函数变量的增益GLUD2公司谷氨酸脱氢酶修饰帕金森病发作

摘要

介绍

帕金森氏病（PD）影响约1.8%的65岁以上人群。¹临床特征为震颤、僵硬和运动迟缓，常伴有姿势和步态障碍。²约80%的PD病例是散发性的，男性发病率高于女性（比率=1.5:1）。

帕金森病的病因在很大程度上仍然未知，尽管环境毒素与遗传易感性的相互作用可能是可行的。这一基因假说得到了基于社区的研究的支持，研究表明，相当多的帕金森病患者的亲属也受到同样的影响。^三,4我们在克里特岛进行的PD研究也揭示了这一点，⁵一个拥有约60万人口的岛屿，拥有相同的基因和文化背景以及共同的环境。此外，本研究提出了PD的寡基因模型，根据该模型，来自两个或多个基因的疾病传播等位基因需要存在于同一个体中，才能表达该疾病。

关于帕金森病的病理生理学，人们提出了一些假设，试图解释这种疾病中多巴胺能神经元的退化。其中一项表明线粒体功能障碍，⁶最近发现的由线粒体蛋白或线粒体相互作用蛋白突变引起的单基因型PD支持了这一论点。⁷然而，这些突变通常在常见的、大多是散发的疾病中没有发现。

另一种理论认为，谷氨酸对突触后兴奋性受体的过度作用⁶这是罪魁祸首，但时至今日，谷氨酸兴奋性毒性在人类退化中的病因学作用仍不明确。据报道，神经退行性疾病患者的谷氨酸代谢异常，⁸包括PD，⁹提高了涉及这种氨基酸的代谢缺陷的可能性。其中一些患者改变了谷氨酸脱氢酶（GDH）的活性并提高了其热稳定性，¹⁰中脑多巴胺能神经元中表达的线粒体酶¹¹催化谷氨酸氧化。

然而，在总账1编码上述疾病中家政哺乳动物GDH（人类中的hGDH1）的基因，最近的研究表明，人类和猿类还获得了一个X连锁GLUD2公司编码GDH高度同源不耐热亚型的基因。这种新型hGDH2具有独特的调节特性和表达模式，主要存在于视网膜、大脑和睾丸中。^12,13根据这些发现，我们通过研究GLUD2公司来自不同遗传背景的两个不同人群的PD患者的基因。结果显示，Ser445Ala罕见多态性的半合子个体比其他基因型的PD患者早6-13年发生PD。以重组形式获得的Ala445-hGDH2突变体显示出更强的基础催化功能和对雌激素抑制的敏感性。结果详细如下。

患者和方法

结果

我们研究了808名PD患者：584名来自希腊，224名来自加利福尼亚州中部。希腊组包括来自克里特岛的281名PD患者和来自希腊中部的303名PD患者。如所示表1希腊帕金森病合并样本和美国帕金森病队列的人口统计学和临床数据具有可比性。然而，家族性帕金森病在希腊比在美国更常见(表1). 此外，尽管“混合型”帕金森病在希腊患者中更为常见，但“运动性-刚性”帕金森氏病在美国患者中更常见(表1). 在这方面，希腊组在发病6–7年后确定PD类型，美国组在诊断后1–3年确定PD类型。因此，这些数据与帕金森病的自然历史相一致，随着时间的推移，帕金森病往往变得更为复杂。

整个的排序GLUD2公司克里特岛199例PD患者的基因，包括其启动子区，导致在编码区内鉴定出两个单核苷酸多态性。第一种是一种常见的非同义性改变（G103A），导致Arg取代了先导肽中的Gly35，出现在16.7%的PD染色体上(n个=287）和18.3%的控制染色体(n个=104;P（P）=0.836). 这种G103A多态性与帕金森病患者的表型特征（包括发病时的年龄）没有显著的相互作用（数据未显示）。第二个是非同义变化（T1492G），导致hGDH2调节域中的Ser445被Ala替代（补充图1）。

克里特岛帕金森病患者的研究(N个=281）表明，携带G等位基因的男性患者在50.0±6.98岁时发生PD，而其他T1492G基因型的患者在64.62±10.2岁时发病（平均±SD；P（P）<0.01). 此外，对希腊中部一组独立的PD患者进行的研究重复了这些结果，结果表明G半合子患PD的年龄比其他基因型的PD患者年轻。在合并的希腊PD队列中(N个=584），具有G等位基因的男性PD患者比G/T杂合女性早13.1年出现PD症状(P（P）<0.001,表2). 此外，G等位基因男性患者比T等位基因患者早9.4年发生PD(P（P）=0.003），比T/T基因型女性PD患者早8.3年(P（P）=0.01). 北美帕金森病样本分析(N个=224）还显示G半合子比G/T杂合子早13.1年发生PD(P（P）<0.05). 然而，尽管具有G等位基因的美国男性PD患者比具有T和T/T基因型的PD患者分别早6.1年和7.4年发生PD，但这些差异在统计学上并不显著(表2). 因此，在希腊组合组和美国队列中，当G半合子个体与G/T杂合子个体进行比较时，平均年龄差异更大（13.1岁）。希腊和美国帕金森病组的分层数据显示，性别并不影响帕金森病的发病年龄。此外，帕金森病临床类型（运动性、震颤性或混合性）与Ser445Ala多态性没有显著交互作用(表1).

T1492G多态性的频率在所有研究人群中都很少见，G等位基因在希腊帕金森病合并队列中的出现率为3.6%(N个=584）和4.3%的美国PD组(N个=224）（补充表1）。在这方面的分布没有发现显著差异GLUD2公司PD患者和对照组之间的变异。此外，在家族性PD和散发性PD患者中，检测到的多态性（T1492G）的频率具有可比性。在G半合子家族性PD病例中，我们发现一名52岁的男性患者，年龄40岁，患有PD，他从未受影响的母亲那里继承了1492G等位基因。他的父亲（携带1492T等位基因）在62岁时患上了典型的左旋多巴反应性PD，75岁时死于疾病（补充图2）。

突变型Ser445Ala的表达GLUD2，以及野生型GLUD2公司和总账1Sf21细胞中的基因产生催化活性酶。纯化至同质性的重组蛋白的功能分析（补充图3）表明，Ala445-hGDH2变异体显示出比野生型hGDH2大得多的基础特异性活性(图1). 酶浓度约为5μg/ml，Ala445-hGDH2变异体的基础比活性接近野生型hGDH1(图1). 然而，与野生型hGDH1相比，Ala445-hGDH2变异体的基础活性对GTP的抑制具有抵抗力(表3). 此外，出乎意料的是，Ser445Ala hGDH2变异体对雌激素（IC）的抑制非常敏感₅₀±SE=19±5 nmol/l DES）与野生型家政hGDH1（IC₅₀±SE=1530±46 nmol/l DES；P（P）<0.001) (表3，补充图4）。当变异酶被0.1 m ADP或1.0 m ADP激活时，这种对雌激素的敏感性也很明显（补充图5和6）。此外，与野生型hGDH2相比，Ser445Ala的变化增加了变体的热稳定性（补充图7）。

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图1

纯化重组Ala445-hGDH2、hGDH2和hGDH1的基础特异性活性。在没有变构效应物的情况下，在25°C下进行分析。每个点代表三到五次实验测定的平均值±SEM（bar）。每个回归线的斜率（±SE）如下所示，作为比活性的变化率（inμ摩尔/分钟/毫克）/μg酶浓度增加。这个R（右）相关系数和P（P）-值（概率R（右）括号中给出了线性回归的。Ala445-hGDH2的斜率：6.06±0.52(R（右）=0.986,P（P）=0.0003). hGDH2的斜率：1.56±0.23(R（右）=0.940,P（P）=0.0005). hGDH1的斜率：−0.76±0.57(R（右）=−0.556,P（P）=0.251).

讨论

在这项研究中，我们报告了一种罕见的变体（T1492G）GLUD2、，编码hGDH2的X连锁基因是一种在大脑中表达的亚型，在两个不同遗传背景的人群中与PD发病时的年龄显著相关。因此，对584名希腊患者的基因型分析表明，1492G半合子比携带T淋巴细胞的患者早8-13年发生PD(P（P）=0.003），G/T(P（P）<0.001）或T/T(P（P）=0.01）基因型。在北美人群中(N个=224），1492G半合子也比其他基因型的受试者早发生PD，但只有当G半合合子与G/T杂合子比较时，平均年龄差异才达到统计学意义（平均年龄差异：13.1岁，P（P）<0.05). 因此，尽管目前的关联数据对于希腊样本来说是令人信服的，但对于美国队列来说，它们的关联性略弱。这可能是因为美国样本较小，因为检测到的多态性（T1492G）在所研究的人群中很少出现（希腊和美国样本中约为4.0%）。目前尚不清楚T1492G多态性在美国帕金森病组中的较弱影响是否与两个队列中用于确定帕金森病患者年龄的不同方法有关，或与其独特的遗传背景有关。在希腊样本中，发病年龄被认为是患者首次出现PD症状的年龄，而在美国队列中，这是患者被其医生诊断为PD的年龄。我们的数据显示，希腊组的平均发病年龄为63.5岁，而美国组的平均诊断年龄为68岁，这与之前基于社区的研究结果一致。^21,22尽管T1492G多态性在美国帕金森病样本中显示出较弱的影响，但在两个帕金森病队列（6-13岁）中，1492G等位基因男性和其他基因型受试者之间观察到的平均年龄差异是相似的。因此，检测到的趋势是GLUD2公司在较小的美国队列中的多态性支持了T1492G变异体与PD发病年龄相互作用的论点。观察到的差异不能归因于性别，因为对整个PD样本的分析表明，在PD发展过程中，性别和年龄之间没有交互作用。当将1492T等位基因的T半合子与纯合子或杂合子的雌性进行比较时，情况也是如此。

由于我们的研究评估了三个独立招募的PD队列并进行了盲目分析，因此检测出的关联与确定和其他偏见极不可能相关。在所研究的人群中，所有四种T1492G基因型的频率在PD患者和对照组中的分布相似。因此，这些数据既没有显示G等位基因与PD的正相关也没有显示其负相关，这与该DNA变异在所研究的PD人群中的随机发生相一致。

这些基因型数据揭示了非同义词T1492GGLUD2公司这种变化加速了PD的开始（可能在易感个体中），表明Ala445-hGDH2的存在加速了PD神经退行性变。用Ala替代Ser445获得的变异酶显示出了更高的基础活性和热稳定性，因此表明它具有获得功能的特性。这些发现如何与已知的GDH功能和PD发病机制的流行模型相一致？

哺乳动物GDH是一种线粒体酶，显示出广泛的组织分布（内务管理），已知受化学异构化合物的变构调节。²³在已知的内源性负性调节剂中，GTP对控制谷氨酸通过GDH途径的流量很重要，这一发现强调了调节性显性突变（减弱GTP抑制作用）对谷氨酸代谢的影响总账1由于酶的过度活性（获得功能效应），基因导致临床综合征。²⁴雌激素也被认为是哺乳动物家政GDH（人类的hGDH1）的负性内源性调节剂，但这些影响需要微摩尔浓度，²⁵不太可能发生体内然而，野生型hGDH2虽然与野生型hGDH1高度同源，但受到不同机制的调节。¹⁹这项研究意外地发现，这些机制使得野生型hGDH2和Ala445-hGDH2-变异体对雌激素的抑制敏感。

有证据证明²⁶那个总账1在<2300万年前被逆转到X染色体上，由此产生GLUD2公司通过随机突变和自然选择。这些突变为这种新型酶提供了独特的特性，被认为有助于其在神经系统特定环境中发挥作用。hGDH2已从GTP控制中分离出来（通过Gly456Ala变化），²⁷主要受ADP/-亮氨酸水平升高的调节。hGDH2对GTP的抵抗可能使脑酶代谢神经递质谷氨酸，即使GTP因高TCA循环活性而累积²⁸谷氨酸能突触。相反，为了实现这些激活剂的全范围调节，hGDH2需要将其基础活性设定在低水平（约为全容量的4-8%），这一特性在很大程度上是由进化的Arg443Ser变化赋予的。²⁹因此，检测到的Ser445Ala变化改变了一种对hGDH2的严格调控至关重要的性质。¹³

二级结构预测程序预测Ala替代Ser445³⁰稳定小á-天线的螺旋线。hGDH1中Ser445Leu的变化也有类似的稳定作用。³¹丙氨酸和亮氨酸都被认为更好á-螺旋比丝氨酸形成。³²稳定α-螺旋将有利于开口构象，从而抵消hGDH2进化中Arg443Ser变化的能力，以最小化基础活性。因此，Ser445Ala的改变可能赋予hGDH2功能增益属性。

由于酶的正常功能尚不清楚，过度活跃的hGDH2变异体改变PD发病的机制尚不清楚。然而，代谢结果可能类似于HI/HA综合征中观察到的结果，其中谷氨酸氧化增强（由过度活跃的hGDH1突变体引起）增加了ATP生成，并减少了参与尿素合成的谷氨酸库。³³在大脑中，谷氨酸分布在多个池中，³⁴它的维持需要运输系统和代谢酶的操作，包括GDH。而大脑中的谷氨酸氧化主要通过转氨酶进行，³⁵GDH催化的反应在强烈的兴奋传递条件下具有重要意义。在病理条件下（如鱼藤酮对PD的毒性模型），谷氨酸氧化的脑线粒体产生的ROS量增加。³⁶因此，Ala445-hGDH2增加谷氨酸氧化可能通过改变大脑中谷氨酸的分区代谢和/或增加ROS的产生，加速PD中正在进行的退行性过程。

虽然这种功能获得假说很难解释目前的数据，即G/T杂合子在年轻时不受PD影响，而G半合子在，我们对酶调节的观察出乎意料地表明，雌激素激素抑制X连锁Ser445Ala变异体增强的基础活性比广泛表达的hGDH1的基础活性强得多，如上所述。因此，在女性患者中，雌激素可能通过阻止过度活跃的变异酶代谢增加的谷氨酸（在此过程中，破坏黑质细胞），抵消男性患者中观察到的功能增强效应。了解Ser445Ala-hGDH2变体加速PD症状开始的机制可以为延缓这种疾病的发展提供一种手段。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

脚注

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