PPARδ是巨噬细胞中的一种极低密度脂蛋白传感器

摘要

流行病学研究表明，饮食脂肪（胆固醇和脂肪酸）摄入量的增加与西方社会肥胖、II型糖尿病和动脉粥样硬化的发病率和流行率的急剧上升有着密切的联系(1). 动脉粥样硬化病变是由脂肪条纹形成的，由于持续损伤血管壁而引起慢性炎症(2). 低密度脂蛋白（LDL）及其氧化产物氧化LDL（oxLDL）是导致血管内皮损伤的关键因素(三). 一旦循环单核细胞被招募到这些损伤部位，它们就会分化为常驻巨噬细胞，并通过其清道夫受体内化oxLDL。我们和其他人之前已经确定了两个核受体，过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）γ和肝脏X受体，它们在巨噬细胞中充当氧化低密度脂蛋白中氧化脂质的传感器(4–6). 事实上，PPARγ的激活导致两条途径的诱导，这两条途径有效地将培养巨噬细胞中oxLDL的摄取与胆固醇的流出耦合，表明PPARγ激活可能起到这一作用体内(7–9).

虽然LDL和oxLDL以前被认为是唯一对动脉粥样硬化形成重要的脂质颗粒，但最近对人类的研究已确定富含甘油三酯的脂蛋白，如极低密度脂蛋白（VLDL），是动脉粥样硬化性心脏病发病的额外危险因素(10,11). 人和兔动脉粥样硬化瘤中脂蛋白衍生甘油三酯的检测支持其在发病机制中的推测作用(12,13). 此外，残留颗粒（水解乳糜和VLDL颗粒）或甘油三酯已被证明可以预测人类冠状动脉疾病的程度和进展(14,15). 与这一观点一致，对高甘油三酯血症患者采用降低甘油三酸酯治疗可显著降低缺血性心脏病的发病率和死亡率(16). 尽管取得了这些临床进展，VLDL或其成分脂质促进大血管疾病进展的分子途径在很大程度上仍不清楚。

在这里，我们描述了巨噬细胞中由VLDL通过激活PPARδ驱动的转录途径。天然极低密度脂蛋白颗粒的转录活性成分是甘油三酯，甘油三酯可以通过脂蛋白脂肪酶的脂解作用释放。用VLDL处理WT巨噬细胞会导致甘油三酯积累和脂肪分化相关蛋白（ADRP）的诱导。值得注意的是PPARδ巨噬细胞中的基因完全消除了这种对天然VLDL的转录反应。总之，我们的工作已经确定了一种转录途径，通过该途径，掺入VLDL的膳食甘油三酯可以直接调节血管壁细胞中的基因表达。

材料和方法

结果

合成PPARδ激动剂的鉴定揭示了该受体在脂质代谢中的重要作用(19,20). 然而，对其核心生物功能至关重要的内源性信号通路知之甚少。因为我们之前已经证明oxLDL可以转录激活PPARγ，所以我们探索了其他天然脂蛋白颗粒可能构成类似PPARδ激活途径的可能性(4). 值得注意的是，VLDL在本次调查中成为报告系统中PPARδ的有效激活剂（图。​（图11A类). 这种活化是针对VLDL的，因为LDL和HDL颗粒都不会产生PPARδ活化。此外，VLDL的生理浓度（100μg/ml）接近合成PPARδ配体的最大功效，如卡前列环素（2μM）和GW 501516（0.1μM）（图。​（图11B类和数据未显示）。为了确定VLDL颗粒是否通过配体结合域（LBD）发挥作用，我们使用嵌合受体进行了瞬时转染试验，其中GAL4 DNA结合域（DBD）在框架中融合到PPARδ的配体结合区。正如预期的那样，VLDL有效地激活了GAL4-PPARδ融合（图。​（图11B类)表明VLDL颗粒可能是PPARδ配体的内源性来源。

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图1

PPARδ被VLDL粒子激活。(A类)VLDL粒子可激活全长PPARδ。使用AOx-PPRE在CV1细胞中进行三次瞬时转染实验_三荧光素酶报告子构建物（0.1μg）和CMX-PPARδ/CMX-RXRα表达载体（每个10 ng），如材料和方法将转染细胞培养在脂蛋白缺乏的FBS中，并用配体或脂蛋白处理24小时，然后收集用于报告基因分析。荧光素酶活性被归一化，以提高内部β-半乳糖苷酶对照的转染效率。(B类)VLDL粒子通过PPARδ的配体结合域激活。CV-1细胞与嵌合受体GAL4DBD-PPARδLBD和UAS共转染_三荧光素酶报告基因。随后用不同浓度的cPGI、VLDL或VLDL与10μg/ml LPL混合处理转染细胞。(C)VLDL反式PPARδ中存在甘油三酯。用GAL-PPAR（α、δ和γ）和UAS对CV-1细胞进行瞬时转染_三荧光素酶报告子。将甘油三酯与LPL（10μg/ml）混合在1%BSA中，然后添加到培养基中（最终浓度为50μM）。

VLDL是一种大的脂蛋白颗粒，由甘油三酯、游离和酯化胆固醇、磷脂和载脂蛋白组成(21). VLDL是一种富含甘油三酯的颗粒，将肝脏合成的甘油三酸酯输送到外周组织。在外周组织中，VLDL中的甘油三酯被LPL水解成脂肪酸，从而允许它们进入细胞(22). 因此，我们假设，如果VLDL颗粒的激活成分是其甘油三酯，那么与LPL共培养可以增强颗粒对PPARδ的反式能力。事实上，如图。​图11B类与LPL共培养大大增强了VLDL对GAL4-PPARδ的活性，在低剂量10倍VLDL（10μg/ml）时达到最大刺激。此外，为了确定正常存在于天然VLDL中的任何甘油三酯是否能够激活PPAR，我们接下来使用GAL4-PPAR（α，δ，γ）嵌合受体对所有三种PPAR亚型进行了不同甘油三酸酯的系统筛选。值得注意的是，不同链长的甘油三酯与LPL的共孵育表明，单不饱和或多不饱和甘油三酯都是GAL4-PPARδ和GAL4-PPARα的有效激活剂，但不是GAL4-PPARγ的有效激活剂（图。​（图11C). 最后，尽管用甘油三酯和LPL处理细胞可以重现VLDL/LPL对PPARδ的转录反应，但我们不能排除富含甘油三酯的残余脂蛋白（VLDL脂解的残余产物）也可能激活该受体的可能性。

利用ES细胞对PPARδ在介导巨噬细胞VLDL信号中的作用进行了遗传学分析。我们生成了PPARδ-通过重新定位先前建立的WT等位基因使ES细胞无效PPARδ杂合ES细胞系（克隆IIIA4）(23). 重定目标构造包含了lacZ公司DNA-结合域第一个锌指的上游基因，在lacZ公司和一个短的N末端片段PPARδ（图。​（图22A类). 第二等位基因的同源重组PPARδ经Southern blot分析证实（图。​（图22B类). 为了研究PPARδ在巨噬细胞基因表达中的调节作用，我们使用在体外ES细胞分化试验产生WT和PPARδ阴性巨噬细胞(18). 如图所示。​图22C，两者都是PPARδ^+/+和PPARδ^−/−根据细胞形态和髓细胞表面标记物的表达判断，ES细胞同样能够分化为巨噬细胞，如F4/80、FcγRII/FcγRAII和CD11b/CD18(24).

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图2

PPARδ缺陷ES细胞和巨噬细胞的生成。(A类)生成的目标方案PPARδ空ES单元格。G418-敏感ES细胞克隆IIIA4(23)由WT杂合细胞组成PPARδ等位基因（+，底部)和一个空的“floxed-out”等位基因（−，顶部)或有条件的“floxed”等位基因（ck，未显示）。此克隆已使用包含lacZ公司基因敲入，破坏PPARδ第一锌指DNA结合基序的上游（lz，中部). 每个等位基因下方的花纹条代表了对生态当用3′-外部探针探测时，RI侧翼的DNA片段。限制地点：E，生态RI；不，Nhe公司一、(B类)PPARδ阴性ES细胞的Southern blot分析。通过重新定位IIIA4细胞产生的单个子克隆包含不同的双等位基因组合PPARδ：WT和新引入的lacZ敲除等位基因的细胞杂合（+/lz；第1道）；两个G418-抗性克隆携带原始IIIA4等位基因组合ck/+和+/-（分别为第2和第3道）以及neoR基因可能的非同源整合；以及本研究中功能分析的PPARδnull ES克隆（lz/−，车道4；*），其中里兹等位基因整合代替克隆IIIA4的剩余WT等位基因。使用5′外部探针（未显示）进一步确认等位基因身份。(C)FACS分析PPARδ^+/+和PPARδ^−/−ES细胞源性巨噬细胞。巨噬细胞由ES细胞产生，如材料和方法WT或PPARδ阴性巨噬细胞用指示的抗体（深灰色）或同型对照（浅灰色）染色。巨噬细胞表面标记物包括F4/80、Mac-1（CD11b/CD18）和2.4G2（FcγRII/FcγRAII）。Gr.1（Ly-6G）是粒细胞谱系特异性标记，此处用作阴性对照。

我们之前已经描述了巨噬细胞中的脂质循环，其中oxLDL的成分激活PPARγ并诱导清道夫受体CD36和氧化甾醇受体肝X受体α（LXRα）的表达(7,25). 因为PPARγ和PPARδ在其DNA结合域中具有高度同源性(26)，我们期望PPARδ也能转录调控这些基因。然而，令我们惊讶的是，对WT和PPARδ阴性巨噬细胞的基因表达分析显示，与PPARγ不同，PPARδ激活不会显著诱导CD36或LXRα（数据未显示）。因此，我们接下来试图确定PPARδ是否参与调节与VLDL代谢相关的基因子集。各种细胞蛋白，包括细胞表面受体和LPL，调节VLDL的摄取和清除(27). 虽然WT ES细胞源性巨噬细胞表达低水平的VLDL受体，但在使用PPARδ或PPARγ配体治疗时未观察到该基因的诱导。相反，VLDL受体基因的表达在PPARδ缺失的巨噬细胞中显著诱导（图。​（图3），三)表明该基因被PPARδ直接或间接抑制。此外，VLDL受体基因的诱导是特异性的，因为乳糜微粒残留受体（LRP1）和低密度脂蛋白受体（LDLR）在WT和PPARδ^−/−巨噬细胞。最后，尽管LPL在两种基因型的巨噬细胞中都有大量表达，但VLDL巨噬细胞的脂质负荷以PPARδ无关的方式下调其表达（图。​（图3），三)建议监管部门可能参与SREBP(28,29). 总之，这些数据表明，通过感知脂蛋白颗粒中的不同成分，PPARγ和PPARδ协调不同的转录反应来调节巨噬细胞的脂质代谢。

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图3

在PPARδ缺失的巨噬细胞中显著诱导VLDL受体。WT或PPARδ^−/−ES衍生的巨噬细胞用载体、罗格列酮（1μM）、GW 501516（0.1μM）或极低密度脂蛋白（50μg/ml）处理24小时。总RNA（5μg）通过Northern印迹分析³²P标记的cDNA探针。通过与K-FABP cDNA探针杂交，在每条通道中都有等量的完整RNA。

用VLDL/LPL组合治疗分化的巨噬细胞或各种其他细胞类型会导致由甘油三酯和酯化胆固醇组成的细胞质脂滴的积聚（数据未显示）。因为ADRP已被证明与各种细胞类型中的小脂滴有关(30)接下来，我们评估了用VLDL/LPL组合加载细胞是否会导致ADRP向脂滴募集。在这些研究中，将HA-ADRP瞬时转染CV-1细胞，并在VLDL/LPL负载后跟踪HA-ADRP的细胞质分布。如图所示。​图44A类在未经处理的CV-1细胞中，HA标记的ADRP具有非特异性染色模式。然而，转染CV-1细胞的VLDL/LPL处理导致HA标记的ADRP重新分布到离散的油红O阳性液滴上（图。​（图44A类和数据未显示）。接下来，我们试图确定VLDL激活PPARδ是否导致分化巨噬细胞中ADRP基因的诱导。事实上，用合成的和天然的PPARδ配体处理WT或PPARγ阴性巨噬细胞可显著诱导ADRP mRNA（图。​（图44B类). 相反，在PPARδ阴性巨噬细胞的配体处理中未观察到ADRP表达的变化，这明确表明巨噬细胞中的内源性PPARδ基因介导了对VLDL颗粒的转录反应（图。​（图44B类).

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图4

VLDL和PPARδ调节ADRP的表达。(A类)VLDL/LPL脂质负荷导致胞质ADRP的重新分布。将含有HA标记的小鼠ADRP的表达载体转染到培养箱载玻片上生长的CV-1细胞中。用VLDL/LPL处理24小时后，用抗HA抗体对细胞进行染色，并用FITC-偶联二级抗体进行观察。(B类)PPARδ和VLDL调节巨噬细胞中ADRP的表达。用cPGI（2μM）、GW 501516（0.1μM）或VLDL（25μg/ml）处理WT、PPARδ或γ阴性巨噬细胞24小时(C)PPARδ的异位表达赋予细胞VLDL反应性。用载体、cPGI（2μM）、LG 268（0.1μM）或VLDL（100μg/ml）处理NIH载体和NIH-PPARδ细胞24小时。用Northern blots和³²P标记的cDNA探针。

确定了PPARδ对介导巨噬细胞中VLDL颗粒的转录反应至关重要，我们接下来试图确定PPARδ的异位表达是否足以进行这一过程。在这些实验中，使用逆转录病毒载体（Babe-PPARδ）在NIH 3T3细胞中表达PPARδ。用PPARδ配体卡前列环素（cPGI）、维甲酸X受体（RXR）特异性配体LG268或VLDL处理对照细胞对ADRP的表达没有影响（图。​（图44C). 相比之下，用cPGI、LG268或VLDL处理NIH-PPARδ细胞可强烈诱导ADRP（图。​（图44C)表明PPARδ的强制表达足以赋予VLDL颗粒的转录反应性。

为了确定ADRP基因是否是PPARδ/RXR异二聚体转录调控的直接靶点，我们对小鼠ADRP启动子进行了瞬时转染实验。含有2.1 kb ADRP近端启动子的报告构建体在RAW 267.4细胞中被合成和天然PPARδ配体有效激活（图。​（图55A类). 对响应启动子片段的序列分析揭示了潜在的DR-1元件，这是PPAR/RXR异二聚体的优选结合位点(31)，介于−2004年至−1992年bp之间（图。​（图55A类). 与该元素可能通过PPARδ介导ADRP诱导的概念一致，在−2004和−1862 bp之间删除该区域，但在−1951和−862 bp之间没有删除相邻区域，从而消除了启动子对配体PPARδ/RXR异二聚体的反应（图。​（图55 A类和B类). 凝胶迁移率变化分析表明，所有三种PPAR亚型均可与ADRP启动子的DR-1 PPRE结合。PPARγ/RXRα和PPARα/RXRβ异二聚体对ADRP PPRE的这种结合与观察到的其他细胞类型中PPARγ和PPARβ配体对该基因的调节一致（参考文献。32–34和数据未显示）。与过量未标记探针的竞争进一步确立了PPAR/RXR异二聚体结合的特异性。此外，ADRP PPRE的突变消除了配体PPARδ/RXRα异二聚体的结合和激活（图。​（图55 A类和B类). 用含有异源启动子上游ADRP PPRE三个拷贝的报告基因进行瞬时转染实验_三-TK-Luc）证实，所识别的元素与对照报告物（AOx PPRE）一样被有效激活_三-TK-Luc）通过PPARδ/RXR异二聚体体内（图。​（图55C). 最后，为了评估内源性PPARδ和VLDL/LPL是否足以激活ADRP启动子，我们使用一个−2065-bp的报告基因构建物进行了瞬时转染分析PPARα^−/−或PPARδ^−/−小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。如预期，转染PPARα^−/−表达PPARδ的MEF（数据未显示）与合成的PPARδ配体和VLDL/LPL组合均导致报告基因的强烈激活（图。​（图55D类). 相反，无论是合成配体还是VLDL/LPL组合，都不能对PPARδnull MEF中的ADRP启动子进行反式作用（图。​（图55D类). 这很容易被PPARδ的外源性表达所挽救，进一步证明内源性PPARδ足以介导VLDL对ADRP启动子的转录作用。

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图5

ADRP启动子是VLDL和PPARδ/RXR异二聚体直接调控的靶点。(A类)ADRP启动子含有一个PPRE。包含WT、点突变和ADRP启动子内部缺失的报告结构的示意图。潜在的PPRE位于ADRP启动子的−2004和−1992 bp之间。凝胶迁移率变化分析使用在体外翻译蛋白和³²P末端标记的ADRP和酰基辅酶A氧化酶（AoX）PPRE寡核苷酸。PPARα/RXR、PPARδ/RXR和PPARγ/RXR异二聚体可与ADRP PPRE结合。未标记的PPRE寡核苷酸或非特异性DNA用于指示的摩尔过量，以执行竞争分析。ADRP PPRE（M1）5′半位点的点突变消除了PPARδ/RXR异二聚体的结合。(B类)PPARδ/RXR异二聚体对ADRP启动子起反作用。用ADRP报告体（0.1μg）和CMX-PPARδ/CMX-RXR表达载体（10 ng）共同转染RAW 264.7细胞，如材料和方法用配体（2μM cPGI、0.1μM LG 268、2μM cPGI+0.1μM LG 268和VLDL（25mg/ml）/LPL（10mg/ml））处理转染细胞24小时，然后收集用于报告基因测定。(C)ADRP PPRE是一个功能性PPARδ响应元件。在TK萤光素酶报告基因上游克隆了三个拷贝的ADRP或AOx-PPRE。CV-1细胞与报告者和受体表达载体共转染，并分析荧光素酶活性，如B类. (D类)内源性PPARδ和VLDL对ADRP启动子起反作用。瞬时转染实验在PPARα^−/−和PPARδ^−/−含有ADRP基因近端启动子（2065 bp）的荧光素酶报告子构建的MEF。

讨论

尽管VLDL和血清甘油三酯是已知的冠心病的额外危险因素，但它们如何调节巨噬细胞反应和病变进展尚不清楚。这里的数据表明，PPARδ介导巨噬细胞对天然VLDL的转录反应。VLDL对PPARδ的转录激活导致ADRP基因的诱导，这可能允许损伤巨噬细胞储存过量的甘油三酯。与此一致，巨噬细胞中PPARδ基因的缺失完全消除了VLDL对ADRP基因的诱导。结合我们之前的研究，这些数据表明，与PPARγ相反，PPARγ对oxLDL中存在的氧化脂肪酸作出反应(4)，PPARδ作为VLDL颗粒中甘油三酯的传感器。

VLDL由肝脏合成和分泌，将甘油三酯和胆固醇运输至周围组织(22). VLDL颗粒中作为甘油三酯部分存在的脂肪酸的组成密切反映了肝脏中预先形成的脂肪酸库(35,36). 这些预先形成的脂肪酸要么近似来自饮食摄入(37)或从胰岛素抵抗状态下的脂肪组织中动员的脂肪酸池，如II型糖尿病(38,39). 由于PPARδ和PPARα都被VLDL颗粒中的甘油三酯激活，因此它们的独特功能可归因于肝脏中PPARα的表达和外周组织中PPARδ的表达。因此，我们的研究结果表明，VLDL对PPARδ和PPARα的偶联激活将使细胞对输入的脂肪酸和甘油三酯产生协调的反应。例如，VLDL激活PPARδ可能促进作为ADRP包被脂滴的甘油三酯的“短期”储存，而PPARα的刺激将导致脂肪酸氧化中重要的诱导基因(40,41). 这种对VLDL的耦合反应可以有效地靶向细胞质脂质滴中的甘油三酯，使其在过氧化物酶体和线粒体中氧化。与这一概念一致的是，用CPT-1抑制剂埃托莫西尔和线粒体脂肪酸氧化途径治疗大鼠，导致细胞质脂质积累和ADRP的诱导(42)进一步提高了脂滴相关蛋白参与脂质细胞质转运的可能性。在这方面，我们最近发现了紫苏素，它在脂质的“长期”储存中起着关键作用(43,44)，作为脂肪细胞中的PPARγ靶基因（未显示数据，AC和RME）。

除人类流行病学研究外，最近在动脉粥样硬化小鼠模型中的实验发现，VLDL水平高的动脉粥样硬化易感性增加。例如，当LDLR^−/−用不同成分的饮食对小鼠进行挑战，发现动脉粥样硬化斑块负荷与提高血清VLDL水平的饮食之间存在线性相关性(45). 由于这种紧密的相关性明显独立于其他脂质参数，如血清LDL和HDL，这表明VLDL颗粒激活PPARδ可能会增加动脉粥样硬化斑块的脂质含量。然而，PPARδ对动脉粥样硬化过程的真正贡献很难预测。一方面，外周组织对VLDL和甘油三酯颗粒的清除受损，如II型糖尿病患者，可能导致损伤巨噬细胞中该受体的病理激活，并加重动脉粥样硬化。另一方面，PPARδ配体对UCP3和PDK4等基因的药理学诱导（Y.Wang和R.M.E.，未发表数据）可以增强外周组织中富含甘油三酯的脂蛋白颗粒的摄取和清除，并夺走其致动脉粥样硬化底物的生长病变。因此，未来需要在含有PPARδ激活剂或PPARδ缺陷骨髓的动脉粥样硬化小鼠模型中进行研究，以阐明该受体在血管疾病中的作用。

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