VRC01抗体广泛有效中和HIV-1的结构基础

摘要

成功的疫苗开发通常利用自然感染引起的体液反应的线索。对于HIV-1，在感染的前一两年内引发的中和抗体反应通常是菌株特异性的(1)在未感染的个体中模拟这些反应不太可能防止不同病毒株的感染(2)]. 由于从HIV-1感染者中选择的少数单克隆抗体可以有效中和许多HIV-1毒株，因此已通过定义广泛中和抗体的结构来促进疫苗设计。通过对其识别表位的原子级表征，可以产生类似高度保守病毒结构的免疫原，并引发类似于原始抗体的免疫反应(三-4).

经过充分研究的广泛中和性抗HIV-1抗体2G12、2F5、4E10和b12具有不寻常的特征，对在人类中诱发类似抗体构成了障碍(5). 因此，除了具有广泛的中和能力外，适当的抗体应该以高滴度存在于人体中，因为这提供了证据，证明这些抗体可以在有用的浓度下诱导产生。为了鉴定这种抗体，我们和其他人从感染者的血清中筛选了一组血清，不仅发现了广泛的中和反应，而且确定了在相当大比例的受试者中可检测到的抗体的特征(6-10). 一种满足这些标准的抗体反应是针对HIV-1 gp120包膜（Env）糖蛋白上CD4附着位点的(8).

虽然CD4结合位点具有潜在的可获得性，但通过聚糖和构象掩蔽保护其免受体液识别(11). 为了鉴定针对该位点的单克隆抗体，在一份配套手稿中，我们创建了表面修饰、构象稳定的探针，对gp120上CD4附着的初始位点具有抗原特异性，并且我们使用这些探针来鉴定中和大多数病毒的抗体(12). 在这里，我们分析了其中一种抗体VRC01与来自分支a/E重组菌株的HIV-1 gp120核心的复合物的晶体结构。我们破译了VRC01中和的基础，确定了自然抗性的机制，展示了VRC0l如何最小化这种抗性，并定义了亲和力成熟在gp120识别中的作用。这些分子细节有助于指导VRC01样抗体从基因组重排到亲和成熟到有效中和HIV-1的成熟。

CD4和VRC01抗体对Env识别的相似性

为了了解VRC01中和的结构，我们将VRC01的抗原结合片段（Fab）与来自分支a/E重组体93TH057的HIV-1 gp120复合物结晶(13). 结晶的gp120由其内部结构域-外部结构域核心组成，可变环V1/V2和V3以及N端和C端被截断，我们之前发现这些区域远离gp120包膜糖蛋白的主体(14). 正交晶体中每个不对称单元含有四个VRC01-gp120络合物副本，衍射分辨率为2.9º，通过分子置换解决结构，并将其R值细化至24.4%（R_自由的25.9%）(图1和表S1) (15).

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图1

抗体VRC01与HIV-1 gp120复合物的结构

天然人类抗体有效识别HIV-1的原子级细节用带状表示的多肽链描述。gp120内部结构域显示为灰色，桥接片显示为蓝色，外部结构域显示为红色，除了CD4结合环（紫色）、D环（棕色）和V5环（橙色）。VRC01抗原结合片段（Fab）的轻链以浅蓝色显示，互补性决定区（CDR）以深蓝色（CDR L1）和海蓝（CDR L3）突出显示。Fab VRC01的重链以浅绿色显示，CDR以青色（CDR H1）、绿色（CDR H2）和淡黄色（CDR H3）突出显示。VRC01的轻链和重链都与gp120相互作用：主要的交互表面由CDR H2提供，CDR L1和L3以及CDR H1和H3提供额外的触点。

VRC01和gp120之间的交互表面几乎覆盖2500°², 1244 ŲVRC01和1249²通过gp120(16). 在VRC01上，两个重链（894Ų)和轻链（351º²)有助于接触面(表S2)，重点是结合重链第二互补决定区（CDR H2）。超过一半的VRC01交互表面（644Ų)涉及CDR H2，一种让人联想到gp120和CD4受体之间相互作用的结合方式；CD4是免疫球蛋白超家族V域类的成员(17)CD4的CDR2样区域是gp120结合的中心焦点(图2A和表S3) (18). 对于CD4，CDR2样区域与残基365-368形成反平行分子间氢键_gp120标准gp120的CD4结合环(18) (图2B); 在VRC01中，在Gly54的羰基之间观察到一个氢键_VRC01型和Asp368的骨架氮_gp120标准这种氢键发生在环末端，相对于CD4的额外残基插入链中，并且其余潜在氢键的几何形状或距离较差(图2C和表S4). 还发现了与CD4的其他相似之处和不同之处：两个主要的CD4残基（Phe43_CD4细胞和Arg59_CD4细胞)参与与gp120的相互作用，VRC01模拟精氨酸相互作用，但不模拟苯丙氨酸相互作用(图2B、C). 最后，在参与VRC01和CD4结合的gp120残基之间观察到显著的相关性(图S1).

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图2

抗体VRC01对CD4相互作用的结构模拟

VRC01显示了双头抗体如何模拟免疫球蛋白超家族单头成员（如CD4）与HIV-1 gp120的相互作用。(A类)HIV-1 gp120与CD4（N末端结构域）和VRC01（重链可变结构域）结合的比较。多肽链在VRC01复合物（右）和gp120 RMSD最低的CD4复合物（左）的带状表示中描述(表S3). CD4复合物（3JWD）(14)CD4为黄色，gp120为红色，CDR绑定环路除外（紫色）。VRC01复合体的颜色如所示图1免疫球蛋白结构域由两个β片组成，两个配体的顶片用标准免疫球蛋白链拓扑结构（链G、F、C、C'、C“）标记。(B、 C类)CD4接口细节(B类)和VRC01(C类). 特写显示了CD4结合环（紫色）和C”链之间以及Asp368之间的关键相互作用_gp120标准和Arg59_CD4细胞或Arg71_VRC01型几何形状良好的氢键用蓝色虚线表示，几何形状较差的氢键则用灰色虚线表示。氢键延伸的原子用棒状表示，蓝色表示氮，红色表示氧。在的左侧面板中C类图中描绘了gp120的β15链，以帮助与B类但由于氢键几何结构较差，它只是一个环。(D类)VRC01-和CD4-结合方向的比较。多肽以带状表示形式显示，gp120的颜色与(A类)VRC01，重链为深黄色，轻链为深灰色。当VRC01的重链叠加到CD4-gp120复合体中的CD4上时，轻链假定的位置表明与gp120发生了多次冲突（左）。VRC01绑定方向（右）通过采用旋转43°并平移6°的方向来避免碰撞。

gp120核以VRC01结合形式与gp120在其他晶格中叠加，并与其他配体结合，表明存在CD4结合结构（PDB ID 3JWD）(14)在结构上关系最密切，Cα-根-平方偏差为1.03º(表S5). CD4结合构象和VRC01结合构象的gp120的这种叠加使CD4的N末端结构域和VRC02的重链可变结构域紧密对齐(图2)，73%的CD4 N末端结构域体积与VRC01重叠(19). 这种结构域重叠远远高于其他CD4结合位点抗体的重链，如b12、b13或F105(表S6). 然而，当基于保守骨架和半胱氨酸残基将VRC01重链叠加在CD4-gp120复合物中的CD4上时，gp120和VRC01可变轻链的整个顶部三分之一之间会发生冲突(图2D) (20). 在其与gp120的复合体中，VRC01相对于CD4定义的方向旋转43°，并将6-？从桥接片转换为无碰撞的方向，该方向模拟了CD4与gp120之间的许多相互作用，但变化很大。静电分析表明，VRC01和CD4的相互作用表面都很基本，尽管接触氨基酸的残基类型不同(图S2). 因此，虽然VRC01在一定程度上模拟CD4结合，但观察到了相当大的差异。

VRC01广度和效力的结构基础

当CD4通过将其两个N末端结构域融合到二聚体免疫球蛋白恒定区而置于免疫球蛋白上下文中时，它可以实现合理的中和。然而，VRC01的中和效果更好(图3A) (12). 为了理解VRC01非凡的广度和效力的结构基础，我们分析了它与gp120的相互作用表面。VRC01将其结合集中在构象不变的外域，该外域占VRC01接触表面面积的87%(图3B,表S7). 13%的由柔性内域和桥接片制成的触点是非接触的，对绑定来说并不重要。相反，CD4与桥接片的接触率为33%，其中许多相互作用是必不可少的(18). VRC01减少内部结构域和桥接片相互作用主要是通过相对于CD4的6-Å翻译来实现的；Phe43等关键触点_CD4细胞在VRC01中未发现与桥接片外域的连接，而与外域（例如Arg59）的连接_CD4细胞)由VRC01模拟。

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图3

抗体VRC01中和广度和效价的结构基础

VRC01表现出显著的中和广度和效力，部分原因是它能够很好地结合HIV-1 gp120的不同构象。(A类)中和树状图。当前循环HIV-1毒株的遗传多样性显示为树状图，标记了显著分支（如a、B和C）和重组体（如CDR02_AG）的位置。菌株通过其对VRC01（左）或CD4（右）的中和敏感性而着色。VRC01用IC中和72%的测试HIV-1分离株₈₀小于1 ug/ml；相比之下，CD4可以用IC中和30%的被测HIV-1分离株₈₀小于1 ug/ml(表S13). (B类)gp120上VRC01和CD4的分子足迹。HIV-1 gp120的分子表面已根据其基本结构域亚结构着色：红色表示构象不变的外部结构域，灰色表示内部结构域，蓝色表示高度流动的桥接片。与VRC01或CD4相互作用的gp120表面区域已分别被着色为绿色和黄色。(C类)通过改变CD4结合状态的采样来中和病毒。突变体S375W_gp120标准倾向于CD4结合状态，而突变型H66A_gp120标准和W69L_gp120标准不赞成这个州。VRC01（左）对野生型（WT）和所有三种突变病毒的中和作用相似，而CD4（右）的中和作用与突变病毒中gp120倾向于CD4结合状态的程度相关。(D类)结合亲和力的比较。结合亲和力（K_D类s） 对于VRC01和各种其他gp120活性配体，由表面等离子体共振测定的结果显示在条形图上。白条表示gp120的亲和力，限制其假设CD4结合状态(21)黑条表示固定在CD4结合状态的gp120的亲和力(24). 装订太弱，无法准确测量，如图中星号和10处的横条所示^-5M千_D类.

为了确定VRC01在CD4结合和非CD4结合构象中对gp120的亲和力，我们使用表面等离子体共振光谱来测量VRC01和其他gp120受体抗体和配体对两种gp120的亲合力：Harrison及其同事开发的β4缺失，该缺失被限制在假设CD4结合构型中(21)或二硫稳定的gp120核，在没有CD4自身的情况下，大部分固定在CD4结合构象中(18) (图3D) (图S3). VRC01对CD4结合和非CD4结合构象都具有高亲和力，这是广泛中和b12抗体的共同特性(21-22). 相比之下，抗体F105和17b以及可溶性CD4仅对一种构象表现出强烈的偏好，而不是两者。因此，VRC01以能够识别gp120的CD4结合和非CD4结合构象的方式与构象不变的外域相互作用。

为了评估VRC01在功能性病毒尖峰环境中的结合，我们检测了其通过影响CD4结合状态的gp120变化中和HIV-1变体的能力。其中两个突变，His66Ala_gp120标准和Trp69Leu_gp120标准，降低病毒对CD4结合状态进行采样的能力，并且对CD4的中和作用不太敏感(23). 其中一个突变，Ser375Trp_gp120标准，增加CD4结合状态的形成，对CD4的中和作用更敏感(23-24). VRC01以相似的效力中和了所有三种变异HIV-1病毒(图3C)表明VRC01识别病毒尖峰的CD4结合和非CD4结合构象。这种识别多样性允许VRC01避免阻碍大多数CD4结合位点配体的构象掩蔽(25)并有效中和HIV-1。

VRC01精确瞄准

先前对有效和无效的CD4结合体抗体的分析表明，要阻止病毒进入，需要精确靶向CD4附着的初始位点(11,26). CD4附着的初始位点是CD4结合位点的一个子集，涉及构象不变的外结构域(22). VRC01与gp120的交互分析表明，它覆盖了目标站点的98%(图4A和第4页)，包括1089Ω²在gp120外域上，大约比730欧大50%²CD4使用的表面。目标位置外的VRC01接触面在很大程度上局限于构象不变的外域，并避免了构象灵活性区域。这种结合的一致性远大于无效的CD4结合位点抗体，以及部分有效的抗体，如抗体b12(11,22) (图S4).

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图4

对抗体VRC01的天然抗性

VRC01精确定位于HIV-1 gp120上CD4定义的漏洞位置。然而，它的结合面延伸到目标位点之外，这允许对VRC01中和产生自然抗性。(A类)VRC01漏洞识别和目标站点。CD4易损性的定义部位是CD4的gp120外域的初始接触面，仅包含CD4的gp120接触面的2/3(22). 在VRC01结合构象中，gp120的分子表面根据其结构域亚结构着色，如图3B，VRC01的交互足迹显示为绿色，CD4定义的漏洞位置显示为黄色。(B类)抗原变异。gp120的多肽骨架根据序列保守性着色，如果保守性高则为蓝色，如果保守性低则为红色。(C类)耐VRC01的HIV-1分离株。抗VRC01中和的17个HIV-1分离株在以VRC01结合构象穿到gp120的结构上后以带状和棒状显示。与VRC01冲突的侧链以红色突出显示(D类)17株抗VRC01中和的HIV-1分离株的V5区序列。(E类)HIV-1与VRC01发生冲突。VRC01的分子表面显示了一个螺纹、抗性菌株的特写镜头，浅蓝色代表轻链，绿色代表重链。预计会干扰VRC01-gp120交互的冲突以红色突出显示(F类)VRC01的分子表面，并选择gp120的相互作用环。V5回路尖端的变化由VRC01重链和轻链之间的间隙调节。

VRC01轻链（Tyr28）的触点_VRC01型和Ser30_VRC01型)由N-连接聚糖残基276的蛋白质-最大N-乙酰基-葡聚糖制成_gp120标准(27). 因此，VRC01没有被聚糖屏蔽阻挡，而是利用聚糖进行结合。其他潜在的聚糖相互作用可能与不同的HIV-1 gp120菌株发生，因为gp120外结构域上的VRC01识别表面比功能受限的CD4相互作用表面延伸得更远，特别是进入环D和常糖基化的V5区域(图4D).

对抗体VRC01的天然抗性

除了构象掩蔽和聚糖屏蔽外，HIV-1还通过抗原变异抵抗中和作用。在另一份手稿中，我们显示，在190株对VRC01敏感性测试的循环HIV-1分离株中，173株被中和，17株耐药(12). 为了理解这种对VRC01的天然抗性的基础，我们通过将其序列旋入gp120结构来分析所有17个抗性分离株(图4C). 在耐药菌株的V5区观察到变异，这种变异以及gp120环D的改变似乎是对VRC01最自然抗性的来源(图4D、4E,第5章).

由于V5存在显著差异，该区域的结构差异可能会导致大于10%的阻力。观察到的较低电阻频率表明，VRC01采用了一种识别机制，尽管V5发生了变化，但仍允许结合。对VRC01与V5相互作用的检测表明，VRC01对V5的识别与CD4的识别有很大不同(图S6)，带Arg61_VRC01型在CDR H2中，穿透gp120的V5和β24链形成的空腔(图S7). 最重要的是，V5环适合重链和轻链之间的间隙；因此，通过只接触环基上更保守的残基，VRC01可以容忍V5环尖端的变化(图4F).

VRC01的异常特征及其对识别的贡献

我们检查了VRC01的结构，以了解其功效可能需要的特殊特征。许多不寻常的特征都很明显，包括高度亲和力成熟、额外的二硫键、N-连接糖基化位点、轻链中的2-氨基酸缺失以及VRC01和gp120之间显著成熟的结合界面(图5). 我们评估了在HIV-1环境抗体中发现这些特征的频率(SOM附录)或在人体抗体-抗原复合物中(图S9)，并测量基因组逆转对gp120亲和力的影响(图5B-E).

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图5

异常的VRC01功能

VRC01的结构显示出许多不寻常的特征，如果这些特征对识别至关重要且难以激发，则可能会抑制VRC01样抗体的激发。(A类)VRC01序列和亲和力成熟程度。VRC01的顺序与最近的V一起显示_小时-和V_¦Β/λ-重链和轻链的基因组前体。亲和力成熟变化以绿色表示，与HIV-1 gp120相互作用的残基突出显示为“●”，如果涉及主链和侧链相互作用，则显示为“○”，如果仅涉及主链，则显示“☼”。”“标志着N-连接的糖基化位点，”“对于非标准二硫化物中的半胱氨酸残基，以及”“如果在亲和力成熟过程中残留物被删除。在B-E公司，VRC01的不寻常特征在结构上（最左边的面板）、与其他抗体的直方图频率方面（左起第二个面板）以及突变后的亲和力测量方面（右两个面板）都显示出来。通过ELISA对结晶中使用的gp120结构（93TH057）和二硫化物稳定的HXBc2核心进行亲和力测量(22). (B类)N-连接糖基化。观察到的电子密度、去除频率以及去除对亲和力的影响显示了保守的三核糖核。(C类)额外的二硫化物。可变重结构域自然有两个由二硫键连接的Cys；VRC01有一个额外的二硫键连接CDR H1和H3区域。这种情况在抗体中很少发生，但通过突变Ser/Ala将其去除对亲和力几乎没有影响。(D类)CDR L1删除。CDR L1中的两个氨基酸缺失可防止与gp120环D发生潜在冲突。很少观察到这种缺失；恢复到较长的环可能对gp120亲和力有10-100倍的影响。(E类)身体接触面发生改变。最左边的面板显示VRC01轻链为紫色，重链为绿色。亲和力成熟改变的残基用“球”表示，与HIV-1 gp120的接触呈红色。大约一半的接触在成熟过程中发生了改变。对蛋白质数据库中人类抗体-蛋白质复合物的分析表明，这种程度的接触表面改变是罕见的；将每个接触位点还原为基因组几乎没有影响(表S12)，尽管总的来说，对亲和力的影响更大。

一般来说，HIV-1反应性抗体的亲和力成熟度较高(28)和明显较高的广泛中和水平(29). 但这些水平可能是HIV-1感染持续性的结果，而不是激发的内在限制。在不到5%的HIV-1Env反应性抗体中观察到其他每个特殊特征，或与平均值相差超过4个标准偏差(图S9和表S10、S11). 移除连接重链CDR H1和H3区域的N-连接糖基化或额外的二硫键对结合几乎没有影响(图5B、5C和表S12). 插入2-氨基酸以恢复轻链缺失具有中等效果，这对于Ala-Ala插入来说更大（K减少50倍_D类)与Ser-Tyr插入相比（K减少5倍_D类)，模仿基因组序列(图5D). 最后用单突变、4-突变、7-突变或12-突变逆转来检测界面的逆转。对于界面的单一突变逆转，所有12个突变都有轻微影响（大多数对K的影响小于2倍_D类，对Gly54Ser随K的变化影响最大_D类20.2 nM）(表S12). 通过多次（4、7或12）变化观察到更大的影响，这些变化降低了测量的K_D类5-30倍和EC₅₀s增加10-100倍，取决于氨基酸的变化和测试结合的gp120(图5E和表S12). 因此，尽管VRC01具有许多不寻常的特征，但基因组序列的任何单一改变都不会使亲和力降低10倍以上。最大的影响是轻链缺失。同样的缺失也见于抗体VRC03中，它是VRC01的一种变体，我们从同一患者中分离出来，具有相同的重链，但不同的轻链，是受体编辑的产物(12,30). VRC01和VRC03的轻链中都存在这种缺失，这说明了它对VRC01模式HIV-1识别的重要性，也证明了获取这种特征并不是VRC01独有的。

VRC01样抗体的激发

特定抗体的激发概率是B细胞成熟过程中三个主要步骤中每个步骤的函数：1。重组以产生基因组V的新生抗体重链和轻链_小时-D-J和V_κ/λ-J前体；2.删除自身反应抗体；和3。通过可变结构域的超突变来提高抗原亲和力。就第一步重组而言，可以从VRC01-gp120结构推断抗体前体基因的哪些部分对Env识别至关重要，以及哪些重组事件至关重要，从而深入了解适合生成VRC01-like抗体的基因组重排频率。在VRC01-gp120结构中，缺乏实质性CDR L3和H3贡献表明特定V_κ/λ-J或V_小时（D） J-不需要复合(31). 大多数识别发生在单个基因组元件或盒中编码的元件上，这表明定义的盒之间不需要特定的连接。在V内_小时盒中，一些与VRC01的IGHV1-02*02前体相关的残基与gp120相互作用；其中许多在相关的基因组V中是保守的_小时s、 其中一些与VRC01的遗传距离相似(图S8). 总之，这些结果表明，在重组产生VRC01样抗体方面只有适度的限制，并且适当的基因组前体可能在人类抗体库中以合理的频率出现。

重组产生新生的B细胞呈递抗体，该抗体对自身和非自身抗原都具有反应性。那些具有自身反应性的细胞通过克隆缺失被去除。具有许多广泛中和的抗HIV-1抗体，如2G12（聚糖反应）(32-33)、2F5和4E10（膜反应）(34-35)，这似乎是启发式的主要障碍。虽然这仍然是基因组突变和中间产物的特征，但迄今为止尚未观察到VRC01的自反应性(12)这表明该步骤对VRC01样抗体的激发没有限制。

亲和力成熟和VRC01样抗体

影响VRC01样抗体激发的第三步是亲和力成熟，在生发中心的B细胞成熟过程中，可变结构域的超突变与基于亲和力的选择相结合(36). 这一过程允许抗体在初始重排时从低亲和力（uM）快速进化为中等亲和力，再进化为对完全成熟抗体的紧密亲和力（nM）。一些可变结构域的改变很难检测，因为重组在V、D和J片段之间的连接处产生了不可预测的氨基酸。然而，V和J基因内的前体的变化可以更确切地知道。在VRC01的情况下，从基因组V中观察到41个残基改变_小时-基因和V的25个变异_Κ-基因（包括两个残基的缺失）(图5A). 如前所述(12)，这些亲和力成熟度的变化是不寻常的，即使对于HIV-1环境反应抗体(37).

为了研究亲和力成熟对HIV-1 gp120识别的影响，我们将病毒_小时-和V_Κ-VRC01的区域，无论是单独的还是共同的，都与其基因组前体序列相关联，并测试了回复抗体对gp120的亲和力。使用93TH057 gp120，恢复到生殖系V_小时降低了EC₅₀约1000倍，未观察到V结合_Κ回复体。HXBc2核心gp120二硫稳定在CD4结合状态(22)，结合减少较少，V_Κ还原还原结合10倍，V_小时还原还原结合100倍，V_小时-，V_Κ-同时逆转消除可检测的结合(图6A).

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图6

体细胞成熟和VRC01亲和力

B细胞成熟过程中可变结构域的过度突变允许高亲和力抗体的进化。有趣的是，这种亲和力增强主要是通过改变非接触残基来实现的，这些残基似乎将基因组接触表面从亲和力太低而无法测量到紧密（nM）相互作用。(A类)基因组逆转的影响。V型_小时-和V_Κ-VRC01的衍生区域被还原为其最近的基因组前体序列，以免疫球蛋白表达，并测试其与V的结合_小时-和V_Κ-回复体（gHgL），如V_小时-仅回复体（gH），或V_Κ-仅还原剂（gL）为结晶中使用的gp120结构（93TH057）或稳定HXBc2核心(22). (B类)VRC01的成熟及其与结合的相关性。在VRC结构-功能分析过程中产生的19个VRC01突变体的亲和力测量值根据其亲和力成熟程度进行分析。观察到显著的相关性，外推到V_小时-和V_Κ-回复子表明与gp120的亲和力大大降低。(C类)VRC01的成熟及其对HIV-1 gp120亲和力的影响。与三聚体HIV-1病毒尖峰的非连锁状态相对应的冷冻电子显微镜密度（粉红色）(50)与VRC01抗原结合片段复合。Cα主干色带显示为gp120（红色）和VRC01灰色。对于VRC01，分子表面显示了从最近的V改变的残基_小时-和V_Κ-基因组前体序列和灰色到绿色取决于gp120亲和力的逆转效果，灰色表示小效应，绿色表示大效应。

除了全规模重链和轻链回复体外，在分析不寻常的VRC01特征时，还产生了许多其他回复体(表S12). 这些回复子为分析亲和力成熟的整体效应提供了基础。我们关联了测量的EC₅₀s与V中亲合成熟残基的数量_小时和V_Κ区域(图6B) (38). 结晶gp120和稳定在CD4结合构象中的HXBc2 gp120核的回复子结合亲和力与亲和力成熟残基的数量显著相关(第页<0.0001). 结晶gp120的变化大约是稳定gp120的4倍。在这两种情况下，推断与假定基因组V基因序列的相关性将结合降低到0.6-4.9 10^-6M千_D类(图6B和第12节)这超出了ELISA的检测范围，实验证实了这一结果(图6A).

其他广泛中和的抗HIV-1抗体逆转为假定的基因组序列后，亲和力也出现了类似的显著降低(39-40); 这些观察结果表明，对gp120的种系亲和力显著降低，可能会阻碍这些抗体亲和力成熟的启动(41). 也就是说，如果广泛中和抗体的基因组前体对gp120的亲和力低于新生B细胞成熟所需的阈值，那么成熟要么不会发生，要么需要对不同的免疫原作出反应。这种缺乏引导性成熟过程的启动可能解释了在感染的最初几年中缺乏这种广泛中和抗体的原因。相反，引入对基因组前体和亲和力成熟中间体具有亲和力的修饰gp120可以提供一种机制，通过该机制激发VRC01等抗体。

值得注意的是，单个亲和力成熟改变似乎对亲和力的影响不超过10倍，这表明亲和力成熟发生在多个小步骤中，这些步骤共同使其能够与HIV-1 gp120紧密结合。当VRC01对病毒中和的影响将亲和力成熟逆转映射到VRC01-gp120复合物的结构时(图6C)这些影响广泛分布在VRC01可变域中，而不是集中在VRC01-gp120接口上；非接触残基通过间接蛋白折叠效应明显影响与gp120的界面(图6C). 因此，对于VRC01，亲和力成熟过程需要不断改变新生基因组前体，以获得与HIV-1环境表面的高亲和力相互作用。

受体模拟和亲和力成熟

几十年来，人们一直在探索利用受体识别保守位点的抗体有效中和病毒的可能性。识别ICAM-1非成对末端免疫球蛋白结构域的鼻病毒凹陷峡谷突显了狭窄峡谷入口在阻断二价抗体结合区中的空间位阻作用(42)，尽管框架识别在某些情况下可以允许进入(43). 抗原变异可能仍然允许病毒逃逸，即使有较少的凹陷结合位点，如流感病毒血凝素上的唾液酸受体结合位点(44)对于HIV-1，聚糖和构象掩蔽起主要作用(11,45). 部分溶液，如抗体b12提供的溶液（中和40%的循环菌株）(22)或通过抗体HJ16（中和30%的循环菌株）(46)是一种最近发现的CD4结合位点抗体，可以识别一些HIV-1分离株。

对于VRC01，中和的广度和效力（超过90%）表明了一种更通用的解决方案。这里我们看到这个解决方案包含两个特征：部分受体模拟和广泛亲和力成熟。通过亲和力成熟，从基因组重排中诱导VRC01样抗体，到广泛有效地中和HIV-1，这将是多么困难，尚待观察。累积的证据表明，VRC01定义的识别模式被来自同一个体的其他抗体使用（VRC02和VRC03）(12)以及其他个人（Wu和Mascola，个人沟通）。这些发现表明VRC01并不是一个孤立的例子，它可能为一般识别模式提供了一个模板。因此，这里描述的VRC01的结构-功能见解为合理的疫苗设计提供了基础，不仅基于特定的抗-抗原相互作用模式，而且基于基因组抗体前体、体细胞超突变和所需界面元素之间的明确关系。

补充材料

参考文献和注释