠证明野生型细胞的存在可以挽救观察到的细胞表型缺陷1卢比-无胚胎^38,39对于RB在造血中的作用，我们的理解一直贯穿于关于缺陷是细胞自主还是非细胞自主⁴⁰(方框3). 尽管在理解RB在不同发育背景下的功能方面取得了进展，但RB在HSC稳态中的作用仍存在争议^28–30,41早期证据表明，当1卢比-空胎肝被用作供体干细胞的来源²⁸但是，考虑到这些细胞是在一个不正常的环境中发育的，许多因素可以解释这些观察结果。最近的研究利用条件靶向研究RB在成年小鼠HSC功能中的作用^29,30,41尽管矛盾依然存在，但仍出现了HSC功能缺陷的一些显著特征(表1). 与之前的重新种群研究一致²⁸，成人1卢比^{flox/flox公司}删除造血系统中RB的小鼠（使用Vav–克里或聚（I）聚（C）-诱导的Mx1–Cre系列)随着年龄的增长，贫血患者和骨髓增生性疾病患者的发病率逐渐升高。这最初与骨髓细胞增多有关，但随后出现骨髓功能不全和脾髓外造血^29,30有趣的是，这两项研究都表明，患有糖尿病的小鼠外周血和脾脏中HSC活性增加，骨髓中HSC数量减少1卢比-造血系统缺陷^29,30，表明RB在保持骨髓生态位内HSC方面的作用(方框4). HSC的细胞周期分析1卢比^{flox/flox公司};Vav–克里小鼠表示1卢比-当被诱导复制应激的因子（如5-氟尿嘧啶（5-FU）²⁹通过抑制胸苷酸合成酶和耗尽DNA复制所需的核苷酸，5-FU诱导DNA损伤和增殖细胞死亡⁴²然而，可能是循环祖细胞死亡的结果，5-FU已被证明可诱导细胞周期重新进入1卢比-零HSC⁴³与活性氧生成增加、N-钙粘蛋白和HSC从骨髓龛中分离⁴³.证明1卢比-5-FU治疗后，空细胞更容易重新进入细胞周期，这意味着RB参与HSC静止，也参与调节对DNA损伤和ROS生成的反应，如1卢比-在缺乏复制应激的情况下，缺乏HSC的细胞周期相分布与野生型细胞相似²⁹事实上，最近的研究表明RB相关蛋白p107（也称为RB-like 1(RBL1型))和p130(RBL2型)可能会补偿1卢比稳态条件下HSC中⁴⁴.

非细胞自主因子和骨髓微环境对携带靶向缺失的成年小鼠造血缺陷的影响程度1卢比目前尚不清楚，因为一些Cre-deleter菌株（特别是Mx1–Cre系列)其表达不具有造血细胞特异性³⁰基于使用来自卢比^{flox/flox公司};Mx1–Cre系列与对照骨髓混合的小鼠1卢比^弗洛克斯Walkley和他的同事最初报告说1卢比不需要自我更新和长期的多血统重新填充容量HSC的⁴¹。这些数据与之前使用1卢比-无胎肝²⁸以及最近使用骨髓的研究1卢比^{flox/flox公司};Vav–Cre公司老鼠²⁹然而，Walkley及其同事随后报告称，他们确实观察到骨髓增生性疾病、髓外造血和骨髓造血干细胞丢失1卢比^弗洛克斯;Mx1–Cre系列老鼠³⁰值得注意的是，p107的缺失以前与BALB/C小鼠骨髓增生性疾病的发生有关⁴⁵用重组的小鼠骨髓中成熟髓系元素的扩增1卢比-无胎肝²⁸有趣的是骨髓增生在中检测到1卢比^{flox/flox公司};Mx1–Cre系列在1卢比^{flox/flox公司};LysM–Cre公司溶菌酶M启动子在髓细胞室（包括祖细胞和终末期细胞）中驱动Cre表达的小鼠³⁰的确，干扰素诱导的，Mx1型-被驱动的Cre公司HSC的表达导致造血子代和血统的缺失1卢比，包括髓源性破骨细胞和构成骨髓微环境的巨噬细胞³⁰因此，尽管Walkley及其同事在移植来自1卢比^{flox/flox公司};Mx1–Cre系列将小鼠移植到受致命照射的野生型宿主（具有野生型骨髓微环境）或反之亦然，当他们从1卢比^弗洛克斯;LysM–Cre公司小鼠受到致命辐射1卢比^{flox/flox公司};Mx1–克里老鼠³⁰这些小鼠出现了一种完全渗透性骨髓增生性疾病，与1卢比^{flox/flox公司};Mx1–Cre系列作者提出，这表明髓系祖细胞与骨髓生态位之间存在相互作用。然而，鉴于骨髓壁龛中的破骨细胞和巨噬细胞本身就是髓系起源，这并不能解释为什么1卢比^{flox/flox公司};LysM–Cre公司小鼠也没有表现出这种完全渗透性表型，除非骨髓生态位中有一种额外的关键细胞类型被Mx1–Cre系列但不是通过赖氨酸M–克里这是一个有待解决的问题。考虑到间充质衍生成骨细胞在骨髓生态位中的重要性^46,47(方框4)以及RB在成骨细胞分化中的作用⁴⁸，一个明显的研究方向是检测成骨细胞特异性缺失1卢比HSC功能和骨髓增生。此外，因为1卢比未从中的HSC中删除1卢比^{flox/flox公司};LysM–Cre公司小鼠，迄今为止的研究尚未解决1卢比与骨髓增殖相反，骨髓生态位中的HSC行为受到特异性影响。然而，HSC表型的存在支持了这种作用1卢比^{flox/flox公司};Mx1–Cre系列老鼠³⁰但在移植了1卢比^{flox/flox公司};Mx1–Cre系列骨髓⁴¹先前讨论的依赖于复制应激诱导物来揭示细胞周期缺陷1卢比^{flox/flox公司};Vav–Cre公司HSC指出了生态位在保护HSC免受氧化应激方面的潜在作用。

造血系统中的氧化应激

造血系统中氧化应激的关键调节剂之一是叉头盒O（Foxo）转录因子，它调节抗氧化剂如超氧化物歧化酶2(SOD2标准)以及过氧化氢酶⁴⁹.删除福克斯3a在小鼠中，SOD2和过氧化氢酶的表达减少，HSC中ROS增加，HSC自我更新潜力降低，这与细胞周期进入增加有关⁵⁰。带有PTEN公司-缺乏的干细胞表现出类似的表型，与作用于Foxo上游的PTEN一致⁴⁹(图2). 除了调节抗氧化剂外，Foxos还参与细胞周期抑制剂的转录上调，包括p21、，第27页和第130页和D型细胞周期蛋白的下调。⁴⁹因此，这些基因在HSC中被解除调控福克斯1,福克斯3a和福克斯4这一结果与细胞周期S/G2和M期HSC数量增加、分化增加和自我更新能力降低相一致⁵¹有趣的是，虽然删除了Foxo3a公司单独诱导HSC表型和贫血^51,52，伴随删除福克斯1,福克斯3a和福克斯4也与骨髓增生性疾病有关，类似于在患有1卢比-造血系统缺陷^28–30Foxo关键靶基因通过影响RB的磷酸化和随后的失活来调节其细胞周期调节功能，这可能解释了造血表型的这些相似性⁸.

通过考虑ROS在造血系统中的作用，可以在Foxo转录因子和RB途径之间建立额外的联系(图2). Foxo转录因子在HSC中以细胞自主方式调节ROS水平⁵¹.治疗福克斯3a^−/−小鼠或复合Foxo-deleted突变小鼠（通过靶向删除福克斯1,福克斯3和福克斯4在造血系统中）与谷胱甘肽供体和抗氧化剂N个-乙酰半胱氨酸（NAC）恢复了HSC池大小并挽救了HSC功能^50,51因此，这些研究表明在Foxo突变小鼠中观察到的HSC缺陷中ROS增加。

ROS先前被确定为变异的共济失调毛细血管扩张症中观察到的HSC缺陷的病因(Atm公司)-无鼠标⁵³其中观察到HSC的年龄依赖性丢失、多系骨髓衰竭和贫血。同样，NAC治疗挽救了这些小鼠中观察到的缺陷。人乳头瘤病毒蛋白E7的表达（它使Rb家族的口袋蛋白失活，包括Rb、p107和p130，参见方框1)防止干细胞耗竭并恢复再生能力Atm公司-零HSC⁵³，强调了RB通路在预防HSC耗竭中的重要性Atm公司和ROS生成。有趣的是，INK4A水平在两组中均升高Atm公司-null和in福克斯3a-在这两种情况下，这都依赖于活性氧和p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性^50,54JUN N末端激酶（JNKs）和p38被激活，以响应各种细胞应激，这些应激改变细胞的氧化还原状态，例如内质网应激、DNA损伤、炎症细胞因子和钙流量⁵⁵，其激活依赖于凋亡信号调节激酶1（ASK1，也称为地图3K5)⁵⁶ASK1通过与还原的硫氧还蛋白相互作用而保持在非活性状态，硫氧还蛋白含有两个对氧化还原敏感的半胱氨酸残基，它们响应氧化还原应激而被氧化。这会从硫氧还蛋白释放ASK1，导致丝裂原活化蛋白激酶3下游活化(MAP2K3（地图2K3）)以及MAP2K6（地图2K6），随后激活p38和JNK⁵⁶注意，JNK需要通过MAP2K4（地图2K4），独立于ASK1激活，对ROS作出完全响应⁵⁶在造血系统中，由于ATM或Foxo蛋白的缺失而诱导的ROS导致p38激活，p38（或ASK1）的抑制阻止了INK4A的诱导和N-钙粘蛋白在HSC中，导致HSC自我更新的恢复^43,50,54这项研究表明，ROS和Foxo转录因子下游的p38活性通过诱导INK4A激活RB通路(图2). 虽然提出的模型包括p38介导的BMI1磷酸化和失活（参与抑制CDKN2A型基因座，编码INK4A和ARF）或通过p38诱导激活Ets转录因子，正调控INK4A转录⁵⁷.

DNA损伤和氧化应激

这些研究为p38上游的ATM和Foxos在HSC细胞ROS水平管理中发挥了关键作用(图2)有趣的是，最近的研究表明，ATM和FOXO3A在DNA损伤焦点处有直接的相互作用，并且FOXO3A在促进ATM的自磷酸化和激活以应对损伤方面发挥了作用⁵⁸先前已经证明，DNA损伤传感缺陷或修复双链断裂所涉及的同源重组缺陷会导致造血系统疾病^59,60RB和E2f参与了几个关键DNA修复蛋白的转录调控，包括风扇CD2,MSH2型和RAD51系列（参考^61–63). 此外范科尼贫血蛋白FANCD2或共济失调毛细血管扩张和Rad3相关(自动标签阅读器)两者都是细胞周期阻滞和修复所必需的，以应对DNA交联剂，与贫血和骨髓衰竭有关^64,65同样，患有造血系统恶性肿瘤、免疫缺陷和骨髓纤维化的患者共济失调毛细血管扩张,综合征如奈梅亨破损综合症（NBS）和遗传性乳腺癌和卵巢癌综合征，与自动取款机,NBN公司和白细胞介素2分别为^64,66,67特别令人感兴趣的是，范科尼贫血途径位于ATM激酶下游对DNA损伤的反应，与共济失调毛细血管扩张细胞类似，范科宁贫血细胞显示ROS水平增加和氧化DNA碱基损伤⁶⁸。有趣的是，来自FANCC公司互补组只对化疗药物的交联作用敏感丝裂霉素C在高氧浓度下，其行为与低氧水平下的正常细胞相似，这与ROS直接存在于观察到的缺陷中⁶⁹.氧化应激导致FANCA公司和FANCG公司这表明范科尼贫血途径可能在检测细胞活性氧水平方面发挥作用，而不依赖于DNA损伤⁷⁰也许可以解释Fanconi贫血症细胞对氧张力的独特敏感性⁷¹.

关于DNA损伤如何以及为什么会导致活性氧产生，仍存在争议。如上所述，FOXO3A可能在激活ATM中起作用，相反，ATM可能通过诱导检查点激酶2促进抗氧化基因表达(CHK2（瑞士克朗）)-Foxos的依赖性磷酸化⁴⁹ATM缺乏细胞中ROS的另一个来源可能归因于DNA-损伤传感酶的活性聚（ADP-核糖）聚合酶1(第1部分). 这水解细胞溶质NAD⁺生成聚（ADP-核糖），该聚核糖与包括组蛋白和PARP1本身在内的靶蛋白结合⁷²ATM缺乏导致DNA双链断裂修复缺陷导致PARP1活性持续存在，用PARP1抑制剂治疗共济失调毛细血管扩张症患者的细胞可降低ROS水平⁷³NAD消耗⁺由于限制了细胞活性戊糖磷酸途径它利用NADPH制造谷胱甘肽，谷胱甘苷是一种关键的细胞抗氧化剂，尤其是在红细胞中⁷⁴.

红细胞生成和氧化应激

对上述小鼠模型的分析揭示了HSC中氧化应激感应途径和细胞周期机制之间的相互作用对动物的长期生存至关重要。然而，粗略地看一下ROS管理缺陷小鼠的表型^75,76或ROS调节酶（如谷胱甘肽）突变的人类S公司-转移酶-θ或NADPH-醌氧化还原酶揭示了衰老或急性应激（如失血）的生存反应^75–77或职业接触苯等化学品^78,79是红细胞性能的函数。红细胞对哺乳动物的生存能力很重要，不仅是因为它能以氧血红蛋白的形式将氧气输送到周围组织，而且还因为它的抗氧化能力。通过红细胞特异性膜阴离子通道从环境中摄取的过氧亚硝酸盐和超氧物被谷胱甘肽和其他抗氧化剂还原，这些抗氧化剂在红细胞中的表达水平特别高⁷⁴除了处理细胞外ROS外，红细胞还具有减少内源性ROS的能力，内源性ROS是由于日常任务（包括氧和铁的摄取、血红素生物合成和珠蛋白链失衡管理）而高水平产生的。特别是亚铁（Fe）的氧化²⁺)血红蛋白到铁（Fe^3个+)血红蛋白产生的超氧物和羟基自由基需要以其他哺乳动物细胞所无法比拟的规模进行猝灭。由于遗传性遗传缺陷，如将NADP转化为NADPH（谷胱甘肽还原所需）的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变，无法控制ROS的产生，导致红细胞寿命缩短，并在应激条件下导致危及生命的贫血⁸⁰红细胞也表达高水平的抗氧化剂，包括过氧化氢酶、过氧化物酶和SOD。有趣的是，FOXO3A在红细胞成熟过程中的定位和转录活性变得越来越核心⁵²FOXO3A对SOD2和过氧化氢酶的调节对红细胞生成的重要性表现为福克斯3a-无红细胞与成年红细胞数量和寿命的减少福克斯3a-无鼠标⁵²鉴于在红细胞成熟过程中抗氧化剂的表达受到严格调控，人们很容易推测ROS可能通过促进细胞周期阻滞在红细胞分化中发挥指导作用。

RB–E2F在氧化应激反应中的新作用

损失1卢比在红系系统中导致ROS增加，这可能是由于1卢比-零成红细胞下调转铁蛋白受体(CD71型)³¹，导致不稳定铁增加，可通过芬顿反应然而1卢比-无效红细胞生成是指分化成红细胞不能正确退出细胞周期^28,81在红系成熟期间，RB通过去磷酸化和E2F2型被特别上调^82,83RB主要存在于终末期红细胞中细胞周期调控基因启动子处的E2F2复合物中，E2F2的缺失恢复了细胞周期退出和成熟能力1卢比-无红细胞⁸³。这些结果表明1卢比-由于E2F2的活性被解除了调控，零成红细胞在终末成熟时有缺陷。E2F2与活性RB复合后，抑制E2f靶基因表达并促进细胞周期退出，但在缺乏RB时起到细胞周期激活剂的作用。这些研究揭示了转录因子E2f家族成员的一种新的组织限制性作用，并表明E2F2在红系成熟中的独特作用，而不仅仅是对参与细胞周期的经典E2f靶基因集的简单调节。然而，这种红细胞特异性功能的性质尚不清楚。

E2f靶基因表达的微阵列分析的一个新主题是与其他转录因子在调节已知和新的靶基因亚群方面的重叠(图3). 分析显示，目标基因之间存在显著重叠，这可能是最好的说明E2F4型和核呼吸因子1(NRF1级)其中，受E2F4调控的465个基因启动子和受NRF1（REF）调控的691个基因启动子中，有96个共同调控的基因启动子。84). NRF1是参与线粒体生物发生和氧化应激反应的核编码基因的关键调节器，包括呼吸链酶和转录因子a、线粒体(TFAM公司)⁸⁵TFAM调节线粒体功能所需的线粒体基因组编码的基因的表达，包括细胞色素的某些亚单位c氧化酶和ATP合成酶⁸⁵类似地，有几份报告确定了受以下因素共同调控的基因E2F1系列和低氧诱导因子（HIF），包括BNIP3号机组,巴西航空公司1血红素加氧酶与转录因子12月1日（参考文献^61,86,87). 因此，E2F2在红细胞生成中的独特作用可以通过其与参与红细胞分化的未知协同转录因子的相互作用来解释，类似于E2F1和E2F3与转录因子的限制性相互作用年1和TFE3型在其他设置中^88–90E2F2在分化红细胞中调节的靶基因类型有待进一步表征，但最近的研究表明1卢比-空红细胞的线粒体质量低于对照红细胞⁹¹提示RB在调节线粒体生物发生相关基因中的作用，如过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)辅活化剂1β（PGC-1β，也称为PPARGC1β)、NRF1和自然频率2然而，考虑到成红细胞在终末分化过程中通过一种称为有丝分裂的过程破坏线粒体，这种过程需要一种仅BH3的蛋白质的功能，即NIX公司^92,93，线粒体质量下降的另一种解释可能会被定义。特定阶段线粒体质量降低1卢比-零红细胞分化可能仅仅反映了细胞周期退出与有丝分裂的解耦，从而使有丝分裂正常进行（与细胞周期退出其他分化方面的解耦方式类似，例如珠蛋白基因表达），即使成熟的其他方面被阻止。或者，在CCND1号机组-空单元格⁹⁴指出RB途径在线粒体生物发生的调节中起着更直接的作用，如前所述，通过E2fs和NRF1对靶基因的协调调节⁸⁴或通过Cdks对NRF1活性的调节⁹⁴以及其他未定义的机制。

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图3

E2f转录因子与其他转录因子在氧化应激反应中的功能相互作用

除了传统的细胞周期调控靶基因外，E2fs还被报道与其他转录因子（如Foxos）在功能上相互作用¹⁷¹，低氧诱导因子1α（HIF-1α）⁸⁶，核因子κB（NFκB）¹⁷²，核呼吸因子1（NRF1）⁸⁴和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）¹⁰¹，调节对自噬的影响⁸⁶，新陈代谢⁸⁴，线粒体质量⁹¹和细胞的氧化还原反应⁸⁴这些活性与调节促凋亡基因的作用不同，但可能通过测定营养素、ATP、NAD的总体水平间接影响细胞的活性⁺和活性氧（ROS）。例如，E2F1与HIF合作诱导BNIP3表达⁸⁶促进线粒体自噬以应对缺氧，从而限制活性氧和坏死⁹⁶E2F1也被证明可以调节其他自噬调节因子的表达，如ATG1和ATG8（REF）。100). E2F1通过抑制由E2F1和NFκB亚单位之间的直接蛋白-蛋白质相互作用介导的NF-κB活性来调节细胞ROS水平RELA公司（参考。172). 多个反馈环在转录水平上运作，NFκB反馈以诱导HIF¹⁷³，和调节Foxo表达的E2Fs¹⁷¹通过诱导转录共激活物CITED2（REF。122). 在HIF和Foxos的上游，SIRT1脱乙酰酶对抗p300的活性，并依赖于可用的NAD⁺其激活Foxos的能力、促进RB营业额的能力¹¹⁴及其与过氧化物酶体增殖物激活受体γ、共激活因子1α（PGC-1α）的下游相互作用和激活^117,118.

线粒体质量的调节是对缺氧和氧化应激的关键反应⁹⁵如前所述，线粒体是细胞内活性氧的主要来源，在氧化磷酸化和电子传递被破坏的条件下，减小细胞内线粒体网的大小，以限制活性氧的生成^96,97从而促进细胞完整性和存活。特别是，缺氧已被证明能通过自噬体诱导线粒体的摄取，自噬体能在与溶酶体融合后翻转⁹⁶有人认为，除了在缺氧条件下限制活性氧的生成外，这一过程还可能选择性地清除细胞中“受损”的线粒体（例如，脂质膜氧化的线粒体）⁹⁷尽管这种选择性的基础尚不清楚。BNIP3是缺氧诱导自噬的HIF靶基因^86,98据报道，通过滴定BCL2对自噬调节器的抑制活性来促进自噬贝克林1（参考。96). 如前所述，BNIP3由RB、E2F和HIF转录调控，因此E2F1与HIF1α协同激活BNIP3，而RB抑制HIF对BNIP3的诱导⁸⁶.BNIP3也由FOXO3A直接调节⁹⁹这可能解释了在骨骼肌和心肌中观察到的BNIP3的低氧依赖性表达^98,99E2F1也参与了自动液位计1和自动液位计8编码基本自噬机制的关键成分¹⁰⁰除了诱导线粒体吞噬外，氧化应激还抑制线粒体的生物生成⁹⁵HIF-依赖性抑制MYC活性导致抑制前列腺素C-1β、 MYC靶基因⁸⁵PGC-1α的影响(PPARGC1α)线粒体质量上的PGC-1β部分通过与NRF1和NRF2基因的共同激活介导，如TFAM公司以及呼吸链亚单位⁸⁵有趣的是，RB–E2F活性已被证明可调节脂肪组织中PGC-1α及其辅因子PPARγ的表达和活性^101–103，尽管这种相互作用对线粒体生物发生的意义尚未探索。因此，通过与其他转录因子的协同作用，RB–E2f似乎间接调节细胞线粒体质量，进而调节活性氧水平(图3). 这可能对理解线粒体数量如何与细胞周期相协调具有重要意义，但也如本文所强调的，对于细胞如何在细胞周期进展和代谢方面对氧化应激作出反应具有重要意义。

活性氧对RB水平和活性的调节

除了通过诱导INK4A调节RB活性外^50,54，ROS激活PP2A，促进RB对氧化应激的去磷酸化反应^12,104,105.活性氧活化PP2A需要钙²⁺PP2A的PR70亚单位活性动员¹⁰⁵因此，ROS通过两种机制诱导RB的去磷酸化和活化：抑制Cdks和活化PP2A。

RB水平也与细胞的氧化还原状态有关¹⁰⁶，尽管这个联系的机械基础还不清楚。蛋白质降解的调节是细胞在不同生长条件下调节细胞周期检查点的主要机制¹⁰⁷例如，与RB在结构和功能上相关的p130口袋蛋白在正常细胞周期进程中通过蛋白水解调节¹⁰⁸p130的降解受SKP2的相互作用调节，SKP2是SKP1–cullin–F box（SCF）泛素连接酶复合物的底物识别成分，与SCF调节的p27（REF）降解类似。109). 有趣的是，SCF对p27的降解受到RB的负调控¹⁰⁹主动RB和CDH1型APC亚单位促进APC介导的SKP2降解（REF。110). 与p130和p27相比，RB在正常细胞周期中本身并不降解¹⁰⁸尽管，如下文所述，分化和衰老过程中的氧化还原应激已成为RB水平的可能调节剂。

RB的乙酰化似乎对调节其周转至关重要。RB被乙酰化第300页赖氨酸873和874，这通过Cdks阻止其磷酸化并抑制RB降解^112,113相反，SIRT1公司（以前称为SIR2α）也被报道为RB的有效脱乙酰酶¹¹⁴.SIRT1是NAD⁺-已知调节p53水平的依赖性脱乙酰酶^115,116并调节Foxos和PGC-1α的活性^49,117,118(图3). 值得注意的是，SIRT1与p300/CBP相关因子相互作用(PCAF公司)–MYOD1年抑制肌肉分化的复合物¹¹⁹而RB通过与PCAF的相互作用促进肌肉分化¹²⁰此外，缺氧阻碍了肌肉分化过程中RB水平的诱导¹²¹提示SIRT1通过促进RB的转换来抑制肌肉分化以应对氧化还原应激。或者，缺氧可能通过诱导转录辅激活物抑制RB的乙酰化引用2，一种FOXO3A和HIF靶基因，直接与p300结合以抑制其活性¹²².缺氧已被证明可以调节造血干细胞在骨髓生态位中的位置¹²³并促进HSC和神经干细胞的扩张^124,125尽管这与HIF1α完全激活干细胞扩增和更新所需的Notch靶基因的要求有关¹²⁵研究低氧和活性氧对干细胞RB水平的影响也很有趣。

最后，塞拉丁是ROS诱导的细胞p53蛋白水平的调节剂，与p53直接相互作用，以防止E3泛素连接酶将其靶向MDM2型用于降解¹¹¹有人认为，塞拉丁也可能对Ras活化诱导的ROS起稳定RB水平的作用¹¹¹.

其他系统中的RB和ROS

本综述侧重于活性氧在造血系统中调节RB通路的作用，但有各种研究支持RB通路在其他细胞系统中对活性氧的反应中的作用。例如，活化的Ras癌基因诱导细胞衰老依赖于ROS¹²⁶，关于DNA损伤响应^127,128和功能性RB诱导细胞周期阻滞¹²⁹.Ras诱导的ROS生成被Nox抑制剂阻断，并且两者都是NOX1（氮氧化物1）和氮氧化物4被上调以应对人力资源管理系统激活¹³⁰与造血系统相似⁵⁴，p38也是Ras诱导肿瘤细胞ROS信号的关键介导者¹³⁰但是，与原发性HSC相比，许多肿瘤细胞因INK4A或RB而被删除或突变，因此，Ras诱导的ROS激活p38常常导致细胞凋亡¹³⁰，可能由BCL2的磷酸化和失活介导（参考。55).

RB通路的完整性也被确定为预测原发性人类乳腺癌进展的应激反应的关键因素^131,132高INK4A水平与高Ki67号机组导管癌处就地乳腺癌分期是肿瘤进展为浸润性癌的有力指标¹³¹同样，高水平的环氧合酶2（COX2，PTGS2型)结合高Ki67染色预测乳腺癌进展。值得注意的是，COX2对促炎细胞因子和细菌脂多糖的转录激活是通过ROS诱导的p38活性介导的^133–135COX2表达诱导INK4A表达，COX2诱导细胞周期阻滞的能力依赖于功能性RB¹³¹因此，这些研究表明ROS生成、p38激活、COX2和INK4A诱导与RB依赖性细胞周期阻滞有关(图2)正反馈回路在癌症中被破坏，导致COX2和INK4A表达增加，但持续增殖。

RB通路失活是人类癌症中的常见事件^4,132和RB1型-缺陷细胞优先对DNA损伤剂敏感，例如顺铂和依托泊苷，与对照细胞相比^1,三.的灵敏度RB1型-细胞对基因毒剂的缺乏与活性氧增加、PARP1活性和NAD增加有关⁺导致坏死细胞死亡的耗竭（H.Liu、J.R.Knabb、B.T.Spike和K.F.M，未发表的数据）。癌细胞通常比正常细胞具有更高的活性氧水平，这在很大程度上是因为癌细胞的增殖和代谢率增加，以及癌基因的活性，如Ras¹³⁶用于治疗癌症的基因毒剂可诱导活性氧（ROS）作为其形式的一部分，抑制肿瘤细胞中的抗氧化活性可进一步使其对药物诱导的坏死细胞死亡敏感¹³⁷因此，尽管活性氧可能通过DNA的氧化碱损伤和信号通路的破坏在癌症的发生中发挥作用，但它们也为靶向肿瘤细胞提供了新的途径。

总结

癌症在很大程度上是易感动物生殖后的一种疾病，因此，肿瘤抑制基因很可能是作为应激反应机制的介质进化而来的，而不是肿瘤抑制剂本身。鉴于其在细胞周期检查点控制中的中心功能，最初令人惊讶的是1卢比对胚胎发育的影响如此有限，但如果RB功能与p53相似，只有在应激条件下才变得至关重要，这可能是可以解释的。本综述强调了RB在氧化应激反应中的作用，主要基于造血系统的工作，但引入了其他系统的相关分析。人们越来越认识到RB途径对细胞周期的调节在多大程度上与细胞代谢率、ROS水平和线粒体质量相耦合。在正常情况下，这可能使细胞将线粒体生物发生与细胞周期整合，并将增殖与有利水平的代谢物联系起来，ROS在这一过程中充当关键的信号中间体。鉴于血清生长因子和DNA损伤在调节RB途径和细胞周期中的公认作用，细胞也会进化出将增殖与代谢物和ROS水平传感器耦合的机制，这一点并不奇怪。通过ROS诱导的INK4A表达和RB蛋白稳定性和活性的改变，RB通路对细胞内和细胞外环境氧化状态的敏感性是对这一重要肿瘤抑制剂功能的一个新的生理学意义上的观点。重要的是，这些发现表明缺乏完整RB通路的肿瘤细胞可能容易被靶向代谢或诱导ROS的药物杀死。

致谢

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