生物化学杂志。2010年11月26日；285(48): 37716–37724.
缺氧增加胶质瘤细胞对谷胱甘肽的依赖性*
和1
Toyin Adeyemi Ogurninu公司
来自阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学神经生物学系和胶质生物学医学中心35294-0021
哈拉尔德·索尼默
来自阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学神经生物学系和胶质生物学医学中心35294-0021
来自阿拉巴马州伯明翰阿拉巴马大学神经生物学系和胶质生物学医学中心35294-0021
1通信地址：阿拉巴马大学伯明翰分校神经生物学系，地址：1719 6th Ave.S.，CIRC 410，Birmingham，AL 35294-0021，传真：205-975-6320；电子邮件：ude.bau@remiehtnos公司. 摘要
谷胱甘肽（GSH）是一种重要的抗氧化剂，负责维持细胞内氧化还原稳态。随着肿瘤超出其血液供应并变得缺氧，其氧化还原稳态受到一氧化氮和活性氧（ROS）生成的挑战。在胶质瘤中我-胱氨酸通过我-胱氨酸/我-谷氨酸交换器，系统xc（c）−是GSH合成的速率限制。我们发现缺氧会导致NO和ROS显著增加，但不会影响胶质瘤细胞的生长。这可以用谷胱甘肽利用率的伴随增加来解释，这伴随着xCT的细胞表面表达增加，xCT是系统x的催化亚单位c（c）−，以及我-胱氨酸摄取。当谷胱甘肽合成被丁硫氨酸亚砜胺（BSO）阻断时，生长受到抑制，这是谷胱甘苷合成所需酶的抑制剂，或者当细胞被剥夺我-胱氨酸。这些发现表明，胶质瘤细胞在缺氧条件下维持生长对谷胱甘肽的需求增加。因此，限制谷胱甘肽合成的方法，如阻断系统xc（c）−可被视为放射或化疗的辅助剂。
关键词：氨基酸转运、抗氧化剂、细胞表面蛋白、谷胱甘肽、神经化学、一氧化氮、氧自由基、胱氨酸/谷氨酸交换剂、系统xc（c）−
介绍
细胞抗氧化剂对于保护细胞免受活性氮和活性氧（RNS2/ROS）通过内源性或外源性施加压力产生。谷胱甘肽(我-γ-谷氨酰-我-半胱氨酸甘氨酸）是中枢神经系统中含量最丰富的抗氧化剂之一，其浓度在低毫摩尔范围内(1,–三). 谷胱甘肽是由我-半胱氨酸，我-谷氨酸和甘氨酸我-半胱氨酸具有限速作用。我-半胱氨酸通过进口我-胱氨酸（我-半胱氨酸）通过Na+-独立的，独立的我-胱氨酸/我-谷氨酸盐交换器，系统xc（c）−(4,–6). 系统xc（c）−是异聚氨基酸转运蛋白家族的成员，由一个调节性重亚基4F2hc/CD98和一个催化性轻亚基xCT组成，赋予该转运系统的特异性。系统xc（c）−调节电中性吸收我-胱氨酸交换释放我-谷氨酸的化学计量为1:1。细胞外的我-胱氨酸在细胞内迅速还原为我-半胱氨酸并并入谷胱甘肽，这是中和因氧张力变化而增加的RNS/ROS所必需的(7,8). 在胶质瘤扩张过程中，由于肿瘤血管结构不良，氧气受到限制(9,10). 事实上，据报道肿瘤氧张力低至0.1%，导致肿瘤区域处于慢性缺氧状态(11,–14). 系统xc（c）−已证明氧化应激后上调(14,15). 因此，GSH的合成可能对保护胶质瘤免受氧化损伤至关重要(14,–18).
在本研究中，我们研究了系统x的作用c（c）−-调解的我-胱氨酸摄取为胶质瘤细胞提供充足的我-半胱氨酸用于合成谷胱甘肽。此外，我们比较了谷胱甘肽在低氧（2%O2)和常氧（21%O2)条件。我们发现，在缺氧状态下，胶质瘤细胞增加NO和ROS的生成，从而导致伴随的我-通过系统x摄取胱氨酸c（c）−以及xCT亚单位的增强细胞表面表达。与常压条件相比，持续的谷胱甘肽合成对于支持胶质瘤细胞在缺氧条件下的生长更为关键。GSH的利用增加了约3倍，胶质瘤细胞生长对BSO抑制GSH合成的敏感性增强，证明了这一点。
实验程序
细胞培养
D54-MG细胞（世界卫生组织IV级）是D.D.Bigner博士（北卡罗来纳州达勒姆杜克大学）赠送的礼物。进行常规支原体检测以确保无污染。细胞在DMEM/F12（位于伯明翰的阿拉巴马大学媒体技术准备设施）中生长，并补充2 m米37°C下含10%CO的谷氨酰胺（Media Tech）和7%FBS（HyClone、Logan、UT）2与环境空气平衡。在一些实验中，细胞在1×DMEM（Invitrogen目录号231013-024）中生长，补充0.5 m米丙酮酸钠，2 m米谷氨酰胺和7%FBS（媒体技术，阿拉巴马大学伯明翰媒体准备设施）。在缺氧条件下，细胞在37°C的三角培养箱中生长，其中2%O2通过用100%N吹扫腔室来维持2并补充10%的CO2定期用pH试纸测试培养基的pH值，培养基中包含pH指示剂。在缺氧和常压条件下，pH值保持在7.4。
药物
除非另有说明，否则所有药物均从西格玛公司购买。(S公司)-4-羧基苯甘氨酸购自Tocris Bioscience（密苏里州埃利斯维尔）。
细胞增殖
通过将10000个细胞接种到12孔板的每个孔中来评估增殖情况（Fisher）。使用0.05%胰蛋白酶收集细胞，并将其重新悬浮在10 ml标准浴溶液（125 m）中米氯化钠，5米米氯化钾，1.2米米硫酸镁4，1米米氯化钙2，1.6米米纳2高性能操作4，0.4米米不2人事军官4，10.5米米葡萄糖和32.5米米HEPES）。使用NaOH将pH调节至7.4，并在约300 mos时测量渗透压米。使用Coulter Counter细胞尺寸测定仪（佛罗里达州迈阿密Beckman Coulter公司）在指定的日期进行三次读数。记录每500μl的细胞数，并将平均细胞数归一化为第0天。
Western印迹
使用添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂（1:100）的放射免疫沉淀分析缓冲液对D54-MG细胞的汇合板进行裂解。使用Bio-Rad DC蛋白质分析试剂盒进行蛋白质分析。25μg蛋白质与6×样品缓冲液（60%甘油，300m）混合米Tris（pH 6.8），12 m米乙二胺四乙酸，12%十二烷基硫酸钠，864米米2-巯基乙醇和0.05%溴酚蓝）并煮沸3分钟。将样品装入10%预铸SDS-聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad）中。将凝胶在100 V下运行90 min，并在200 mA下在室温下转移到聚偏二氟乙烯纸上120 min（Millipore，Bedford，mA）。在封闭缓冲液中封闭膜（TBST中5%脱脂奶粉（TBS加0.1%吐温20））。用山羊抗xCT一级抗体（0.06μg/ml；Abcam，Cambridge，MA）在4°C下隔夜探测斑点。用小鼠抗GAPDH抗体（0.05μg/ml；Abcam）对斑点进行检测。在一级抗体孵育后，用TBST清洗印迹四次，每次5分钟。然后，在室温下用HRP结合的二级抗体（2μg/0.5 ml，Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，CA）培养细胞膜1小时，然后再清洗一段时间（用TBST各清洗四次，每5分钟），并使用增强化学发光（ECL，Amersham Biosciences）开发。使用柯达图像工作站4000MM曝光膜。
细胞质和核蛋白提取
收集D54-MG细胞并用1×PBS洗涤。NE-PER核和细胞质提取试剂（NER和CER I；Pierce）分别用于分离蛋白质组分。按照制造商建议的方案进行了一些修改。CER I和NER补充了蛋白酶和磷酸酶抑制剂（1:50）。蛋白质通过Western blotting检测，并在室温下用小鼠抗缺氧诱导因子1α（HIF-1α）抗体（1.3μg/ml；Abcam）和小鼠抗组蛋白1抗体（1μg/ml，Millipore）检测1h。为了证实细胞质蛋白和细胞核蛋白之间的正确分离，还用兔抗α-微管蛋白抗体（0.2μg/ml；Abcam）探测印迹。
生物素化
为了防止表面蛋白的内吞作用，本试验在4°C下进行。用补充有1mL的标准浴溶液洗涤细胞米氯化钙2清洗后，加入1.5 mg/ml磺化NHS-生物素（皮尔斯），培养30分钟，偶尔轻轻摇晃。生物素化用补充100 m的标准浴溶液进行淬火米甘氨酸和1 m米氯化钙2（pH值8.0）。用标准浴液清洗细胞一次，并在添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂（1:100）的放射免疫沉淀分析缓冲液中进行溶解。使用Bio-Rad DC蛋白质测定试剂盒进行蛋白质分析。制备2.5-mg/ml蛋白储备液，0.4 ml蛋白与200μl链霉亲和素琼脂糖珠（Pierce）在4°C下培养过夜。结合部分用放射免疫沉淀分析缓冲液轻轻洗涤五次，再悬浮在50μl的6×样品缓冲液中，并煮沸10分钟以从珠子中分离表面蛋白。样品通过Western blotting进行处理。用小鼠抗Na抗体探测斑点+/K（K）+-ATP酶一级抗体（1μg/ml；Millipore）在室温下1小时，与山羊抗xCT抗体在4°C下过夜。
我-胱氨酸摄取
我-胱氨酸摄取使用我-[14C] 胱氨酸，如前所述，有修改(4). 使用2μCi的我-[14C] 胱氨酸（PerkinElmer生命科学）与100μ米 我-在3分钟内测量胱氨酸，摄取量归一化为蛋白质，这是使用Better Bradford蛋白质测定法（Thermo Fisher Scientific）测量的。
谷胱甘肽测定
还原型谷胱甘肽用QuantiChrom测定TM（TM）谷胱甘肽检测试剂盒（DIGT-250，BioAssay Systems，加利福尼亚州海沃德）。遵循制造商指示的方案。QuantiChrom公司TM（TM）谷胱甘肽检测试剂盒检测GSH降低。收集在缺氧或常压条件下生长的D54-MG细胞，并在含有50 m的溶液中进行超声处理米不2人事军官4和1米米EDTA公司。在10000×克在4°C下持续15分钟，收集上清液进行分析。首先，将样品与等量的试剂A（H）混合三人事军官4，H2SO公司4，纳2工单4·2小时2O、 中国三中国2OH和5，5′-二硫代二（2-硝基苯甲酸）），涡旋，并以14000rpm离心5分钟。接下来，将200μl样品/试剂A混合物与100μl试剂B KH等分到96 well板的孔中2人事军官4添加到每个含有样品/试剂A的孔中。将该板在室温下孵育25分钟，并读取在450nm（A）下的吸收。谷胱甘肽浓度使用以下公式计算：((A类样品−A类空白的)/(A类校准器−A类空白的)) × 100 ×n个=谷胱甘肽（μ米). 校准器等于100μ米谷胱甘肽，空白是水。将GSH归一化为蛋白质浓度，并使用Bio-Rad DC蛋白质检测试剂盒进行测量。
数据分析
结果使用Origin V7.5（MicroCal Software，马萨诸塞州北汉普顿）绘制，并使用InStat 3.00（GraphPad Software，加利福尼亚州圣地亚哥）进行分析。采用双向方差分析（ANOVA）确定显著性，然后进行Tukey事后检验。对于只比较两组平均值的所有数据集t吨采用试验方法。每个图中使用的统计分析的详细信息可以在图图例中找到。
结果
胶质瘤细胞在2%O时缺氧2
为了维持氧化还原平衡，抗氧化剂（特别是GSH）的充分合成对肿瘤细胞的生存至关重要(19). 先前的研究表明，肿瘤微环境内部和周围氧张力的变化导致肿瘤缺氧，并通过对肿瘤细胞进行氧化和/或亚硝化来改变氧化还原状态(15,17,18). 为了模拟缺氧条件，细胞在37°C的三角培养箱中以2%的O培养2，10%一氧化碳2和88%N2为了进行比较，在培养箱中实现了常氧条件，其中温度设置为37°C，含10%CO2与环境空气平衡。为了证明D54-MG细胞确实对缺氧条件有反应，我们检测了一种典型的细胞对缺氧的反应，即HIF-1α的增加。HIF-1α是HIF-1转录因子的调节亚单位。活化的HIF-1α转位到细胞核，在那里与反应元件结合，并诱导参与细胞缺氧反应的许多基因转录(20). 在缺氧条件下培养D54-MG细胞，在规定的时间点，分离核蛋白和细胞质蛋白，用Western blotting检测并检测HIF-1α的表达(A类). 为了确保核蛋白和细胞质蛋白的有效分离，还对膜进行了α-微管蛋白的检测。密度分析后，HIF-1α条带归一化为组蛋白1。缺氧5h后，HIF-1α表达显著增加(对< 0.001); 它在24小时内保持升高，并在48小时内恢复到基础水平(B类). 这些数据表明，2%O2足以在D54-MG细胞中诱导缺氧反应。
核HIF-1α表达增加，以应对2%O2. A类，用2%O处理后HIF-1α核表达的代表性印迹2.B类，四个独立实验的密度分析。采用双向方差分析（ANOVA）和Tukey的事后分析来确定显著性。**，对< 0.01; ***,对< 0.001 (n个= 4).
在缺氧条件下增加谷胱甘肽的利用
硫醇还原的谷胱甘肽作为电子供体来还原氧化蛋白质，其产物是二硫氧化物GSSG(21,22). 作为我-半胱氨酸是谷胱甘肽合成的速率限制因子，我们首先研究了谷胱甘氨酸合成对细胞外物质可用性的依赖性我-缺氧和常压条件下的胱氨酸(7). D54-MG胶质瘤细胞在2或21%O下培养296小时和72小时时，细胞内GSH通过清除细胞外GSH而耗尽我-胱氨酸测定GSH前24小时。在谷胱甘肽（GSH）耗尽后，胶质瘤细胞被增加浓度的我-胱氨酸持续6小时，然后测量GSH，并将其归一化为蛋白质浓度。结果表明，细胞内GSH的浓度随浓度的增加而增加我-胱氨酸。最大浓度的一半我-缺氧和常压条件下需要的胱氨酸分别为12和9μ米分别为(A类). 接下来，我们检查了低氧和常压条件下GSH浓度随时间的变化。D54-MG细胞在低氧或常压条件下生长，72小时后，将培养基换为无培养基我-胱氨酸。24小时后，100μ米 我-在规定的时间点添加胱氨酸，测量GSH并将其标准化为蛋白质浓度。结果表明，谷胱甘肽浓度无显著差异(B类). 这可能是由于谷胱甘肽消耗率升高所致。为了评估谷胱甘肽的消耗速度，D54-MG细胞在缺氧和常压条件下生长96小时。将培养基更改为含有0μ米 我-在测定剩余GSH浓度前1、3、6、12和24小时的胱氨酸。这是为了抑制细胞内谷胱甘肽的再合成(C类). 这些数据均符合指数衰减函数。这些拟合在缺氧条件下产生的衰变时间为2.87小时，而在常氧条件下产生的衰变时间为8.09小时，这是一个显著的差异(对< 0.05) (C类). 这些数据表明，在缺氧条件下，谷胱甘肽的消耗速度大约快三倍，这可能是由于减少氧化蛋白和/或谷胱甘苷进入γ-谷氨酰循环以释放氨基的需求增加。
缺氧增加谷胱甘肽的利用。 A类,我-常氧（21%O）条件下胱氨酸依赖性谷胱甘肽合成2)或缺氧（2%O2)条件。B类，添加100μ米 我-胱氨酸。C类，GSH利用率在排除我-胱氨酸。两个样本t吨测试用于分析IC之间的差异50GSH值和衰减常数(n个= 4).
缺氧条件下对谷胱甘肽合成抑制的敏感性增加
在自由基生成和抗氧化剂解毒之间保持体内平衡的能力对大多数细胞类型的生存至关重要，这种失衡的丧失可能导致细胞死亡(23). 因此，我们研究了GSH在低氧和常压条件下对胶质瘤细胞生长的重要性。为此，在100μ米 我-胱氨酸，0μ米 我-胱氨酸，或0μ米 我-胱氨酸加谷胱甘肽乙酯（GSHee），这是一种还原谷胱甘氨酸的细胞发酵形式，已被证明能增加细胞内谷胱甘酸(24). 生长是使用Coulter Counter细胞大小测定器测定的，它使我们能够在定义的时间点计算细胞数量。此外，台盼蓝排除试验表明，细胞活力在缺氧和常压条件下不受影响（数据未显示）。如果GSH生产来自我-细胞生长需要胱氨酸，仅用GSHee补充培养基就足以在任何条件下维持生长。在缺氧条件下4天后，在没有我-胱氨酸与对照条件下增加18倍相比，差异显著(对< 0.001). 增加5m米GSHee在第3天和第4天完全恢复生长，以控制病情(A类). 同样地，在正常氧条件下，在第2天、第3天和第4天，如果没有我-胱氨酸，但通过GSHee恢复到控制水平(B类). 事实上，胶质瘤细胞的生长不受缺氧条件的影响，这支持了这样的观点，即细胞要在缺氧和常压条件下保持正常的生长速度，就必须保持足够的GSH浓度。
胶质瘤细胞的生长依赖于谷胱甘肽。 A类和B类胶质瘤细胞在常压（21%O）下生长2)或缺氧（2%O2)在不存在GSH的情况下，条件取决于GSH我-胱氨酸。采用双向方差分析（ANOVA）和Tukey的事后分析来确定显著性。*，对< 0.05; ***,对< 0.001 (n个= 4).
为了进一步研究谷胱甘肽（GSH）对胶质瘤细胞生长的需求，特别是在缺氧条件下，我们研究了BSO阻断GSH合成的效果，BSO是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSH合成中的速率限制酶）的抑制剂。我们证实，BSO确实有效抑制GSH合成（数据未显示）。在缺氧和常压条件下，在100μ米 我-胱氨酸、BSO用IC抑制神经胶质瘤细胞生长50值为258和119μ米分别为(A类). 然而，在10μ米 我-与生长在100μ米 我-胱氨酸。统计分析表明，BSO在10μ米 我-胱氨酸的IC显著降低50(1 μ米)与IC相比，在缺氧条件下50(5 μ米)在常压条件下(对< 0.05) (B类). 为了证明BSO的作用是由于细胞内GSH的减少而不是其他非特异性作用，我们用30μ米有和无3m的BSO米GSHee公司。在常压和缺氧条件下，在10μ米 我-胱氨酸和牛血清白蛋白分别使细胞数减少95%和96%。此外，外源施用3 m米GSHee完全恢复增长至控制水平(C类). 这些结果进一步表明，GSH在低氧条件下，尤其是在生理浓度的我-胱氨酸。
胶质瘤细胞生长对谷胱甘肽抑制的敏感性增加。 A类和B类100μm BSO对谷胱甘肽合成的抑制米 我-常温下胱氨酸（21%O2)或缺氧（2%O2)条件(n个= 5).B类，增加了对10μm BSO抑制GSH合成的敏感性米 我-常氧或缺氧条件下的胱氨酸(n个= 6).C类，用3 m处理D54-MG细胞米GSHee在常氧或缺氧条件下恢复BSO对生长的抑制作用(n个= 3). 两个样本t吨测试用于分析IC之间的差异50BSO.***的值，对< 0.001.
低氧诱导的NO和ROS
缺氧已被证明会导致自由基生成增加，尤其是活性氧(17,18). 我们检测了缺氧条件下自由基产生的变化以及GSH对其中和的有效性。为了测定活性氧的产生，D54-MG细胞在缺氧条件下培养48小时。胶质瘤细胞用活性氧指示染料CM-h负载2DCFDA和Hoechst 33342染色细胞核。CM-H公司2DCFDA最初是非荧光的，一旦渗入活细胞，就会被非特异性胞内酯酶裂解。在活性氧存在下，还原荧光素化合物被氧化，激发/发射最大值为～495/529 nm。代表性图像如所示A类，对发出绿色荧光的细胞的分析如所示A类1.缺氧48小时后，ROS检测从7.7%显著增加至41.6%(A类.1）.CM-H的特异性2通过在缺氧条件下用GSH（一种特征良好的活性氧清除剂）处理胶质瘤细胞来评估DCFDA(25,26). 为了确定谷胱甘肽是否能够中和低氧诱导的活性氧，用3 m米低氧条件下的GSHee。GSHee显著降低低氧诱导的ROS 70%(A类.1）.在96小时时观察到类似结果（数据未显示）。
低氧诱导的ROS和NO。 A类和B类，指示染料CM-H检测到的ROS-和NO-阳性D54-MG细胞的代表性图像2DCFDA和DAF-FM。胶质瘤细胞在常压（21%O）下生长2)或缺氧（2%O2)条件为0和48小时，有和没有3m米GSHee公司。A.1款和B.1节分别对ROS-和NO-阳性D54-MG细胞进行分析。采用双向方差分析（ANOVA）和Tukey的事后分析来确定显著性。***，对< 0.001; **,对< 0.01 (n个= 3).比例尺=50微米。
低氧条件下会产生次级自由基(15). NO能够与氧自由基如O反应2−形成过氧亚硝酸盐（ONOO−)和二氧化氮（NO2) (27). NO中间体（特别是NO2)能与NO进一步反应形成三氧化二氮（N2O（运行）三)，一种强效RNS，可产生亚硝化应激(28). 通过用NO指示染料DAF-FM二醋酸盐负载细胞来评估NO的生成，DAF-FM-二醋酸盐是一种细胞发酵染料，一旦进入细胞，就会被酯酶脱乙酰化，形成DAF-FM.在NO存在下，DAF-F-FM形成荧光苯并三唑衍生物，最大激发/发射波长为～495/515nm。缺氧条件下生长的胶质瘤细胞也显示NO生成显著增加(B类). 缺氧48小时后，NO检测显著增加，从7.3%增至35.8%(B类.1）.3米培养米GSHee还显著降低缺氧48小时后NO生成65%(B类.1）.在96小时时观察到类似的结果（数据未显示）。这些数据表明，谷胱甘肽能够完全中和缺氧条件下产生的RNS/ROS。
系统x的抑制c（c）−减少胶质瘤生长
系统x的抑制c（c）−在常压条件下，胶质瘤细胞生长和细胞内GSH减少(16). 为了进一步确定GSH在缺氧条件下胶质瘤细胞生长中的意义，我们抑制了系统xc（c）−使用两种抑制剂(S公司)-4-羧苯基甘氨酸（S4CPG）和柳氮磺胺吡啶（SAS）。已证明S4CPG和SAS可有效抑制我-胱氨酸摄取与肿瘤生长抑制(4,16,29,–31). 此外，SAS对肿瘤生长的影响已被证明独立于NF-κB，特别是由于我-胱氨酸饥饿(30,32). 首先，在100或10μ米 我-胱氨酸。100μ米 我-胱氨酸、S4CPG降低缺氧和常压条件下IC的生长50值为145和126μ米分别为(补充图1A类). 存在10μ米 我-胱氨酸，胶质瘤细胞对IC的S4CPG敏感性增加50值为0.80μ米在缺氧条件下和2μ米在常压条件下(补充图1B类). 在100μ米 我-胱氨酸，IC50缺氧和常压条件下SAS值分别为440和315μ米分别为(补充图1C类). 此外，降低细胞外我-胱氨酸至10μ米增加了神经胶质瘤细胞在缺氧和常氧条件下对SAS的总体敏感性50值为32和40μ米分别为(补充图1天). 这些剂量反应证明了S4CPG和SAS在高浓度和低浓度我-胱氨酸。
为了检测GSHee在低氧和常氧条件下是否能够通过S4CPG和SAS缓解生长抑制，我们使用1 m米GSHee和S4CPG和SAS的药物浓度导致>80%的生长抑制，这种生长抑制与不存在我-胱氨酸。在缺氧条件下，在100μ米 我-胱氨酸、S4CPG和SAS分别使细胞数减少99和84%(,A类和B类). 尽管1米米GSHee在S4CPG和SAS存在的情况下显著增加了细胞数量，只有S4CPG完全恢复生长至控制水平(,A类和B类). 在常氧条件下，在100μ米 我-胱氨酸，500μ米S4CPG和SAS分别使细胞数减少了98%和95%(,A类和B类). 此外，外施1 m米GSHee在两种药物均存在的情况下恢复生长至控制水平。
GSH通过SAS和S4CPG恢复生长抑制。 A类和B类，抑制系统xc（c）−500μ米S4CPG或SAS常压（21%O2)或缺氧（2%O2)条件。1米米GSHee将S4CPG和SAS的生长抑制恢复到对照水平。采用双向方差分析（ANOVA）和Tukey的事后分析来确定显著性，***，对< 0.001; **,对< 0.01; *,对< 0.05 (n个= 3).
缺氧增加我-[14C] 系统x的xCT亚单位的胱氨酸摄取和细胞表面表达c（c）−
以前的报告表明，NO供体如3-亚硝基-N个-乙酰青霉胺和S公司-亚硝基谷胱甘肽和活性氧供体，如黄嘌呤/黄嘌呤-氧化酶和H2O（运行）2增加系统xc（c）−活动(40). 这让我们研究了如何我-[14C] 通过系统x摄取胱氨酸c（c）−受缺氧影响。在缺氧或常压条件下72小时后，用钠冲洗胶质瘤细胞+-独立摄取溶液以消除钠的贡献+-依赖性摄取系统。随后添加Na+-含有2μCi的独立摄取溶液我-[14C] 胱氨酸和100μ米 我-在3分钟内测量胱氨酸的摄取量。缺氧条件下生长的D54-MG细胞多摄取约30%我-胱氨酸比常氧条件下生长的细胞(). 浓度低至250μ米S4CPG和SAS同样下降我-D54-MG细胞对胱氨酸的摄取(16). 调查任何竞争对手的可能上调我-我们测量了胱氨酸转运体我-在高剂量SAS存在下摄取胱氨酸，以最大限度地抑制我-胱氨酸摄取。D54-MG细胞在缺氧条件下生长72小时，并在750μ米SAS或车辆。结果表明，在SAS存在下，我-在缺氧条件下，胱氨酸摄取减少了～67%，在常压条件下减少了63%(). 这表明在缺氧条件下我-胱氨酸转运通过系统x介导c（c）−，并且摄取增强可能是由于系统x的增强表达c（c）−.
缺氧增强我-[14C] 通过系统x摄取胱氨酸c（c）−. A类，摄取我-[14C] 正常氧（21%O）培养的D54-MG细胞中的胱氨酸2)或缺氧（2%O2)在有和没有750μ米SAS。采用双向方差分析（ANOVA）和Tukey的事后分析来确定显著性，***，对< 0.001; *,对< 0.05 (n个= 8).
为了研究缺氧对xCT表达的影响，我们检测了胶质瘤细胞在缺氧条件下生长一定时间后的总蛋白。收集细胞裂解物，进行Western印迹，并探测xCT和GAPDH(A类). 通过密度分析，我们确定缺氧对总蛋白没有影响(B类). 接下来，我们使用生物素化分析检测了细胞表面xCT的表达。D54-MG细胞在2%O中生长2对于定义的期间。在最后一个时间点结束时，细胞被置于4°C以停止内吞，表面蛋白被生物素标记并与链霉亲和素偶联。细胞被裂解并收集用于蛋白质印迹。用xCT探测斑点并归一化为钠+/K（K）+-ATP酶(C类). 我们的结果显示，在48和96小时时，xCT亚单位的细胞表面表达分别增加了3-4倍(天). 这些发现表明，缺氧后，xCT表面表达增加导致增强我-胱氨酸摄取。
缺氧增加D54-MG细胞中xCT的表面表达。 A类和C类，低氧条件下生长的D54-MG细胞的代表性斑点2)条件并探测xCT。A类，总蛋白；C类，表面蛋白质。B类和天，四个独立实验的密度分析。B类，总计；天，表面双向方差分析，然后是Tukey的事后分析，用于确定显著性。*，对< 0.05 (n个= 4).
讨论
我们的结果表明，在缺氧条件下，胶质瘤细胞对谷胱甘肽的依赖性增加，尤其是在有限的缺氧条件下我-胱氨酸可用性。谷胱甘肽维持细胞内的硫醇氧化还原电位，中和自由基，并充当细胞内的贮存器我-半胱氨酸(33,–36). 我们已经证明，在10μ米 我-胱氨酸，BSO抑制胶质瘤细胞生长，GSHee完全恢复生长至控制水平。这表明GSH在胶质瘤细胞中的主要作用是氧化还原调节，而不是蛋白质合成。在缺氧条件下，氧化蛋白可能增加，可能是核糖核苷酸还原酶。核糖核苷酸还原酶是一种催化核糖核苷酸形成脱氧核糖核苷酸的酶，是DNA合成和细胞周期进展所必需的(21,22,37). 这些发现得到了数据的支持，这些数据表明，在缺氧条件下，NO和ROS确实都会增加。尽管有这些增加，但胶质瘤细胞的生长没有减弱，前提是细胞保持在支持细胞生长的条件下从头开始谷胱甘肽的合成。有趣的是，一些细胞类型能够从我-不含蛋氨酸我-胱氨酸通过反式-硫化途径(38). 事实上，一些癌症依赖于我-专门用于合成谷胱甘肽的蛋氨酸，如果没有蛋氨酸，生长就会受到抑制(39). 然而，D54-MG细胞无法替代我-蛋氨酸我-胱氨酸（数据未显示），制造我-胱氨酸对谷胱甘肽合成和胶质瘤细胞存活至关重要。
我们假设，胶质瘤细胞通过增加对一氧化氮和活性氧的摄取来调节NO和ROS水平的增加我-胱氨酸为谷胱甘肽合成提供足够的底物。这与之前的研究结果一致，即增加的硝化和氧化应激会增加系统xc（c）−视网膜神经节细胞活性和xCT表达(40). 此外，IL-1β通过增加系统x的功能增强缺氧神经元细胞的死亡c（c）−活动(41). 同样，我们还发现在缺氧条件下生长72小时的胶质瘤细胞表现出增强我-[14C] 胱氨酸摄取量和SAS使摄取量减少了50%以上。SAS对系统x的抑制作用c（c）−-调解的我-胱氨酸摄取与先前的报告一致，表明SAS减少系统xc（c）−胶质瘤中的活性而非星形胶质细胞和神经元中的活性(4). 这些细胞类型主要取决于我-胱氨酸/我-半胱氨酸通过钠转运+-依赖性兴奋性氨基酸转运系统(4,42,43).
增加的系统xc（c）−本研究报告的低氧条件下的活性与人类成纤维细胞和小鼠腹腔巨噬细胞的发现相反，在这些细胞中低氧减少我-胱氨酸摄取(44,45). 与胶质瘤细胞不同，成纤维细胞和巨噬细胞可能对系统x有不同的依赖性c（c）−-调解的我-低氧条件下胱氨酸的摄取。然而，增加的我-我们的发现很容易解释脑胶质瘤中胱氨酸的摄取，缺氧使xCT的细胞表面表达增加了3倍。事实上，蛋白质水平的增加大于我-此处记录的胱氨酸转运，表明并非所有xCT亚单位都参与我-胱氨酸转运。例如，并非所有表面xCT都与CD98相关，CD98是构成功能性转运体所必需的。从机械角度来看，我们认为胶质瘤细胞维持xCT的细胞质储库，xCT根据需要被招募到质膜以满足其氧化还原需要，即谷胱甘肽生产。这可能代表了对细胞生物微环境的适应，其中氧张力在正常组织中变化很大，从2–21%到肿瘤中的低至0.1%(11,–14).
尽管缺氧加剧我-胱氨酸摄取，GSH浓度没有随时间增加。这可以很容易地用低氧条件下观察到的谷胱甘肽利用率增加来解释。谷胱甘肽在γ-谷氨酰循环中的代谢和γ-谷胺酰转肽酶活性的增加是谷胱甘苷消耗的可能机制(33,46). 有趣的是，γ-谷氨酰转肽酶的表达与高级胶质瘤呈正相关，氧化应激的增加可能会增加γ-谷氨酰转肽酶的表达和/或活性(47,48). 与缺氧条件下对谷胱甘肽的需求增加一致，胶质瘤细胞在低氧条件下我-胱氨酸和低氧条件下对谷胱甘肽合成抑制剂BSO也更敏感。这些发现表明系统xc（c）−-调解的我-脑胶质瘤的生长控制中，胱氨酸的摄取更为重要，因为它们超出了血液供应，肿瘤也经历了缺氧。尽管缺氧是本研究中唯一的外源性应激，但我们可以从我们的研究结果推断出，在缺氧条件下，胶质瘤细胞维持稳态GSH水平的能力可能使其对放射和化疗方法更具抵抗力。值得注意的是，辐射损伤主要是由于羟基自由基的产生，而羟基自由基可被谷胱甘肽有效中和，许多胶质瘤确实对辐射治疗有高度抵抗力(49,50). 同样，对化疗药物的耐药性在胶质瘤中很常见，并被认为是由于编码转运蛋白的多药耐药基因的活性，该转运蛋白需要将化合物与谷胱甘肽结合才能转运(51). 因此，低氧条件下GSH的产生可能会增强胶质瘤的放射和化疗耐药性。这就提出了一个问题，即放射治疗和化学治疗药物引起的自由基生成增加是否会向胶质瘤细胞发出信号，以增加系统xc（c）−以对抗其新的氧化还原状态。先前的研究结果表明，SAS可能是靶向系统x的优秀候选药物c（c）−在胶质瘤中(16). 我们的研究结果表明，在缺氧条件下，靶点确实上调。可以有力地论证系统x的抑制c（c）−对于接受放疗和/或化疗的患者，应考虑使用SAS或类似药物作为辅助治疗，以提高治疗效果。
2使用的缩写如下：
- RNS系统
- 活性氮物种
- ROS公司
- 活性氧物种
- 英国标准组织
- 丁硫氨酸亚砜胺
- HIF-1α
- 低氧诱导因子1α
- 方差分析
- 方差分析
- GSHee公司
- 谷胱甘肽乙酯
- S4CPG系列
- (S公司)-4-羧苯基甘氨酸
- SAS公司
- 柳氮磺胺吡啶
- DAF-FM公司
- （4-氨基-5-甲氨基-2′，7′-二氟荧光素二乙酸酯）
- CM-H公司2加拿大食品药品监督管理局
- 5-（和-6）-氯甲基-2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯乙酰酯。
参考文献
1Anderson M.E.、Underwood M.、Bridges R.J.、Meister A.（1989）FASEB J。 三, 2527–2531 [公共医学][谷歌学者] 2Choi C.、Zhao C.、Dimitrov I.、Douglas D.、Coupland N.J.、Kalla S.、Hawesa H.、Davis J.（2009）J.马格纳。Reson公司。 198, 160–166[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 三。Terpstra M.、Henry P.G.、Gruetter R.（2003）Magn.公司。Reson公司。医学。 50, 19–23 [公共医学][谷歌学者] 4Ye Z.C.、Rothstein J.D.、Sontheimer H.（1999年）《神经科学杂志》。 19, 10767–10777[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5.Cho Y.，Bannai S.（1990）神经化学杂志。 55, 2091–2097 [公共医学][谷歌学者] 6加藤S.、根岸K.、马瓦塔里K.、郭C.H.（1992）神经科学 48, 903–914 [公共医学][谷歌学者] 8Lakshmi V.M.、Hsu F.F.和Zenser T.V.（2003）化学。研究毒物。 16, 367–374 [公共医学][谷歌学者] 9曲棍球M.、Vaupel P.（2001）塞明。昂科尔。 28, 36–41 [公共医学][谷歌学者] 10袁F.、萨利希H.A.、鲍彻Y.、瓦瑟尔美国、图马R.F.、贾恩·K（1994）癌症研究。 54, 4564–4568 [公共医学][谷歌学者] 11Rampling R.、Cruickshank G.、Lewis A.D.、Fitzsimmons S.A.、Workman P.（1994）国际辐射杂志。昂科尔。生物物理。 29, 427–431 [公共医学][谷歌学者] 12Nordsmark M.、Bentzen S.M.、Overgaard J.（1994）《Oncol学报》。 33, 383–389 [公共医学][谷歌学者] 13Ereciáska M.，Silver I.A.（2001年）回复。生理学。 128, 263–276 [公共医学][谷歌学者] 14Papandreou I.、Powell A.、Lim A.L.、Denko N.（2005）穆塔特。物件。 569, 87–100 [公共医学][谷歌学者] 15Yamamoto Y.、König P.、Henrich M.、Dedio J.、Kummer W.（2006）细胞组织研究。 325, 3–11 [公共医学][谷歌学者] 16Chung W.J.、Lyons S.A.、Nelson G.M.、Hamza H.、Gladson C.L.、Gillespie G.Y.、Sontheimer H.（2005年）《神经科学杂志》。 25, 7101–7110[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Chandel N.S.、McClintock D.S.、Feliciano C.E.、Wood T.M.、Melendez J.A.、Rodriguez A.M.、Schumaker P.T.（2000）生物学杂志。化学。 275, 25130–25138 [公共医学][谷歌学者] 18Guzy R.D.、Hoyos B.、Robin E.、Chen H.、Liu L.、Mansfield K.D.、Simon M.C.、Hammerling U.、Schumaker P.T.（2005）细胞代谢。 1, 401–408 [公共医学][谷歌学者] 19Shih A.Y.、Erb H.、Sun X.、Toda S.、Kalivas P.W.、Murphy T.H.（2006）《神经科学杂志》。 26, 10514–10523[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20王国良、塞门扎（1993）生物学杂志。化学。 268, 21513–21518 [公共医学][谷歌学者] 21Luthman M.、Eriksson S.、Holmgren A.、Thelander L.（1979）程序。国家。阿卡德。科学。美国。 76, 2158–2162[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Yang J.、Wu L.J.、Tashiro S.、Onodera S.、Ikejima T.（2008）自由基。物件。 42, 1–11 [公共医学][谷歌学者] 24Anderson M.F.、Nilsson M.、Sims N.R.（2004）神经化学。国际。 44, 153–159 [公共医学][谷歌学者] 25Dringen R.（2000）掠夺。神经生物学。 62, 649–671 [公共医学][谷歌学者] 26Na N.、Chandel N.S.、Litvan J.、Ridge K.M.（2010）FASEB J。 24, 799–809[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Radi R.、Beckman J.S.、Bush K.M.、Freeman B.A.（1991）生物学杂志。化学。 266, 4244–4250 [公共医学][谷歌学者] 28Ridnour L.A.、Thomas D.D.、Mancardi D.、Espey M.G.、Miranda K.M.、Paolocci N.、Feelisch M.、Fukuto J.、Wink D.A.（2004）生物化学。 385, 1–10 [公共医学][谷歌学者] 29Guan J.、Lo M.、Dockery P.、Mahon S.、Karp C.M.、Buckley A.R.、Lam S.、Gout P.W.、Wang Y.Z.（2009）癌症化疗师。药理学。 64, 463–472 [公共医学][谷歌学者] 30Doxsee D.W.、Gout P.W.、Kurita T.、Lo M.、Buckley A.R.、Wang Y.、Xue H.、Karp C.M.、Cutz J.C.、Cunha G.R.和Wang Y.Z（2007）前列腺 67, 162–171 [公共医学][谷歌学者] 31Narang V.S.、Pauletti G.M.、Gout P.W.、Buckley D.J.和Buckley A.R.（2007）化疗 53, 210–217 [公共医学][谷歌学者] 33Meister A.，Tate S.S.（1976年）每年。生物化学评论。 45, 559–604 [公共医学][谷歌学者] 35Tateishi N.、Higashi T.、Naruse A.、Nakashima K.、Shiozaki H.（1977）《营养学杂志》。 107, 51–60 [公共医学][谷歌学者] 36.Cho E.S.、Johnson N.、Snider B.C.（1984）《营养学杂志》。 114, 1853–1862 [公共医学][谷歌学者] 37Herrick J.、Sclavi B.（2007）摩尔微生物。 63, 22–34 [公共医学][谷歌学者] 38Schmidt C.L.、Allen F.W.、Tarver H.（1940）科学类 91, 18–19 [公共医学][谷歌学者] 39Zhang W.、Braun A.、Bauman Z.、Olteanu H.、Madzelan P.、Banerjee R.（2005）癌症研究。 65, 1554–1560 [公共医学][谷歌学者] 40Dun Y.、Mysona B.、Van Ells T.、Amarnath L.、Ola M.S.、Ganapathy V.、Smith S.B.（2006）细胞组织研究。 324, 189–202[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 41Fogal B.、Li J.、Lobner D.、McCullough L.D.、Hewett S.J.（2007）《神经科学杂志》。 27, 10094–10105[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 42Flynn J.、McBean G.J.（2000）神经化学。国际。 36, 513–521 [公共医学][谷歌学者] 43.McBean G.J.、Flynn J.（2001）生物化学。社会事务处理。 29, 6–22 [公共医学][谷歌学者] 44Bannai S.、Sato H.、Ishii T.、Sugita Y.（1989）生物学杂志。化学。 264, 18480–18484 [公共医学][谷歌学者] 45Sato H.、Kuriyama-Matsumura K.、Hashimoto T.、Sasaki H.、Wang H.、Ishii T.、Mann G.E.、Bannai S.（2001）生物学杂志。化学。 276, 10407–10412 [公共医学][谷歌学者] 46Griffith O.W.、Bridges R.J.、Meister A.（1978）程序。国家。阿卡德。科学。美国。 75, 5405–5408[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 47刘瑞敏、史敏敏、朱利维·C、福曼·H·J（1998）美国生理学杂志。 274，L330–L336[公共医学][谷歌学者] 48Schäfer C.、Fels C.、Brucke M.、Holzhausen H.J.、Bahn H.、Wellman M.、Visvikis A.、Fischer P.、Rainov N.G.（2001）《Oncol学报》。 40, 529–535 [公共医学][谷歌学者] 49Davis G.D.、Masilamoni J.G.、Arul V.、Kumar M.S.、Baraledgeharan U.、Paul S.F.、Sakthivelu I.V.，Jesudason E.P.、Jayakumar R.（2009）细胞生物学。毒物。 25, 331–340 [公共医学][谷歌学者] 50Bump E.A.、Brown J.M.（1990）药理学。疗法。 47, 117–136 [公共医学][谷歌学者] 51Dirven H.A.、van Ommen B.、van Bladeren P.J.（1996）化学。研究毒理学。 9, 351–360 [公共医学][谷歌学者] 
