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自然结构分子生物学。作者手稿；PMC 2010年11月19日提供。
以最终编辑形式发布为：
自然结构分子生物学。2009年10月；16(10): 1016–1020.
2009年8月27日在线发布。 数字对象标识：10.1038/nsb.1675年10月10日
预防性维修识别码：项目经理2988485
EMSID:英国标准31550
PMID：19713957

LIN-28和聚（U）聚合酶PUP-2调节let-7microRNA处理秀丽隐杆线虫

尼古拉斯·莱尔巴赫,1,2,* 哈维尔·阿米森,1,2,* 海伦·L·莱特福特,1,三 肯尼斯·穆菲特,1 安东尼·布戈特,三 Shankar Balasubramanian阶,三和埃里克·米斯卡1,2
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

这个let-7微小RNA（miRNA）是一种超保守的干细胞分化和发育时间调节因子，也是一种候选的肿瘤抑制因子。这里我们显示LIN-28和聚（U）聚合酶PUP-2调节let-7中的处理秀丽线虫。我们证明了这一点第28行有必要且足以阻止let-7活动体内; LIN-28直接结合let-7pre-miRNA以阻止Dicer加工。此外，我们还鉴定了一种聚（U）聚合酶PUP-2，它调节LIN-28阻断的稳定性let-7前miRNA，并有助于第28行依赖性调节let-7在开发过程中。我们证明PUP-2和LIN-28直接相互作用，LIN-28刺激let-7PUP-2前miRNA在体外。我们的结果表明LIN-28和let-7形成一个古老的调节开关，从线虫到人类都是保守的，并深入了解LIN-28的作用机制体内PUP-2直系血型的尿基化可能调节let-7以及其他物种中的额外miRNAs。考虑到Lin28和let-7在干细胞和癌症生物学中，我们认为这种聚合酶是潜在的治疗靶点。

小RNA调节包括植物、动物和真菌在内的许多真核生物的基因表达。miRNAs是内源性短RNA，通过阻断翻译和/或破坏靶mRNA的稳定性来调节基因表达1,2在动物体内，miRNAs转录为长前体（pri-miRNAs），在细胞核中由RNase III酶复合物Drosha-Pasha/DGCR8处理以形成~80 nt前miRNAs，或直接从内含子衍生而来三前miRNAs从细胞核输出，由RNase III酶Dicer处理，并并入含精氨酸的RNA诱导沉默复合物（RISC）。第一批确定的miRNAs秀丽线虫基因线-4和let-7，控制幼虫发育期间的细胞命运4。当线-4或let-7被灭活后，特定的上皮细胞无法分化并进行额外的分裂。线-4在幼虫早期发育过程中起作用，调节第14行和第28行mRNA4,5,6,7,8.let-7在幼虫发育后期发挥作用，调节林-41，hbl-1，daf-12和第4阶段mRNA9,10,11,12因此，必须严格控制这些miRNA的出现时间。在秀丽线虫和其他动物的表达let-7发育受到调控，但这种调控的机制尚不清楚13最近发现了特定miRNAs的转录后调控14.let-7Lin28在Drosha或15,16或Dicer17,18哺乳动物细胞培养中的步骤。Lin28是一种保守的RNA结合蛋白，在哺乳动物中控制干细胞谱系并抑制let-7miRNA处理在体外15,16,17,18,19然而，机制和体内这项活动的意义尚不清楚。

结果

安体内let-7 miRNA功能检测揭示发育调控

研究miRNA的作用机制体内，我们基于let-7在里面秀丽线虫(图1a、b和补充方法). 我们产生了两个包含以下启动子的转基因肌氨酸-2、GFP或mCherry的编码序列以及两者的3′UTR林-41或unc-54号机组(myo-2:：gfp:：lin-41和myo-2:：mcherry:：unc-54; 以下简称let-7传感器;图1a). 这个肌氨酸-2启动子只在咽肌中表达C.秀丽20、和林-41是基因识别的目标let-7微小RNA9，而unc-54号机组已知3′UTR不受任何miRNA的调控。转基因动物携带染色体内的let-7传感器在幼虫发育过程中，GFP和mCherry均强烈表达(图1c). 正如所料，一个表达let-7(肌-2：：let-7)沉默的GFP，但不是mCherry(图1d). 令人惊讶的是，这种效应是在发育过程中调节的；成虫对GFP的抑制作用明显强于L1幼虫(图1d). 作为let-7转基因不含let-7启动子，这种调节必须发生在转录后。除了使用显微镜对荧光蛋白表达进行定性分析外，我们还量化了let-7传感器采用全动物流式细胞术。我们使用COPAS Biosort仪器定量了数千只处于不同发育阶段的个体动物沿着身体轴的GFP和mCherry表达。let-7传感器沉默在L1幼虫期效率最低，在L3幼虫期效率最高(补充方法和补充图1). 这与let-7，在L3阶段开始积累21由于let-7是由一个在所有阶段都活跃的启动子驱动的，但只在后期幼虫阶段才表现出活跃，这些数据可能反映了转录后调节的机制let-7在开发过程中。

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定量分析揭示了let-7miRNA依据林-28

（a、b）基于咽的let-7活动。（c）携带let-7传感器在L1幼虫和成虫阶段转基因。GFP和mCherry均强烈表达。

d日携带let-7传感器和肌-2：：let-7L1幼虫和成虫阶段的转基因。GFP在成虫中特异且强烈下调，但在L1幼虫中没有下调。比例尺显示20μm。

e（电子）荧光图像显示第28行突变体下调let-7传感器a中L1阶段的GFP肌-2：：let-7依赖时尚。这种效果在第46行突变背景。比例尺显示20μm。

如果荧光图像显示myo-2:：lin-28:：unc-54转基因足以阻断let-7成人携带活动let-7传感器和肌-2：：let-7转基因。比例尺显示20μm。

LIN-28调节pre-let-7处理

接下来，我们进行了正向遗传和RNAi筛选，以确定调节因子let-7活动体内.拆除第28行通过RNAi以依赖于myo-2:：let-7转基因(补充图2a、b和数据未显示）。我们使用第28行功能丧失突变体(图1e和数据未显示）。中的突变林-46完全抑制第28行突变体22，但不恢复对let-7(图1e). 因此，解除对let-7中的活动第28行突变体不是发育时间缺陷的间接结果。其他异慢性基因，包括第14行和林-42不影响let-7传感器(补充图2c和数据未显示）。接下来，我们测试了LIN-28是否足以抑制第7列活动。染色体外阵列中LIN-28在咽部的异位表达导致抑制let-7在正常情况下不表达LIN-28的成年人中8(图1f). 咽内染色体外阵列的镶嵌表达表明LIN-28对细胞具有自主作用。我们得出结论，LIN-28是必需的，足以抑制let-7中的活动秀丽线虫.

然后我们使用miRNA微阵列和northern印迹证实LIN-28调节内源性let-7L2幼虫的积累(补充数据1;补充图3)23此外，其他let-7家庭成员没有增加第28行突变体，而三个不相关的miRNA，包括发育调控的miRNA miR-85，在林-28突变体L2s(补充图3a、b).

林28是否调节let-7在Drosha加工15,16或Dicer17,18哺乳动物细胞中的步骤尚未解决。我们解决了这个问题体内在里面秀丽线虫我们使用northern blotting和qRT-PCR来比较let-7以及来自肌-2：：let-7其他野生型转基因和第28行突变体L2幼虫。第28行突变体表达较高水平的let-7与野生型相比，加工效率提高；同时，预处理水平略有下降-let-7，pri没有变化-let-7水平；这些数据与Dicer-mediated处理效率的提高相一致(补充图3c、d). 我们对内源性let-7，尽管pri水平-let-7减少了第28行突变体，表明对let-7发起人(补充图3e、f). 有趣的是，miR-85似乎也在Dicer步骤中受调控第28行-依赖时尚(补充图3b，g). 与这些发现一致，功能性LIN-28-GFP翻译融合位于细胞质中8(补充图4a和数据未显示）。综上所述，这些数据表明LIN-28阻断了Dicer介导的let-7可能还有其他发育调控的miRNAs。

接下来，我们测试了LIN-28是否与pre直接交互-let-7。我们使用链霉亲和素珠和生物素化前体-7进行了下拉分析。来自转基因蠕虫提取物的LIN-28-GFP保留在链霉亲和素珠上，如果合成的-let-7RNA是生物素化的，但没有使用非生物素化的对照(补充图4b). 我们通过天然凝胶迁移率变化分析测试了这种相互作用是否是直接的。预（pre）-let-7和GST-LIN-28与估计的K相互作用d日第页，共2页μM（M）(补充图4c和数据未显示）。我们得出结论，LIN-28结合前体-let-7以防止Dicer处理。哺乳动物细胞实验表明-let-7与Lin28交互需要发夹15,24然而，预处理-第7列循环在中不守恒秀丽线虫因此，我们测试了一些预处理-let-7环突变体体内使用let-7传感器我们发现-let-7正常发育调节不需要looplet-7活动（请参见补充方法和补充图5).

PUP-2调节预-let-7在中进行处理林-28依赖时尚

到目前为止，我们的结果与LIN-28阻断前-let-7处理，但我们感到困惑的是-let-7与野生型相比，L2幼虫的积累差异不大第28行突变动物(补充图3). 我们推断LIN-28可能针对pre-第7列用于降解。Kim和同事最近的工作表明，Lin28促进了-let-7哺乳动物细胞系中的尿苷酰化和随后的降解，尽管所涉及的酶尚不清楚18。我们检查了已发布的高通量测序数据秀丽线虫小RNA文库25,26，发现频繁修改的3′端let-7*含有1或2个未模板化尿嘧啶残基(秀丽线虫let-7位于发夹的5′臂上；图2a). 这些物种可能来自Dicer对部分尿苷化中间体的加工，并表明体内尿苷化let-7因此，我们对15种潜在的聚（U）聚合酶进行了RNAi筛选(补充表1)化验let-7和预-let-7丰度肌-2：：let-7转基因L2幼虫。RNAi对抗幼犬-2导致预处理增加-let-7水平(图2b，c;P（P）= 7.5 × 10−5)成熟期略有但显著增加let-7水平(图2b、d;P（P）= 0.029). 此效果特定于幼犬-2，没有其他聚（U）聚合酶，包括cid-1型，一个潜在的旁白，有这样的效果27(图2c、d). 这些数据表明PUP-2尿苷化作用靶点为-let-7用于降解，并需要最大限度地有效封锁let-7由LIN-28处理。我们推断，LIN-28可能针对pre的尿苷化-let-7PUP-2导致尿苷化前体降解-let-7和LIN-28/pre营业额-第7列确保LIN-28的高效功能。我们检查了幼犬-2RNAi在预先-let-7从LIN-28 bockade中释放。影响幼犬-2前期和成熟期的RNAilet-7级别在L4阶段取消(图2c、d P（P）= 1 × 10−5和P（P）分别为0.01）。此外，暴露于二者的L2幼虫幼犬-2和第28行RNAi显示前体蛋白的积累显著减少-let-7(图2c P（P）= 0.0003). 这些影响不是由于RNAi减少幼犬-2(补充图6a). 相反第28行成熟时的RNAilet-7中的级别未更改林-28，幼犬-2双RNAi L2幼虫(图2d P（P）= 0.2). 从这些数据中我们得出结论，PUP-2转录后调节let-7以依赖LIN-28的方式。

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幼犬-2调节let-7在中进行处理林-28-依赖时尚

一 let-7尿苷化体内.未修改和修改的频率let-7*通过高通量测序鉴定的分子。

b条代表性北方印迹显示幼犬-2-pre的依赖性调节-let-7. 5μg来自对照组的总RNA，第28行（RNAi），以及幼崽-2（RNAi）肌-2：：let-7L2幼虫被装载。U6被用作加载控制。

c（c）,d日相对预处理的量化-let-7(c（c）)、和let-7(d日)丰度第28行（RNAi），幼犬-2（RNAi）和cid-1型（RNAi）肌-2：：let-7来自北方印迹实验的L2和L4幼虫。显示了相对于空矢量控制样本的平均倍数变化。P（P）-学生的价值观t吨-指示的测试；n个= 4. 误差条显示平均值的标准误差。

e（电子）显示焊缝细胞缺陷的荧光图像幼犬-2（RNAi）成年人。DLG-1-mCherry融合标志着焊缝细胞边界。上面板；具有连续煤层的野生型。下面板；幼犬-2（RNAi）焊缝未完全熔合。箭头表示融合失败的部位。比例尺显示20μm。

PUP-2有助于LIN-28依赖性调节let-7在开发过程中

接下来，我们试图确定是否需要PUP-2来调节let-7在开发过程中。调节不当let-7导致幼虫发育时间发生改变，形成成人特异性外侧翼所需的皮下干细胞系分化缺陷4和外阴形态发生缺陷21在野生型成人中，侧缝细胞分化并融合为合胞体，但如果幼犬-2或第28行被击倒，与调节作用一致let-7(图2e,补充表2).幼犬-2RNA干扰第28行空突变背景不会增加seam细胞融合缺陷，表明这种活性幼犬-2是第28行从属的(表1). 接下来我们测试了幼犬-2与基因相互作用let-7.let-7(编号2853ts）动物数量减少第7列表达与温度敏感性外阴破裂21.在15°C时，外阴破裂let-7(编号2853ts）动物被抑制幼犬-2RNAi，而第28行RNAi抑制15°C和20°C下的外阴破裂(表1). 更弱的抑制let-7（n2853ts）通过幼犬-2与相比第28行与的角色一致幼崽-2作为一个第28行修改器。加上幼犬-2在let-7这些数据表明幼犬-2确保高效的活动第28行通过瞄准被封锁的pre-let-7破坏分子。这可能是通过PUP-2的LIN-28依赖性尿苷酰转移酶活性在-let-7; 我们试图验证这个假设在体外.

表1

遗传相互作用幼犬-2和第28行具有let-7在外阴发育中

基因型%20°C时爆裂(n个)%15°C时爆裂(n个)
let-7(编号2853);空载体RNAi97 (119)47 (86)
let-7(编号2853); 第28行（RNAi）16 (115)0 (28)
let-7(编号2853); 幼犬-2（RNAi）97 (120)28 (114)

通过喂食进行RNAi。

PUP-2尿酸酯前体-let-7以依赖LIN-28的方式在体外

我们在HEK293T人胚胎肾细胞系中表达了HA-FLAG标记的PUP-2和SBP标记的LIN-28。使用特异性共沉淀SBP-LIN-28的抗FLAG抗体免疫沉淀HA-FLAG-PUP2(图3a). 这种互动是缺乏的秀丽线虫预-让-7和可能直接。事实上，添加过量的外源性前体-让-7对细胞提取物没有增强相互作用。我们还在GST下拉实验中证实了这种相互作用。体外翻译后的PUP-2直接与GST-LIN-28交互(图3b). PUP-2先前被证明能在爪蟾卵母细胞，但在没有栓系的情况下处于非活动状态27因此，我们测试了LIN-28是否能够招募PUP-2来调节预处理-let-7尿苷化(图3c). 我们将表达HA-FLAG-PUP2和/或SBP-LIN-28的细胞提取物中的抗FLAG免疫沉淀物与放射性标记的前体-let-7和放射性标记的UTP。我们发现HA-FLAG-PUP2尿苷化前体-let-7仅在SBP-LIN-28在场的情况下(图3c). 我们还证实了前体细胞的LIN-28依赖性尿苷化-let-7通过PUP-2在体外(补充图6b). 最后，我们试图确定体内尿苷化前体-let-7我们得出结论，尿苷化前体蛋白的快速降解-let-7防止这些物种的积累体内正如在人类细胞系中所假设的那样18.

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LIN-28与PUP-2相互作用并促进前体的尿苷化-let-7通过PUP-2

一在HEK293T细胞中表达PUP-2和LIN-28的共免疫沉淀。

b条GST下拉试验证明GST-LIN-28和PUP-2直接相互作用在体外.

c（c） 体外尿苷酰化试验表明PUP-2尿苷酸预处理-let-7以依赖LIN-28的方式。

讨论

我们开发了一种定量分析第7列miRNA功能秀丽线虫该分析方法灵敏度高，适合高通量实验。我们利用该试验通过诱变筛选，在已知的miRNA通路成分中分离出新的突变体；对新的miRNA功能缺陷突变体的分析将为miRNA机制提供见解。此外，可以修改该分析以研究其他miRNA的转录后调节或靶向特异性。

这里我们证明LIN-28调节秀丽线虫预（pre）-let-7（请参见补充图7a对于模型）。这些结果为两者之间的遗传联系提供了分子基础第28行和let-7在控制发育时机方面。在秀丽线虫这一途径决定了上皮干细胞的行为。在哺乳动物中，let-7和Lin28可能调节原始生殖细胞分化和其他干细胞谱系28因此，结构RNA（pre-let-7）与蛋白质（Lin28）的特异性相互作用构成了调节干细胞分化的超保守开关。let-7/lin-28开关可能与let-7本身一样保守。例如，pre-let-7处理在海胆中受到发育调控紫斑圆线虫13，它还表示Lin28直系亲属（数据未显示）。

我们发现pre-let-7的末端环路对LIN-28的调节是不必要的，这与之前的两项研究不一致15,16，但与Rybak进行的竞争实验一致等。17我们的方法是评估let-7功能体内，而之前的工作基于在体外交互作用研究。全部22个成熟核苷酸第7列在双壁中保守，而对于许多其他miRNAs，只有“种子”序列（核苷酸2-8）似乎受到进化约束。相反，在let-7在不同的物种中。因此，人们很容易推测成熟的核苷酸let-7有助于LIN-28的认可。类似的RNA-蛋白质相互作用可能会对其他超保守miRNAs的序列施加进化约束。

这里我们显示LIN-28招募聚（U）聚合酶PUP-2到尿酸盐秀丽线虫预-let-7。我们推测哺乳动物PUP-2同源基因可能同样调节let-7在干细胞中(补充图7b). 事实上，小鼠Tut4/Zcchc11尿苷酰转移酶调节胚胎干细胞中的let-729let-7是一种候选的肿瘤抑制剂21,30,31,32LIN28是一种潜在的原蛋白28,33因此，TUT4/ZCCHC11可能是抗癌治疗的重要新靶点。我们的数据表明，miRNA是通过前miRNA的隔离和尿苷酰化依赖的前miRNA降解来调节的。这种情况似乎类似于通过隔离和靶向降解两步调节蛋白质活性，例如钙粘附素34先前已观察到尿基化依赖的RNA降解，U型尾已被证明可招募5′至3′或3′至5′核酸外切酶35,36高通量测序表明，额外的miRNA和/或前miRNA受到尿苷化作用的影响（数据未显示），因此这种调控可能广泛存在。进一步揭示这一途径的潜在机制将引起人们的极大兴趣。

补充材料

补充信息该信息以整理过的PDF文件提供，包括补充表格和图表，以及2个单独的XLS数据文件。

1

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2

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三

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致谢

我们感谢Andrea Hutterer（英国剑桥大学韦尔科姆信托癌症研究所英国古顿研究所），他携带mj第15页转基因，Mark Jackman（英国剑桥大学Wellcome Trust癌症研究所英国Gurdon Institute，Cambridge）研究pDEST-MAL，pcDNA5/FRT/TO_GATEWAY_TEV_SBP和pDEST-3FLAG 3HA载体，Eric Moss（新泽西医学和牙科大学，NJ）研究抗LIN-28抗体，和Marv Wickens（马萨诸塞州威斯康星大学生物化学系），获取PUP-2 cDNA。我们感谢Richard Gregory和Narry Kim分享未公开的数据。N.J.L.和K.J.M.获得了Wellcome Trust（英国）的博士学位。J.A.和A.B.得到了生物技术和生物科学研究委员会（英国）的资助。H.L.L.得到了英国癌症研究所博士学位的支持。这项工作得到了英国肿瘤研究计划对E.a.M.和S.B.的资助，以及英国威康信托和癌症研究所对威康信托/英国古顿癌症研究所的核心资助。

附录

联机方法

线虫培养和菌株

我们成长了秀丽线虫在20°C的标准条件下37.使用的食物来源是大肠杆菌应变HB101(隐杆线虫病美国明尼苏达州双子城明尼苏打大学遗传中心）。我们使用漂白和饥饿诱导的L1阻滞来生成同步培养物。野生型菌株为变种Bristol N238使用的其他菌株列于补充表3.

DNA构建与转基因

我们使用多位点网关三片段载体构建试剂盒（Invitrogen；补充数据2). 我们使用PCR和诱变引物进行定点突变(补充数据2). 所有结构均通过测序确认。为了产生转基因动物，我们进行了种系转化，如前所述39.含有2-10 ngμl的注射混合物−1向量，5-10 ngμl−1标记物和Invitrogen 1 kb梯形图，最终浓度为100 ngμl−1DNA（参见补充方法详细信息）。如前所述，我们通过X射线照射整合阵列转基因40我们通过转座酶介导的整合（mosSCI）产生单拷贝转基因41.

显微镜

我们使用标准方法进行了差分干涉对比度（DIC）和荧光成像42并使用AxioImager A1立式显微镜（Zeiss，Jena，Germany）。我们使用ORCA-ER数字相机（日本滨松市滨松县）拍摄图像，并使用OpenLabs 4.0软件（英国考文垂市Improvision）处理图像。用于分析let-7传感器转基因表达，我们在相同条件下对所有动物进行成像。我们使用奥林巴斯FluoView FV1000立式显微镜进行共聚焦显微镜检查，使用63倍物镜放大率。

COPAS生物分选仪分析

我们使用COPAS Biosort仪器（Union Biometrica，Holliston，MA，USA）同时测量长度（飞行时间）、吸光度（消光）和荧光。我们优化了荧光检测以同时检测GFP和mCherry。我们使用多线固态氩激光器进行激发（488nm GFP和561nm mCherry），并在通过带通滤波器（510/23nm GFP与615/45nm mCherly）后通过适当的PMT检测发射。我们从盘子里采集动物，并在M9缓冲液中清洗37排序之前。我们使用同步野生型种群测定了每个幼虫阶段的长度和吸光度。然后，我们生成了从混合种群中分离特定发育阶段动物的门(补充图1a).

RNA干扰分析

我们从全基因组RNAi文库中获得了RNAi克隆43,44,45。我们通过将适当的基因组DNA片段亚克隆到pDEST-L4440中，生成了额外的RNAi构建物45,46(补充数据2). 我们通过测序确认了所有RNAi结构。对于使用的实验let-7传感器和肌-2：：let-7我们通过使用eri-1型(镁366)RNAi超敏遗传背景47为了进行COPAS Biosort分析，我们将10-50个L1幼虫接种在90 mm RNAi平板上，并在最老的后代达到L3幼虫阶段后对动物进行分析。对于收获和RNA提取，我们在每个RNAi板上电镀约3000个L1幼虫，并在漂白之前将动物培养至成年。在通过饥饿进行同步化后，我们将后代放在新鲜的RNAi平板上，并在收获前生长到所需的阶段。如前所述，我们通过注射进行RNAi48我们分析了注射后24-48小时所产后代的表型。

缝细胞发育的表型分析

我们通过注射携带缝细胞标记转基因的菌株进行RNAi第51周和mj第15页.

外阴破裂试验

let-7(编号2853ts）胚胎通过漂白妊娠成虫添加到RNAi平板中，并在15°C下生长。然后将未爆炸的成虫转移到新鲜的RNAi平板上，并根据需要进行温度变换。将L4子代采集到新鲜RNAi平板上（每个平板15-25只动物），48小时后对外阴破裂进行评分。

RNA提取

为了提取总RNA，我们用M9从盘子中采集动物37我们在液氮中造粒并冷冻动物，在10体积的Trizol试剂中溶解颗粒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。我们根据制造商的方案从Trizol试剂中提取总RNA。

miRNA显微放射分析

如前所述，我们使用定制的DNA寡核苷酸阵列执行miRNA微阵列49,50数据分析如所述50比较野生型和第28行我们用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离了突变体L2幼虫，并将其从同步化动物中选择的总RNA大小定为18-26nt。使用T4 RNA连接酶对小RNA部分进行3′末端标记（英国约克发酵厂）。秀丽线虫miRNA微阵列基于miRbase 8.0版51,52。我们分三次进行所有实验。有关微阵列探针信息和主要微阵列数据，请参阅补充数据1.

Northern印迹

我们按照描述进行了northern blotting25,53，进行了以下修改。我们使用了5-20μg总RNA或小RNA部分（miRvana，Ambion），从200μg总RNA。用于发育表达谱(补充图3a)我们在60°C下进行了2小时的1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]氯化碳（EDC，Perbio Science，Erembodegem，Belgium）交联反应。否则，斑点是紫外线交联的。我们将北方杂交改良如下：；膜在40°C下在杂交缓冲液（0.36 M Na）中预杂交4小时2高性能操作4，0.14 M NaH2人事军官4，7%（v/v）SDS和1 mg剪切变性鲑鱼精子DNA），并在40°C下用20μmoleγ-32P-ATP放射性标记DNA寡核苷酸探针(补充数据2). 杂交后，我们用0.5xSSC、0.1%（v/v）SDS在40°C下清洗两次膜10分钟，用0.1xSSC和0.1%（v/v）DSS在40℃下清洗一次膜5分钟。我们使用磷光成像仪（英国阿默沙姆GE Healthcare）检测放射性。我们使用ImageQuant软件（GE Healthcare）量化了频带强度。

实时RT-PCR

我们按照说明进行了RT-PCR25，采用标准曲线法。使用的底漆列于补充数据2.

预（pre）-let-7下拉

在这些实验中，我们产生了一种携带救援物的应变林-28:：gfp翻译融合转基因（mosSCI集成）第28行(编号719)突变背景。我们从饥饿同步的L1幼虫中制备蛋白质提取物。我们在4°C的PD缓冲液[18 mM HEPES-KOH pH 7.9，10%（v/v）甘油，40 mM KCl，2 mM MgCl中清除链球菌抗假丝酵母菌素Dynabeads（Invitrogen）的裂解物30分钟2，10 mM DTT，100μ硫酸锌4，1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒（PIC；罗氏）]。动力珠被15μ添加100 pmol合成5′生物素化前体前，在PD缓冲液中4°C条件下g酵母tRNA 1小时-let-7（Microsynth，Balgach，Switzerland），用于下拉或未经修改的合成预处理-let-7用于对照反应，并在室温下培养1小时。我们在结合反应中加入预先封闭的Dynabeads，并在室温下培养1小时。我们在PD缓冲液中洗了三次珠子。我们使用初级小鼠抗GFP（Clontech JL-8；1:1000）和次级HRP结合抗小鼠（Dakocytomation P0450；1:10000），或大鼠抗微管蛋白（Chemicon international MAB1684，1:1000）以及次级HRP接合小鼠抗大鼠（GE Healthcare NA9310；1:10000。

重组蛋白表达

我们从ORFeome文库中获得了LIN-28 cDNA（F02E9.2b）45.我们将cDNA亚克隆到pDEST-GEX-2TK（插入pGEX-2TK中SmaI位点的网关盒）或pDEST-MAL中。我们表达并纯化了所述的重组蛋白25,54.

GST下拉

我们使用pDEST14（Invitrogen）中的PUP-2 cDNA生成35S-蛋氨酸标记蛋白在体外使用TNT T7偶联网织红细胞裂解试剂盒（Promega）进行转录-翻译。如前所述，我们使用GST-LIN-28进行下拉54.

预处理-let-7转录

我们表演了在体外20卷的转录反应μl每个NTP 0.5 mM，40 mM Tris pH 7.9，12 mM MgCl2、2 mM亚精胺、20 mM DTT、1 mM NaCl、100 U T7 RNA聚合酶（瑞士巴塞尔罗氏）和1U RNasin（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。在苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀之前，我们在37°C下培养反应1小时。我们转录了放射性标记RNA，用于电泳迁移率变化分析α-32P-UTP的比活度约为6000 cpm/fmol。

免疫沉淀

我们将LIN-28 cDNA克隆到pcDNA5/FRT/TO_GATEWAY_TEV_SBP中。我们将PUP-2 cDNA克隆到pDEST-3FLAG 3HA中。如前所述，我们进行了免疫反应分析18简单地说，我们用pHA-FLAG-PUP-2和/或pLIN-28-SBP转染HEK293T细胞。48h后，我们在冷裂解缓冲液（500mM NaCl，1mM EDTA，10mMTris（pH8.0），1%（v/v）Triton X-100）中收集细胞，在冰上超声4 min，离心10 minμ上清液的l与5μl预先洗涤的抗FLAG抗体，与琼脂糖珠（Sigma）结合并在4°C下培养2小时。我们用裂解缓冲液清洗琼脂床两次，用缓冲液D清洗两次在体外尿苷化，我们在30μ含3.2 mM MgCl的l反应21 mM DTT和0.25 mM rUTP以及1×10的5′末端标记前miRNA4-1 × 105cpm，在37°C下持续20分钟。我们通过三唑萃取和异丙醇沉淀纯化RNA。我们分析了12%尿素聚丙烯酰胺凝胶中的反应。

体外尿苷化分析

我们表演了在体外尿苷酰化检测30例μl反应含1.5μ第克，共克在体外转录前-let-7在10mM Tris pH 7.5、30mM KCl、1mM DTT、10mM MnCl中2，2 mM氯化镁2，0.25 mM UTP，1μ1个RNaseOut和0.01 Mbqα-32P-UTP公司。我们添加了1个μg重组MBP-PUP-2，并将重组GST-LIN-28的量增加至最多10μg.我们将反应混合物在30°C下培养30分钟。我们通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀纯化RNA。我们分析了6%尿素聚丙烯酰胺凝胶中的反应。我们使用了2US.pombe公司CID1 poly（U）polymerase（NEB，Ipswich，MA，USA）作为阳性对照。我们使用磷化成像仪（GE Healthcare）检测放射性。

电泳迁移率测定

我们进行了总体积为20的结合反应μl含有50000 cpm放射性标记RNA，30μg tRNA，1μl RNaseOut（40个单元/μl、 Invitrogen），50 mM Tris pH 7.6，100 mM NaCl，0.07%（v/v）β-巯基乙醇，5 mM MgOAc2,并将重组GST-LIN-28的数量增加到最多10μM.我们在室温下培养反应45分钟，然后使用5%天然聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。我们使用磷化成像仪（GE Healthcare）检测放射性。

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