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细胞干细胞。作者手稿；PMC 2011年11月5日发布。
以最终编辑形式发布为：
细胞干细胞。2010年11月5日；7(5): 631–637.
数字对象标识：2016年10月10日/j.stem.2010.09.014
预防性维修识别码：PMC2987635型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院242689
PMID：21040903

弗里德里希共济失调诱导的多能干细胞模型代际GAA•TTC三重重复不稳定性

谢尔曼·库,1 伊丽莎白·索拉尼,1 埃里卡·坎帕乌,1 伊丽莎白·A·托马斯,1 古尔莎阿尔顿,2 路易丝·洛朗,2,三 珍妮·洛林,2 马雷克·纳皮埃拉拉,4和M.戈特斯菲尔德-乔尔1,5
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

遗传性神经退行性疾病Friedreich共济失调（FRDA）是由GAA•TTC三重重复序列在第一内含子内的过度扩张引起的FXN公司基因，编码线粒体蛋白frataxin。长GAA•TTC重复导致受影响个体异染色质介导的基因沉默和frataxin丢失。我们报道了通过转录因子重编程从FRDA患者成纤维细胞中衍生出诱导多能干细胞（iPSCs）。FXN公司iPSC中保持着基因抑制，反映人类疾病的全球基因表达特征也一样。GAA•TTC在中唯一重复FXN公司在iPSC中，表现出与患者家属类似的重复不稳定性，在这些患者家属中，他们随着年龄的离散变化而扩张和/或收缩。错配修复酶MSH2与其他三重重复序列疾病的重复不稳定性有关，在多能性细胞中高度表达FXN公司内含子1和shRNA沉默MSH2型阻止重复膨胀，为FRDA中的重复膨胀提供了可能的分子解释。

简介

Friedreich共济失调（FRDA）是最常见的遗传性共济失调，由异染色质介导的细胞核沉默引起外汇储备编码必需线粒体蛋白frataxin的基因(Herman等人，2006年). FRDA的基因突变是在第一内含子中的GAA•TTC三重重复扩增FXN公司(Campuzano等人，1996年)未受影响的等位基因重复6–34次，而患者等位基因的重复66–1700次。较长的重复序列与更严重的基因抑制、更低的frataxin蛋白水平以及更早的发病和疾病严重性增加有关(Bidichandani等人，1998年;Campuzano等人，1996年). Frataxin功能不全导致进行性脊髓小脑神经变性和相关运动障碍，同时增加糖尿病和心肌病的风险，后者是FRDA中最常见的死亡原因。

与许多三重重复疾病不同（例如，聚谷氨酰胺扩张和RNA毒性疾病(Orr和Zoghbi，2007年))、GAA•TTC扩建外汇储备为内含子，不会改变frataxin蛋白序列；因此，基因激活对治疗有益(戈特斯菲尔德，2007年;Herman等人，2006年). 然而，FRDA发病机制和治疗的研究受到较差的细胞模型的限制，现有的小鼠模型不能完全重现基因沉默和frataxin蛋白水平(Al-Mahdawi等人，2004年;米兰达等人，2002年). 最近的研究表明，人类成纤维细胞可以通过转录因子的转导重新编程为多功能状态(Takahashi等人，2007年)重要的是，来自反复相关神经退行性疾病患者（如亨廷顿病（HD）和脆性X综合征）的成纤维细胞也证明了这一点(Park等人，2008a;Urbach等人，2010年). 我们现在报告FRDA iPSC的推导。我们发现FXN公司FRDA iPSCs中的GAA•TTC重复表现出类似于人类疾病的重复不稳定性模式，重复序列在世代之间随着长度的离散变化而扩展和/或收缩(Campuzano等人，1996年;Pianese等人，1997年). 我们还为错配修复（MMR）酶MSH2在重复不稳定性中的作用提供了证据。我们的观察为FRDA和其他三重重复性疾病中重复不稳定性的机制研究提供了一个细胞模型系统。

结果

从FRDA患者成纤维细胞衍生iPSCs

两名FRDA患者（NIGMS Coriell Cell Repository中的GM03816和GM04078）的原代成纤维细胞通过转录因子过度表达重新编程(Takahashi等人，2007年)，并选择和扩增具有ES/iPS形态的菌落(图1A). qRT-PCR分析表明我们的FRDA iPSC系确实是多功能的(图1B)并保持对FXN公司信使核糖核酸(图1C). 此外，整合的转基因重编程因子在iPSC中的表达被沉默(图S1A，在线提供），完全重新编程的标志(Lowry等人，2008年).

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FRDA iPSC的特性

(一个)GM03816 FRDA成纤维细胞（左）、GM03816iPSCs（中）和H1 hESCs（右）的图像。比例尺=0.5 mm。

(B类)GM03816-iPS4显示出与H1-hESCs类似的多能性mRNAs表达。GM03816成纤维细胞，白色条；GM03816 iPSC，浅灰色；H1 hESCs，深灰色。mRNA水平标准化为GAPDH公司误差条=重复测量的SEM。

（C）标志性镇压FXN公司与未受影响的H1细胞系相比，GM03816成纤维细胞和GM03816-iPS4细胞系中的mRNA。误差线=重复测量的SEM。

（D）多能性标记的GM03816-iPS4和H1-hES染色（对比增强）。相位对比度（灰色）；核染色（蓝色）；多能性标记染色（绿色和红色）如彩色文本标签所示。Tra1–60和Tra1–81，表面标记；SSEA-3和-4，阶段特异性胚胎抗原；Oct4，转录因子。比例尺=0.25 mm。

（E）FRDA iPSCs与未受影响的iPSC/ESC、人体组织和细胞系的微阵列分析。红色表示上调，绿色表示下调。未受影响的iPS/ESC，红色突出显示；FRDA iPSC，黄色；未受影响的人体组织，蓝色；人类细胞系，灰色。另请参见图S1和表S1-S3.

FRDA iPSCs的多功能标记物免疫染色（SSEA3和SSEA4；Oct4；Tra1-60和Tra1-81）也被发现与H1 ESCs相似(图1D). 基因分型FXN公司基因GAA•TTC重复序列和细胞遗传学分析表明，iPSCs确实来源于FRDA成纤维细胞，并且核型正常(图2A和S1B级)ChIP实验证实异染色质组蛋白标记靠近FXN公司GAA•TTC重复(Al-Mahdawi等人，2008年;Herman等人，2006年;Rai等人，2008年) (图S1C至E). 最后，畸胎瘤分析显示体内分化能力(图S1F)，为FRDA iPSC的多能性提供了额外的证据。

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GAA•TTC重复长度分析

(一个)PCR分析FXN公司细胞系、患者淋巴细胞和FRDA iPSC中的GAA•TTC重复长度。DNA长度标记以bp表示。通道如下（从左到右）：左侧面板：未受影响的GM15851和GM15850 FRDA淋巴母细胞；FRDA患者D淋巴细胞；GM03816 FRDA成纤维细胞；GM03816衍生iPS线1–4；无DNA控制（阴性）。中面板：GM04078 FRDA成纤维细胞；GM04078衍生iPSC（GM0478-iPS1）。右侧面板：GM03813 SMA成纤维细胞和两个相应的iPSC系（GM03813-iPS1和-iPS-2）。

（B）PCR产物FXN公司FRDA患者携带者父母的GAA•TTC重复区。左面板（从左到右）：母细胞成纤维细胞和三个相应的iPSC株。右侧面板（从左到右）：父代成纤维细胞和一个相应的iPSC系。

(C类)GAA•TTC在FRDA（GM03816-和GM04078-衍生）和SMA（GM031813-衍生）成纤维细胞和两个iPSC系中的两个不相关遗传位点重复。还显示了GM15851 FRDA淋巴母细胞的PCR产物。

(D类)FXN公司GAA•TTC重复长度PCR测量。从左至右：FRDA成纤维细胞（GM03816）、早期传代的FRDA iPSC（iPS6早期）和第15代的三个FRDA iPSC单集落样本（iPS6晚期a–c）。

FRDA iPSCs的全局mRNA表达谱

四个FRDA iPSC系（两个来自GM03816，两个来自于GM04078）与一组未受影响的iPSCs、hESCs和各种人类组织和细胞系的全球基因表达谱的层次聚类表明，我们的iPSC系与其他iPS/ESCs属于同一簇，尽管是在一个单独的、不同的子集中(图1E). 我们将这种差异归因于我们的FRDA iPSCs和其他iPS/ESCs之间的5-7%的全球表达差异，而在其他iPS/ECS之间只观察到2-3%的内部差异，这种差异可能反映了FRDA遗传背景的疾病性质。此外，使用FRDA iPSCs中顶级差异表达基因的注释、可视化和集成发现数据库（DAVID）进行功能注释聚类，确定了与线粒体功能、DNA修复和DNA损伤反应相关的基因组(表S1). DNA修复也出现在我们的数据集中，是一个重要的GO类别(表S2)与最近对FRDA患者的研究一致(Haugen等人，2010年). 其他重要的GO类别与细胞周期、蛋白质修饰/泛素化、脂质代谢和碳水化合物生物合成有关，所有这些以前都与FRDA患者的功能改变有关(科波拉等人，2006年;Haugen等人，2010年). 全球microRNA分析也表明FRDA iPSCs表达许多与多能性相关的miRNAs，但也发现了明显的差异，这可能也是由于FRDA发病机制所致(图S1G-H和表S3).

FRDA iPSC中的GAA•TTC重复扩增

PCR分析FXN公司GAA•TTC重复序列在iPSC细胞系中表现出重复不稳定性(图2A)供体成纤维细胞中未见这种现象（数据未显示）。未受影响的（GM15851）和FRDA（GM15850）淋巴母细胞以及无关患者DNA的PCR产物也显示出来进行比较。在所有情况下，观察到FRDA iPSCs的两个等位基因都有明显的扩增（以下给出了一些警告）。对第二名患者（GM04078）iPSCs的PCR分析同样显示重复扩增(图2A，中间面板），确认了该观察的一般性质。相反，野生型FXN公司非FRDA iPSC对照中的等位基因大小不变(图2A; 右侧面板，GM03813脊髓性肌萎缩iPSCs）和非疾病未影响的iPSCs（数据未显示）。由于PCR检测的等位基因模糊性，PCR带的移位可能代表两个等位基因的扩增或一个等位蛋白的收缩和另一个的扩增。因此，iPSCs是从第三个FRDA患者的携带者父母中产生的，并进行PCR分析，显示父母致病性等位基因重复扩增(图2B). 野生型FXN公司如预期的那样，等位基因没有扩增，表明致病性中存在性别中立的不稳定性FXN公司等位基因。与体细胞一样，GAA•TTC重复序列在两个不相关的基因座上扩增（2q36，16个重复；4q31.1，30个重复(Rindler等人，2006年))在我们的iPSC和它们相应的三个供体成纤维细胞之间保持不变(图2C)尽管这些位点位于Alu元素，与FXN公司内含子1。总之，数据表明FXN公司基因是其特定重复扩展（也许还有其长度）的结果，并不是整个人类基因组中的普遍现象。此外，我们发现FRDA iPSC中GAA•TTC重复长度在培养过程中随时间变化(图2D).

重复不稳定性的分子基础

先前的报告表明，HD和DM1（强直性肌营养不良I型）转基因小鼠的CAG•CTG和CTG•CAG体细胞和代际重复不稳定性中分别存在MMR酶MSH2、MSH3和MSH6（综述于(Dion和Wilson，2009年)). 其他研究表明氧鸟嘌呤-DNA糖苷酶OGG1与躯体不稳定有关(Kovtun等人，2007年). 在FRDA iPSCs中，mRNA表达分析显示MSH2型与供体成纤维细胞相比(图3A). 无差异MSH3型然而，mRNA被发现，并且OGG1公司在iPS/ESCs中发现了mRNA。Western blotting进一步显示，与FRDA成纤维细胞相比，FRDA iPSCs和H1 ESCs中MSH2蛋白相应增加(图3B). ChIP分析显示，与未受影响的iPSC株系相比，FRDA iPSCs中GAA•TTC重复序列下游MSH2和MSH3的占有率增加，但与未受感染的iPSC系相比，其上游MSH2与MSH3占比没有增加FXN公司转录起始位点也不是GAA•TTC重复序列的直接上游(图3C). 在所调查的任何地区，均未发现MSH6占用率的差异。

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MSH2型FRDA iPSC的表达和定位

（A） MSH2型,MSH3级、和OGG1公司GM03816成纤维细胞（白色）、两个GM03816iPSC系（iPS4，中灰色；iPS6，深灰色）和H1细胞（浅灰色）中的mRNA水平。级别标准化为GAPDH公司误差条=重复测量的SEM。

（B）MSH2蛋白的Western blot。从左到右：GM03816成纤维细胞、两个GM03816iPSC系（4和6）和H1-hESCs。GAPDH和L13a是装载控制装置。

（C）MSH2、MSH3和MSH6在FXN公司基因1254 bp上游的转录起始位点（−1254），上游（向上GAA）和下游（向下GAA）的GAA•TTC重复扩增（用ChIP测量）。IP恢复是相对于FXN公司内含子2（转录起始位点下游11482 bp）。误差线=独立实验的SEM（MSH2，n=4；MSH3和MSH6，n=2）。

为了进一步研究MSH2在重复不稳定性中的作用，将慢病毒shRNA构建物整合到单个克隆扩增的FRDA iPSCs中（以限制重复长度异质性），并检测GAA•TTC重复长度（总结为图4A). 如所示图4B-D，稳定表达MSH2型-与打乱的shRNA相比，靶向shRNA实现了相对较高水平的mRNA和蛋白质敲除。此外，我们验证了MSH2型沉默不影响多能性(图S2A). 经过八次传代后，重复长度PCR分析表明MSH2型与打乱的shRNA相比，击倒导致显著较小的大等位基因(图4E-G). 然而，根据汇总数据，与图1所示的单点数据相反，较小的等位基因没有观察到统计学意义图4E-F.shRNA沉默MSH2型在FRDA成纤维细胞中，重新编程也产生了类似的结果(图S2). 总之，这些数据表明MSH2参与GAA•TTC重复不稳定性。

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shRNA沉默MSH2型在FRDA iPSC中

（A）消声实验示意图。

（B） MSH2型靶向和干扰shRNA-表达FRDA iPSCs的mRNA水平。mRNA水平标准化为GAPDH公司误差条=重复测量的SEM。

（C）利用打乱的shRNA和靶向shRNA对FRDA iPSCs中MSH2蛋白进行Western blot。GAPDH，负载控制。

（D）MSH2蛋白的密度分析归一化为前一组的GAPDH。

（E）GAA•TTC重复序列长度的PCR预筛选（启动iPSC）和转导后8代，无shRNA（无shRNA）、干扰shRNA（干扰）和shRNAMSH2型（目标明确）。注：数据来自单点数据，不代表汇总数据（面板G）。

（F）面板E中乙二醇染色琼脂糖凝胶的信号强度痕迹。凝胶迁移越高，PCR条带越小。

（G）汇总GAA•TTC重复长度数据。请参见补充实验程序用于重复长度的定量。

另请参见图S2.

讨论

据我们所知，这是首次报道患者特异性多能干细胞发生三重重复不稳定性。先前的研究分析了疾病特异性iPSCs中的三倍体扩增，但要么没有比较供体成纤维细胞重复序列，要么iPSCs在重新编程后没有显示任何变化(Park等人，2008a;Urbach等人，2010年). 在我们的案例中，我们观察到重复扩张，可能类似于FRDA家庭的代际不稳定，只有一个例外。在患者家庭中，只有母亲致病性等位基因被报道发生代际扩展，而父亲等位基因通常保持相同长度或会收缩(Campuzano等人，1996年;Pianese等人，1997年). 然而，我们发现在多能干细胞中双亲致病性等位基因扩增。对这种差异的一种解释是，这两个等位基因在在体外与差异配子发生相对的重编程。

我们发现MSH2和可能的MSH3是参与重复扩增的成分，这一发现得到了之前对各种三联重复障碍的广泛研究的支持(Dion和Wilson，2009年). 脆性X综合征模型的早期研究表明MSH2是导致重复不稳定的成分(Kramer等人，1996年). 其他研究表明，MSH2在各种HD模型的代际和体细胞不稳定性中都起作用(Dragileva等人，2009年)，在DM1研究中也有类似的发现(Savouret等人，2003年). 沿着类似的路线，我们目前的结果表明MSH2是负责GAA•TTC重复扩增的蛋白质之一。虽然我们没有直接证据证明MSH2–MSH3复合物（MutSβ），但我们认为这种复合物对我们的病例负责，因为MSH2和MSH3不仅定位于致病性附近FXN公司等位基因，但其他研究也指出MutSβ的参与(Dragileva等人，2009年;Kim等人，2008年).

从机制上讲，对GAA•TTC重复不稳定性也存在争议，我们的结果与FRDA发病机制的几个模型一致(Ditch等人，2009年;Dragileva等人，2009年;Iyer和Wells，1999年;Shishkin等人，2009年). 一个模型提出了一个暴露的单链DNA发夹（类似于不匹配的DNA）的形成，发夹起源于一个由长GAA•TTC重复序列形成的三标记结构，该结构招募了MMR机制(威尔斯，2008). 然后，这种招募稳定了打滑的中间产物，导致重复扩张（参见(米尔金，2007年)). 或者，在FXN公司轨迹(de Biase等人，2009年)可以进行转录偶联的DNA修复和GAA•TTC重复道扩增(Ditch等人，2009年). 有趣的是，转录偶联修复已被证明与MutSβ复合物相互作用(Zhao等人，2009年)进一步支持了我们的观察结果。

目前，可以研究GAA•TTC扩展的模型系统很少(Al-Mahdawi等人，2004年;Ditch等人，2009年;Iyer和Wells，1999年;Shishkin等人，2009年). 尽管最近的一份报告揭示了人类疾病与其iPSC模型之间的细胞生理差异，并呼吁在将两者联系起来时要谨慎(Urbach等人，2010年)，这些关键差异可能高度依赖于上下文。在我们的案例中，我们预计FRDA iPSC将为研究重复不稳定机制以及分化为这种人类疾病中受影响的细胞类型（感觉神经元和心肌细胞）提供有价值、更容易获得的资源。这样的细胞模型将有助于剖析疾病机制和筛选潜在的治疗剂。

实验程序

细胞培养

成纤维细胞在37°C和5%CO下生长2MEM中含有10%FBS（Lonza）、2 mM谷氨酰胺、1%NEAA、20 mM HEPES和1%抗生素-抗真菌（均来自Invitrogen）。ES/iPSC在37°C和5%CO下生长2在D-MEM/F12中使用γ射线照射的MEF（GlobalStem）和20%敲除血清替代物、1 mM谷氨酰胺、1%NEAA、15 mM HEPES、0.1 mMβ-巯基乙醇（均来自Invitrogen）、20 ng/mL碱性FGF（Stemgent），每五至七天手动传代一次。在DMEM中用10%FBS（Lonza）、2 mM谷氨酰胺、20 mM HEPES和1%NEAA（均来自Invitrogen）培养Phoenix细胞。

原代成纤维细胞的分离

5–7天后，用纤维母细胞培养基在玻璃盖玻片下用纤维连接蛋白（fibronectin）对分离处理的皮肤活检进行皮肤外植体培养。建立后，按上述方法培养原代皮肤成纤维细胞。根据批准的人体试验方案，在洛杉矶加利福尼亚大学进行了活检。

病毒的产生

逆转录病毒使用凤凰细胞（W.Balch实验室的礼物）和Fugene6（Roche）包装。四个重编程向量((Takahashi等人，2007年);网址：www.addgene.org)分别包装并用VSV-G进行假型。将psPAX2和pMD2共同转染到293T细胞shRNA构建物中，产生慢病毒。转染后48小时内收集含病毒ES培养基上清液（参见补充实验程序).

iPSC的衍生

遵循之前的方法，但有轻微偏差(Park等人，2008b). 连续三天每天转导供体成纤维细胞，最后一次转导后4-6天，将细胞重新移植到MEF上。从第二天开始，每天给细胞注射ES培养基。在转导后21至28天之间采集菌落。

慢病毒shRNA转导

将FRDA iPSC与慢病毒进行两次慢病毒转导，并在37°C下使用5µg/mL聚brene过夜。然后对细胞进行扩增，并在DR4耐药MEF（GlobalStem）上进行6天的嘌呤霉素选择（0.4µg/mL）。

免疫细胞化学

将细胞固定在4%多聚甲醛中，并用0.1%Triton X-100（全部在PBS中）透化。一级抗体在4°C下培养过夜，二级抗体在室温下培养一小时，然后用DAPI进行核染色（参见补充实验程序用于抗体）。

核酸提纯

制造商称，使用RNeasy Plus Mini试剂盒（Qiagen）纯化总RNA。通过苯酚/氯仿萃取纯化基因组DNA，然后用异丙醇沉淀在总细胞裂解缓冲液中制备的细胞裂解物（100 mM Tris，5 mM EDTA，0.2%SDS，0.2 M NaCl，200µg/mL蛋白酶K，pH 8）。

PCR和定量RT-PCR

制造商表示，对于GAA•TTC重复长度PCR，使用了Phusion聚合酶（新英格兰生物实验室）。制造商称，定量RT-PCR分析使用qScript一步法SYBRGreen qRT-PCR试剂盒（Quanta Biosciences）进行。所有多功能标记的引物均如所述(Park等人，2008b).FXN公司,MSH2型,MSH3级,OGG1型、和GAPDH公司引物描述见补充实验程序使用ΔΔCT方法分析相对qRT数据(Livak和Schmittgen，2001年). 使用与上述试剂盒相同的试剂盒和先前描述的逆转录病毒转录特异性引物，通过绝对qRT-PCR检测逆转录病毒转基因(Takahashi等人，2007年). （请参见补充实验程序.)

西方分析

在聚丙烯酰胺凝胶中电泳全细胞提取物（50 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl，10%甘油，0.5%Triton X-100，蛋白酶抑制剂；罗氏），并转移到硝化纤维素膜上。一级抗体孵育过夜，二级抗体在室温下孵育一小时。使用HRP结合二级抗体和增强化学发光检测信号（SuperSignal West Pico，Thermo Scientific）。（请参见补充实验程序用于抗体。）

染色质免疫沉淀

首先用1.5 mM二硫代双琥珀酰亚胺丙酸盐（DSP）交联细胞，然后用1%甲醛交联。随后的ChIP程序如所述(Herman等人，2006年)MSH2抗体（Santa Cruz）。使用引物进行qPCR分析FXN公司启动子、GAA•TTC重复序列上游区域和重复序列下游区域如所述(Herman等人，2006年). 其他引物列于补充实验程序.

微阵列分析

根据制造商的要求，使用MirVana RNA提取试剂盒（Ambion）进行RNA纯化，使用TotalPrep试剂盒（Ambion）标记，并与Illumina HT12阵列杂交。然后对数据进行过滤、规范化和分层聚类(Eisen等人，1998年). 与一组未受影响的iPSC相比，差异表达的基因使用错误发现率校正的Student t检验进行检测，显著性水平为α财务总监< 0.01. 然后使用注释、可视化和集成发现数据库（DAVID(Dennis等人，2003年;Huang等人，2009年))显著性水平为α财务总监< 0.01.

亮点

  • FRDA iPSC保留了人类疾病的关键分子特征
  • 在与疾病相关的多能干细胞中观察到GAA•TTC重复不稳定性FXN公司基因
  • 重复不稳定性取决于错配修复酶MSH2

补充材料

01

单击此处查看。（160万，pdf）

致谢

我们感谢S.Perlman（加州大学洛杉矶分校）提供的皮肤活检，感谢I.Singec、J.Clark和C.Desponts提供的宝贵建议和指导。此外，我们感谢V.Lukiyanchuk的病毒专业知识、K.Clinerman的兽医协助以及C.Lynch的微阵列分析。这项工作得到了美国国家神经疾病和中风研究所（NIH）、弗里德雷希共济失调研究联盟（FARA）、英国共济失调协会（GoFAR）、爱尔兰弗里德雷奇共济失调学会（Friedreich’s Ataxia Society Ireland）和复制品公司（马萨诸塞州沃尔瑟姆）对J.M.G.的支持，也得到了来自脊髓肌萎缩家族（到s.K.）的研究金的支持。L.C.L.得到了美国国立卫生研究院WRHR K12职业发展奖和哈特维尔基金会的支持，G.A.和J.F.L.得到了CIRM（CL1-00502、RT1-01108、TR1-01250）、美国国立卫生研究院（R21MH087925）、Millipore基金会和Esther O'Keefe基金会的支持。M.N.得到了国家共济失调基金会和FARA“凯尔·布莱恩特翻译研究奖”的支持

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

加入人数

微阵列数据作为登录号存放在基因表达综合库中。GSE22651标准.

补充信息

补充信息包括两张图、三张表、补充实验程序，可在以下网站上找到http://www.cell.com/cell-stem-cell/supplemental/etc.

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