生物化学杂志。2010年11月19日;285(47): 36551–36560.
瘦素通过激活Hedgehog通路促进肝星状细胞肌纤维母细胞表型
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史蒂夫·S·崔
来自‡北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学系消化科,邮编:27710,
这个§北卡罗来纳州达勒姆市达勒姆退伍军人事务医疗中心胃肠科,邮编:27705
Wing-Kin同步
来自‡杜克大学医学系胃肠病学科,北卡罗来纳州达勒姆27710,
Gamze F.卡拉卡
来自‡北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学系消化科,邮编:27710,
阿莱西亚·奥梅内蒂
来自‡北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学系消化科,邮编:27710,
辛西娅·莫伊兰
来自‡北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学系消化科,邮编:27710,
这个§北卡罗来纳州达勒姆市达勒姆退伍军人事务医疗中心胃肠科,邮编:27705
拉斐尔·维特克
来自‡杜克大学医学系胃肠病学科,北卡罗来纳州达勒姆27710,
科拉德·M·阿格布拉
来自‡北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学系消化科,邮编:27710,
容美美(Youngmi Jung)
来自‡北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学系消化科,邮编:27710,
这个¶韩国釜山国立大学生物科学系609-735
格雷戈里·米歇洛蒂
来自‡北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学系消化科,邮编:27710,
安娜·梅·迪尔
来自‡北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学系消化科,邮编:27710,
来自‡北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学系消化科,邮编:27710,
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这个¶韩国釜山国立大学生物科学系609-735
1收件人:杜克大学医学中心消化科,DUMC 3256,595 LaSalle St.,Suite 1073,Durham,NC 27710,传真:919-684-4183;电子邮件:ude.ekud@lheid.eamanna. 收到日期:2010年7月26日;2010年8月25日修订
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摘要
静止的肝星状细胞(Q-HSC)具有上皮和脂肪细胞特征,转分化为肌纤维母细胞-HSC(MF-HSC)是肝纤维化的关键事件。培养模型表明,Hedgehog(Hh)通路激活是上皮样/脂肪细胞Q-HSC向MF-HSC过渡所必需的。Hh信号抑制肥胖并促进上皮-间充质转化(EMT)。瘦素(抗脂肪生成,前EMT因子)促进HSC转分化和肝纤维化,表明这些途径可能相互作用调节细胞命运。本研究旨在确定瘦素是否激活Hh信号,以及瘦素的成纤维作用是否需要Hh信号。从瘦肉和传真/传真对患有遗传性ObRb缺陷的大鼠进行检查。PI3K/Akt、JAK/STAT和Hh信号的抑制剂用于描述ObRb激活如何影响Hh信号和HSC转分化。比较野生型和数据库/数据库小鼠(ObRb功能受损)评估瘦素的促纤维化作用。结果表明,轻蛋白-ObR相互作用激活Hh信号,后者是促进转分化所必需的。瘦素相关的Hh信号传导增加需要PI3K/Akt的ObR诱导,这足以使瘦素抑制上皮样细胞/脂肪细胞程序。间充质基因表达需要瘦素介导的JAK/STAT诱导。瘦素-ObRb相互作用对于HSC转分化的发生是不必要的在体外或体内但这很重要,因为肝纤维化在数据库/数据库老鼠。这些发现表明,瘦素激活Hh信号转导,改变控制细胞命运的基因表达程序,并对肝纤维化和其他瘦素调节的EMT过程(包括发育、肥胖和癌症转移)具有重要意义。
关键词:脂肪细胞、细胞分化、成纤维细胞、肝脏、肝损伤、上皮-间充质转化、纤维化
介绍
基质重塑在胚胎发生期间经常发生,是包括肝脏在内的许多成人器官损伤后组织重建的组成部分(1). 肌纤维母细胞(MFs)2是基质重塑的关键介质,因为它们是基质蛋白和降解基质因子的主要生产商。因此,MF群体通常在组织修复的这一阶段扩大(2). 根据损伤的严重程度和持续时间以及所涉及的组织,不同来源的MF有助于伤口愈合。静止脂肪细胞肝星状细胞(Q-HSC)向MF的转化以及这些新生成的MF随后的生长是MF富集受损肝脏的主要机制(三). 因此,对调节这些过程的信号转导途径进行表征是很重要的。
肝损伤期间增加的几个因素促进Q-HSC形成MF和/或促进新生成MF的存活和增殖,包括转化生长因子β(TGF-β)、结缔组织生长因子、Toll样受体2和9的配体、某些促炎细胞因子、,血小板衍生生长因子(PDGF)和瘦素。然而,这些因素可能有点多余,因为在实验动物中敲除其中任何一个都不足以完全消除纤维生成或纤溶(2). 凋亡的肝细胞本身也可以促进HSC活化为MF表型。当HSC吞噬凋亡的肝细胞时发生这种情况(4). 此外,濒死的肝上皮细胞产生并释放Hedgehog(Hh)配体,作为旁分泌信号,激活Q-HSC成为MFs所需的Hh依赖机制(5). Hh配体对MF保持成纤维细胞表型、对有丝分裂原的反应进行增殖以及在标准培养条件下存活也是必要的(6).
由于Hh信号转导介导Q-HSC MFs的形成和新生成MF群体的生长,因此Hh途径可能在控制HSC命运中发挥关键作用。如果这一假设成立,则意味着Hh途径调节其他促纤维生成因子与HSC上受体相互作用时启动的信号。为了进一步评估这种可能性,我们研究了操纵Hh信号如何改变HSC对瘦素的反应。
我们选择瘦素进行仔细研究,因为已经有大量文献详细描述了瘦素促进肌成纤维细胞转化和HSC增殖的机制(7,–16). 这项工作表明,瘦素受体长型ObRb的激活以及随后PI3K/Akt和JAK2/STAT3信号的激活在调节瘦素效应中起着关键作用。Q-HSC也是脂肪细胞样细胞,瘦素和Hh都被证明调节脂肪细胞的命运。在前脂肪细胞(是成纤维细胞)中,Hh途径是活跃的。随着前脂肪细胞分化为脂肪细胞,Hh途径逐渐沉默,瘦素基因表达逐渐诱导(17). 瘦素反过来阻止进一步的脂肪细胞分化,从而控制脂肪组织的净质量(18). 与瘦素一样,Hh配体也是脂肪生成的有效抑制剂。一项最新的全基因组脂肪质量控制因子筛查果蝇属确定Hh途径是苍蝇脂肪量的主要负调节因子(19). 类似地,脂肪细胞靶向破坏Hh信号主要抑制剂SuFu的转基因小鼠表现出过度的Hh信号,脂肪细胞前体分化失败,脂肪库发育失败(19). 证据表明,Hh作用于过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ上游,通过抑制该关键脂肪生成转录因子的诱导来阻止脂肪细胞分化,从而维持典型的成纤维前脂肪细胞表型。
与成熟脂肪细胞类似,Q-HSC是脂载细胞,表达PPARγ。PPAR(购电协议)当Q-HSC转变为MF时,γ被下调,激活PPARγ的药物既阻止Q-HSC产生MF,又导致MF-HSC恢复到其静止的脂肪细胞表型(20). Hh通路活性随着Q-HSC抑制而增加PPAR(购电协议)γ和转变为MF-HSC。因此,MF-HSCs中PPARγ活性较低,Hh途径活性较高。使用Hh抑制剂治疗MF HSC许可PPAR(购电协议)γ表达重新融合并导致细胞失去成肌纤维细胞特性(21). 因此,Hh途径作用于PPARγ上游以抑制PPAR(购电协议)γ诱导并维持前脂肪细胞和MF-HSCs的成纤维细胞表型。
在培养的HSC中,从Q-HSC(PPARγ水平高,但Hh活性低)到MF-HSCs(PPAR伽马水平低,但Hh活性高)的转变与下调骨形态发生蛋白7,识别码2,促结蛋白、和E-钙粘蛋白表达和伴随的上调TGF公司-β、 蜗牛,波形蛋白,纤维连接蛋白, α-平滑肌肌动蛋白(α-座椅模块组件)基质金属蛋白酶和1型胶原(第1列α1). 众所周知,当上皮(或内皮)细胞获得间充质特性时,也会发生类似的基因表达变化,这表明脂肪细胞前体生成MF-HSC的过程类似于上皮/内皮-间充质转化(EMT)。阻断Hh通路激活可阻止/逆转这种EMT样过程,并抑制HSC成为/保持成肌纤维细胞(21). 有趣的是,最近对发育中心脏以及某些类型的成人上皮性肿瘤的心内膜垫重塑的研究表明,瘦素也能促进EMT(22,–24). 然而,据我们所知,瘦素在发育、肿瘤转移或脂肪细胞(反式)分化过程中可能与Hh相互作用以调节EMT的可能性尚未被研究。
鉴于瘦素和Hh在包括HSC在内的几种类型的基质细胞中的作用明显重叠,本研究评估了瘦素激活Hh通路以促进HSC获得/维持肌纤维母细胞表型的假设。这些结果证实了这一假设,从而促进了对HSC瘦素作用机制的基本认识。此外,该发现扩展了早期证据,表明Hh途径激活是促纤维化因子的保守靶点。反过来,这一概念对涉及基质细胞失调的广泛临床疾病具有重要意义,包括肝硬化、转移性癌症、某些先天性心脏异常和肥胖。
实验程序
动物护理
成年雄性Sprague-Dawley大鼠从Charles River Laboratories(Wilmington,MA)获得。扎克-勒普传真和Zucker-勒普+从哈兰实验室(印第安纳波利斯)获得。肥胖、糖尿病数据库/数据库小鼠取自杰克森实验室(马萨诸塞州巴尔港)。为了诱导肝损伤和纤维化,六数据库/数据库和五只瘦对照小鼠被喂食蛋氨酸胆碱缺乏(MCD)饮食(MP Biomedicals,Solon,OH),共8周。控制数据库/数据库允许使用WT小鼠随意水和标准啮齿动物食物的消耗。完成8周的治疗后,处死小鼠。采集肝脏,福尔马林固定或速冻。动物实验符合美国国立卫生研究院和杜克大学IACUC对人道动物护理的要求。
细胞分离与培养
从祖克的斯普拉格-道利分离出原发性HSC-勒普传真和Zucker-勒普+对大鼠进行纯度和活力评估,并以3×10的密度接种2单元格/mm2补充10%胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的DMEM(6,21). 对于涉及瘦素、腺病毒载体和/或各种药物抑制剂治疗的研究,在开始治疗前,将第7天的HSC培养物在去血清培养基(0.1%FBS)中培养过夜。
HSC的腺病毒转导
含有由巨细胞病毒启动子驱动的GFP基因的Ad5GFP被用作对照病毒。Ad5dnAkt病毒表达Akt的显性阴性形式。初步研究表明,最大有效的转导发生在100倍的感染。随后对这种多重感染进行24小时的实验,然后抽吸含病毒培养基并用新鲜培养基替换(6).
HSC的药理学治疗
用环胺(5μ米; 加拿大多伦多研究化学品公司)或催化活性类似物托马替丁(5μ米)24小时以抑制Hh信号(21),LY294002(25μ米; Cell Signaling Technology,Danvers,MA)30分钟以抑制PI3K信号(6)和AG490(50μ米; Tocris Biosciences,Ellisville,MO)30分钟以抑制JAK信号(13)在使用瘦素(100 ng/ml;明尼阿波利斯R&D Systems,明尼苏达州)或溶媒对照药物治疗之前。这一剂量的瘦素是根据其最佳诱导1型胶原基因转录激活的证据来选择的(7)在培养的啮齿动物和人类HSC中刺激下游激酶活性和增殖(13,–15).
实时逆转录PCR(RT-PCR)定量mRNA
使用TRIzol(Invitrogen)提取总RNA,并使用上标逆转录酶(Invit罗gen)进行逆转录,如前所述(21). 有关底漆,请参见.
表1
基因 | GenBank(基因银行) | 方向 | 序列 |
---|
α座椅模块组件 | X06801型 | 福沃德 | GTGGATCACAAGCAGGAGT公司 |
| | 反转 | CATAGCACGATGGTCGATG公司 |
第1列α1 | XM_213440号 | 福沃德 | ctgcatacacaatgcctaa公司 |
| | 反转 | GGGTCCCTCGACTCCTA公司 |
纤维结合蛋白 | NM_019143号 | 福沃德 | GTGGCTGCTCTTCAACTTCTC公司 |
| | 反转 | GTGGGTTGCAAACCATTCAAT公司 |
PPAR(购电协议)γ | NM_013124号 | 福沃德 | CCCTGGCAAGCATTTGTATAT公司 |
| | 反转 | ACTGGCCCTTGAAAAATG公司 |
GFAP公司 | NM_017009号 | 福沃德 | GGGAGTCGGCCAGTTACCAG公司 |
| | 反转 | cccgcatctccccgtct |
S100A4型 | NM_012618 | 福沃德 | ATACTCAGGCAACGAGGGTG公司 |
| | 反转 | CTTCCGGGGCTCCTTATC公司 |
骨形态发生蛋白7 | XM_342591号 | 福沃德 | GTGGTCAACCCTCCGGCACA公司 |
| | 反转 | GGCGTTTGGAGCGATTCTG |
Desmoplakin公司 | XM_001058477号 | 福沃德 | GGAAGTCAGCAGCAAAC公司 |
| | 反转 | GGCTCTCTTTTCACACTGC公司 |
E-钙粘蛋白 | NM_009864号 | 福沃德 | ACCTCTGGCTGACCGA公司 |
| | 反转 | CCTGATACGTGCTTGGTTGAA |
嘘 | NM_017221 | 福沃德 | ACAAAACTCCGAACGATT公司 |
| | 反转 | GCCCTCAGTCACTCGAAGG公司 |
Gli2公司 | XM_222557号 | 福沃德 | ATAAGCGAGCAGGTCAAG公司 |
| | 反转 | CAGTGGCAGTTGGTCTCGTA公司 |
S9 | NM_029767号 | 福沃德 | gactccgcgaacaaacgtgaggt公司 |
| | 反转 | CTTCATCTTGCCCTCGTCCA公司 |
西方印迹法
蛋白质印迹显示相关蛋白的变化;结果被归一化为β-actin表达(21).
形态测量学
为了量化肝纤维化,用苦味酸红(Sigma)对5μm切片进行染色,并对苦味酸红染组织的比例进行形态学分析,如前所述(25).
肝脏羟脯氨酸定量
如前所述,用比色法定量全肝标本中的羟脯氨酸含量,结果与WT对照组相关(25).
统计分析
结果表示为平均值±S.E。使用SAS 9.1版软件(SAS Institute,Cary,NC),采用非参数Wilcoxon-Rank-Sums检验对各组进行比较。第页值是双尾的;显著性在5%水平上被接受。
结果
瘦素(Ob)/Ob受体相互作用对HSC间充质和上皮基因表达的不同调节
已知HSC同时表达瘦素和瘦素受体。定量RT-PCR(qRT-PCR)和Western blot分析用于表征原代大鼠Q-HSCs培养相关激活过程中这些因子表达的变化。虽然培养物强烈抑制ObRa和ObRb的mRNA表达,但瘦素mRNAs迅速被诱导,导致随着HSC成为肌纤维母细胞,瘦素蛋白逐渐累积(). 这些发现与其他小组报告的发现一致(8,26,27)并表明尽管瘦素受体mRNA受到相关抑制,但在HSC反式分化过程中瘦素信号活性可能增加。为了进一步评估MF-HSCs中瘦素受体的功能,第7天用外源性瘦素处理MF-HSC培养物,并用qRT-PCR评估对HSC基因表达的影响。瘦素治疗增强了多种肌纤维母细胞相关基因的表达(例如α-座椅模块组件,第1列α1,纤维连接蛋白,波形蛋白,S100A4型、和结蛋白)原型间充质转录因子mRNA表达增加(例如msx2,重量1、和蜗牛),同时抑制Q-HSC标记物的表达(例如PPARγ和绿色食品添加剂)和上皮细胞(例如BMP7,识别码2,促结蛋白,E-钙粘蛋白) (). 当瘦素被添加到原代HSC培养物中时,瘦素的部分(但不是全部)作用消失传真/传真ObRb基因存在遗传缺陷,降低了其功能。当用外源性瘦素治疗时,ObRb缺陷的HSC无法进一步上调间充质细胞/肌纤维母细胞基因的表达,但保留了瘦素相关的上皮/静止标记物抑制(). 总之,这些结果表明,瘦素必须与其长型受体ObRb结合,以增加间充质肌纤维母细胞基因的HSC表达。然而,不同的瘦素受体和/或突变ObRb的残余功能成分可传递信号,使瘦素抑制介导上皮特性的基因表达。
星状细胞转分化对瘦素及其受体表达的影响。从健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠中分离出原代HSC,混合,并在含有血清的培养基中培养在塑料皿中。在不同时间点分离RNA,并通过qRT-PCR评估基因表达的变化。顶部瘦素、ObRa和ObRb。结果代表了三次重复实验。结果为平均值±标准偏差(误差线)重复三次实验。*,第页< 0.05; †,第页< 0.005.底部,从这些原代大鼠HSC中获取的蛋白质,并通过Western blotting进行分析。
瘦素对星状细胞基因表达的影响。原代大鼠HSC在含血清培养基中培养并用瘦素处理(我; 100 ng/ml)或车辆(V(V)). 分离RNA,通过qRT-PCR评估基因表达的变化。顶部,肌成纤维细胞/间充质标志物:α-SMA、Col1α1、纤连蛋白(Fn1型),S100A4,波形蛋白(维姆),结蛋白(德斯)、Msx2、WT1和snail。底部,上皮标记物:BMP7,Id2,结蛋白(Dsp公司),E-钙粘蛋白(加拿大存托凭证1)和静止HSC标记物:PPARγ和GFAP。结果为平均值±S.E(误差线)重复三次实验。*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; †,第页< 0.005.
瘦素的一些作用是通过与ObRb的相互作用来介导的。从肥胖患者中分离出原发性HSC传真/传真将大鼠及其瘦弱的同窝伙伴集中在含有血清的培养基中的塑料皿中培养。用瘦素治疗培养激活的HSC,如提取RNA,通过qRT-PCR评估基因表达的变化。A类、肌纤维母细胞/间充质标记物:α-SMA、Col1α1、纤维连接蛋白(Fn1型),和S100A4。B类PPARγ(静止标记物)和上皮标记物:BMP7、Id2和结蛋白。C类,刺猬途径基因:Shh、Gli1、Gli2和sFRP1。结果为平均值±S.E(误差线)重复三次实验。*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; †,第页< 0.005.
PI3K/Akt信号通路全面介导Leptin-ObRb对HSC跨分化的影响
所有瘦素受体与PI3K结合,导致Akt激活,而只有ObRb激活JAK-STAT信号(8,28). 为了确定PI3K在瘦素介导的HSC转分化中的作用,在缺乏或存在PI3K抑制剂LY294002的情况下,用瘦素治疗原代大鼠HSC。LY294002逆转了瘦素的所有作用,阻断了瘦素增加各种间充质/肌纤维母细胞基因mRNA表达的能力,以及瘦素对不同上皮/静止相关mRNA的相关抑制(). LY294002对mRNA表达的影响与相应蛋白的可比变化平行(). 腺病毒介导的显性阴性Akt(dnAkt)转移同样抑制了瘦素介导的mRNA和蛋白表达变化,而模拟腺病毒载体(Ad5GFP)的感染并没有改变瘦素的作用(和补充图1). 这些数据表明,导致PI3K/Akt信号激活的瘦素-瘦素受体相互作用是瘦素诱导肌纤维母细胞/间充质基因表达以及抑制上皮和静止标记物表达所必需的。由于前者(而非后者)也需要ObRb唯一触发的信号,PI3K/Akt途径可能与JAK/STAT途径相互作用,以介导瘦素对HSC跨分化的全部作用。
PI3K抑制对原发性HSC瘦素信号传导的影响。原代大鼠HSC在含血清培养基中培养,并用PI3K拮抗剂LY294003(25μ米)添加瘦素前30分钟(我; 100 ng/ml)或车辆(V(V)). 分离RNA,通过qRT-PCR评估基因表达的变化。A类、肌纤维母细胞/间充质标记物:αSMA、Col1α1、纤维连接蛋白(Fn1型),S100A4,波形蛋白(维姆),结蛋白(德斯)、Msx2、WT1和snail。B类,上皮标记物:BMP7,Id2,结蛋白(Dsp公司)和E-钙粘蛋白(加拿大存托凭证1)静止HSC的标志物:PPARγ和GFAP。C类、Hh途径基因:Shh、Gli1、Gli2和sFRP1。结果为平均值±S.E(误差线)重复三次实验。*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; †,第页< 0.005.
PI3K和AKT抑制对HSC瘦素信号传导的影响。原代大鼠HSC在含有血清的培养基中培养,如用LY294003(25μ米)或载体(二甲基亚砜)30分钟(抑制PI3K)、Ad5dnAkt(多重感染100)或Ad5GFP(多重感染10)24小时(抑制Akt)或环胺(5μ米)或托马提丁(5μ米)在添加瘦素(100 ng/ml)或载体之前,持续24小时(以抑制Hh通路信号)。为了抑制AKT,在用瘦素(100 ng/ml)或载体治疗之前,先用Ad5dnAkt治疗HSC。A类,收获蛋白质,并通过蛋白质印迹分析证实基因表达的变化。结果代表了三次重复实验。B类,对所有治疗组进行密度测定。瘦素治疗组显示为平均值±标准偏差(误差线)重复三次实验。*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; †,第页< 0.005.
HSC转分化期间ObRb激活的一些下游后果需要JAK/STAT通路参与
为了阐明JAK/STAT信号在瘦素影响HSC肌纤维母细胞转分化能力中的作用,在没有或存在JAK信号抑制剂AG490的情况下,用瘦素治疗HSC。AG490预处理抑制了瘦素介导的各种肌纤维母细胞基因的诱导,包括α-斯马,第1列α1,纤维连接蛋白,波形蛋白,S100A4型、和结蛋白,没有明显的下调水平蜗牛成绩单(A类). 这些发现证实,瘦素相关的肌纤维母细胞基因诱导需要JAK/STAT信号(7)并提示后者在snail转录下游调控肌纤维母细胞转分化。然而,有趣的是,这种ObRb缺乏的HSC仍然能够下调各种上皮标记物(骨形态发生蛋白7,识别码2,促结蛋白,E-钙粘蛋白)和PPAR(购电协议)γ、 瘦素治疗后Q-HSC的经典标志物(B类). 后一项发现表明,HSC和其他细胞类型一样(29,30),介导肌纤维母细胞表型获得的机制与促进EMT期间上皮特征丢失的机制有些不同。
JAK/STAT抑制对HSC对瘦素反应的影响。原代大鼠HSC在含有血清的培养基中培养,如用JAK抑制剂AG490(25μ米)用瘦素(100 ng/ml)治疗前30分钟。分离RNA并通过qRT-PCR评估基因表达的变化。A类,肌纤维母细胞/间充质标记物:α-座椅模块组件,第1列α1,纤连蛋白(Fn1型),S100A4型,波形蛋白(维姆),结蛋白(德斯)、和蜗牛。B类,上皮标记物:骨形态发生蛋白7,识别码2,去氨普拉金(Dsp公司),E-钙粘蛋白(加拿大存托凭证1)静止HSC标记物PPARγ。C类,Hh途径基因:嘘,Gli1公司,Gli2公司、和私人投资公司结果为平均值±S.E(误差线)重复三次实验。*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; †,第页< 0.005.
激活Hh通路是瘦素介导HSC转分化诱导的保守要求
与瘦素信号一样,Hh通路的激活也对HSC基因表达产生整体影响,增加肌纤维母细胞/间充质细胞基因的表达,同时抑制静止/上皮标记物的表达(6,21). 为了确定瘦素是否与Hh通路相互作用以改变HSC的表型,采用qRT-PCR评估瘦素对Hh配体和靶基因HSC表达的影响。瘦素增加了音猬因子(嘘)配体及其受体,打补丁的(私人投资公司),Hh调节的转录因子,Gli1公司和Gli2公司和Gli-靶基因,可溶性卷曲相关肽(玻璃钢)1表明瘦素增加Shh的生成并激活Hh途径(和). 此外,在瘦素中添加环胺(一种特异性Hh途径抑制剂)完全阻断了瘦素的所有作用,而托马提丁(非活性环胺类似物)则没有任何作用。这些结果证明,瘦素需要Hh途径对HSC转分化发挥作用。
瘦素对HSC Hh途径的影响。原代大鼠HSC在含血清培养基中培养。A类,用瘦素治疗原发性MF-HSCs(我; 100 ng/ml)或车辆(V(V)). RNA被分离,Hh通路基因表达的变化(嘘,Gli1公司,Gli2公司,私人投资公司、和sFRP1型)通过qRT-PCR进行评估。用环胺治疗原发性HSC证明了Hh途径抑制的作用(C类) (5 μ米)或其生物活性类似物托马替丁(T型) (5 μ米),用瘦素治疗前2小时(我)(100纳克/毫升)。分离RNA并改变成肌纤维细胞基因表达(α-座椅模块组件,第1列α1,纤维连接蛋白,波形蛋白,S100A4型,结蛋白,蜗牛、和Msx2公司)通过qRT-PCR进行评估。结果为平均值±S.E(误差线)重复三次实验。*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; †,第页< 0.005.
PI3K/Akt、JAK/STAT和Hh信号通路之间的交叉传递在HSC转分化过程中调节间充质和上皮基因表达谱
中的研究传真/传真ObRb缺陷的HSC表明,瘦素受体的长形式对瘦素增加Shh是不必要的,但瘦素促进下游Hh信号传导是必需的,因为瘦素不能上调Hh信号的表达Gli1公司,Gli2公司,或sFRP1型HSC中传真/传真老鼠(). 我们小组和其他人的先前工作表明,激活PI3K/Akt信号刺激能够产生Hh配体的细胞中Shh的表达(6). 因此,我们评估了LY294002和dnAkt对瘦素介导的嘘mRNA和蛋白质。LY294002和dnAkt均取消了轻蛋白介导的Shh诱导(和和补充图1). 这些治疗还逆转了瘦素对HSC基因表达的所有其他作用(和和补充图1). 有趣的是,用AG490抑制JAK/STAT信号部分抑制了瘦素介导的嘘并废除了Gli1公司,但对瘦素相关诱导的Gli2公司或私人投资公司(C类). 这些数据表明,先前证实的瘦素对造血干细胞间充质基因表达的影响(和)涉及调控Gli1 Shh诱导的JAK/STAT信号的ObRb依赖性效应。由于JAK/STAT抑制,Gli2在这一过程中的作用不太清楚(C类)没有重现突变ObRb对Gli2公司表达式(). 无论如何,总的研究结果表明,HSC基因表达中的瘦素相关变化依赖于诱导Shh配体HSC表达的PI3K/Akt依赖信号。Shh配体激活的信号反过来激活Hh信号,并在JAK/STAT通路被激活后最终导致肌纤维母细胞/间充质表型的自分泌诱导,但不需要激活JAK/STA通路来抑制静止/上皮基因的HSC表达。
Leptin-ObRb信号对HSC跨分化很重要,但并非绝对必要
虽然瘦素只是刺激HSC成为肌纤维母细胞的因素之一,对象/对象瘦素和传真/传真据报道,ObRb遗传缺陷的大鼠可以避免四氯化碳或硫代乙酰胺诱导的肝纤维化(26). ObRb也有缺陷数据库/数据库老鼠(31),但这种菌株在脂肪肝损伤期间能够形成相当大的肝纤维化(32). 因此,我们研究了喂食MCD饮食对脂肪肝损伤的反应数据库/数据库小鼠和WT同窝对照,以验证瘦素信号在肝纤维化发生中的相对重要性。与MCD饮食喂养的WT小鼠相比,MCD饮食数据库/数据库小鼠抑制了肌成纤维细胞标记物α的诱导-座椅模块组件通过Picrosius红染色和肝羟脯氨酸测定评估,肝纤维化明显减少(,A类和B类). 这些发现证实了瘦素信号缺陷的其他啮齿动物品系肝纤维化受损的早期证据(7,10,33)和共同表明,瘦素与ObRb的相互作用在Hh途径激活后HSC发生的肌纤维母细胞反应中起主导作用。为了更直接地评估这一概念,我们比较了从以下来源获得的原代HSC平行培养物中HSC基因表达的培养相关变化:传真/传真大鼠和来自亲本野生型菌株(Fa公司/Fa公司).传真/传真ObRb缺陷的HSC在培养过程中完全激活,Hh信号正常激活,肌纤维母细胞/间充质基因诱导,上皮/静止基因抑制(电子). 这些发现表明,培养系统中存在的其他因素能够补偿有缺陷的瘦素-ObRb信号,同时支持瘦素在促进受损肝脏HSC转分化中起主要作用的概念,因为瘦素缺乏时肝纤维化显著减轻(33)和抗瘦素啮齿动物(,A类和B类)尽管存在其他纤维形成因子。
ObRb功能缺陷对肝损伤纤维化修复和星状细胞转分化的影响。肥胖糖尿病数据库/数据库小鼠和野生型(WT)对照组用MCD或对照饮食治疗8周,以诱导肝损伤和纤维化。A类,来自数据库/数据库和WT小鼠(放大倍率,×1000510)。B–D类、苦味酸红染色切片的形态计量分析(B类),相对羟脯氨酸含量(C类)以及对照组和MCD饮食处理组的相对αSMA mRNA含量数据库/数据库和WT小鼠(D类).D类,ObRb缺陷的原发性造血干细胞传真/传真(扎克-勒普传真)老鼠和瘦子(Zucker-勒普+)大鼠在含血清培养基中培养。通过qRT-PCR评估基因表达的变化。对于每个菌株的HSC,将第7天培养物中的mRNA表达与新鲜分离细胞(第0天)的mRNA表示进行比较。平均值±S.E(误差线)将来自三次重复实验的数据绘制成图表,第页< 0.05; **,第页< 0.01; †,第页< 0.005.
讨论
瘦素缺乏和瘦素受体缺陷显著保护啮齿类动物免受实验诱导的肝纤维化的证据(7,10)刺激了广泛的努力来描述瘦素对HSC的影响,HSC是损伤肝脏中纤维基质的主要来源。该研究表明HSC表达几种瘦素受体亚型(ObRa、ObRb和ObRe)(15)通常证明瘦素与ObRb(其受体的长形式)相互作用需要激活下游激酶PI3K/Akt和JAK2/STAT3(8,12,13). 反过来,一条或两条激酶依赖的信号通路被证明可以介导随后的促纤维蛋白原基因的诱导(8,12,13),吞噬活性(14)和扩散(11)同时抑制细胞凋亡(8). HSC也能产生瘦素,提示瘦素可能在HSC纤维生成和生长中发挥自分泌作用。有证据表明,用siRNA治疗HSC以抑制瘦素表达可显著抑制培养HSC的肌纤维母细胞表型(34)支持此概念。然而,其他报告未能证明HSC在富含血清的培养基中培养时的这种瘦素依赖性效应(27,35)这引发了一种猜测,即瘦素对HSC激活既不必要也不充分,并留下了关于瘦素与HSC相互作用最终意义的悬而未决的问题。
本研究提供了新的证据,表明瘦素刺激HSC产生Shh配体,激活Hh信号,并需要Hh通路活性来诱导/维持HSC中的肌纤维母细胞转变。结果表明,瘦素介导的Hh信号的诱导需要瘦素与其受体的相互作用,并由此激活PI3K/Akt信号。目前的工作表明,对PI3K/Akt信号的依赖至少部分发生了,因为HSC中Shh的表达需要PI3K/Akt的激活。在这方面,HSC与某些胃上皮细胞相似(36). 在这两种细胞类型中,激活PI3K/Akt的各种因子刺激Shh表达。例如,我们之前报道过PDGF,一种公认的MF-HSC有丝分裂原,刺激HSC产生嘘mRNA和蛋白质通过PI3K/Akt依赖机制。这些研究还表明,PDGF相关的有丝分裂需要Hh途径活性(6). 有趣的是,其他研究人员证明,瘦素上调PDGF受体的HSC表达,并表明这在瘦素相关的HSC生长和纤维化形成中发挥重要作用(37). 因此,新的数据通过证明HSC衍生的Shh以自分泌的方式启动信号传导,最终激活Gli转录因子,从而诱导Hh调节的靶基因,包括蜗牛,从而促进了对这一过程的理解。
蜗牛是一种已知在EMT中起主要作用的转录因子,许多促进EMT的情况都会诱导蜗牛mRNA(38). 我们的结果表明,瘦素在成人HSC中作为一种前EMT因子发挥作用,就像它在发育中的心脏和某些类型的癌症中一样(22,–24). 瘦素增加蜗牛PI3K和Akt抑制剂(也可阻止Shh配体的诱导)以及环胺(直接抑制信号传导活性Hh共受体Smoothened)阻断了HSC mRNA的表达。因此,瘦素通过激活Hh途径促进HSC EMT,Hh途径可传递促进其他许多细胞类型中间充质、迁移表型获得的前EMT信号(39,40). 我们的新发现补充并扩展了早期的证据,这些证据表明,瘦素促进HSC间质转化的能力需要功能性ObRb受体,并被JAK/STAT抑制剂阻断(8,12,13). 然而,我们的结果表明,后者并不能阻止瘦素上调蜗牛mRNA的表达。需要进一步研究,以阐明这是否反映了瘦素调节蜗牛功能的转录后作用和/或多余的瘦素介导的其他前EMT因子的诱导,如蛞蝓或扭曲。无论如何,当前的汇总数据提供了新的证据,证明Hh-JAK/STAT相互作用调节HSC中的肠系膜细胞基因表达。他们还揭示,当ObRb信号不足时,瘦素仍然能够下调HSC静止/上皮标记物,并表明JAK/STAT抑制剂无法减弱瘦素的这些抗上皮作用。然而,正如人们所注意到的,轻体蛋白介导的间充质基因诱导,轻体素介导的静止/上皮表型的抑制也依赖于Hh途径的激活。总之,这些发现表明,激活PI3K/Akt(并最终增加触发Hh信号传导的Shh配体的产生)的任何轻蛋白-ObR相互作用都足以抑制PPARγ和上皮程序,而间充质程序的完全诱导需要额外参与JAK/STAT途径,ObRb型受体的独特性质。
尽管功能性ObRbs对瘦素激活Hh信号传导和支持HSC的肌成纤维细胞转分化至关重要,但调节MF HSC转分化和生长的其他因素,如PDGF-BB和TGF-β1,也激活并依赖Hh信号传导发挥纤维化作用(6,41). 的确,如前所示(26),在本研究中,主要HSC来自传真/传真瘦素受体缺陷的大鼠在含有激活Akt的其他因子的富含血清培养基中培养时,完全能够转变为MFs。这些数据也与早期的报告一致,这些报告表明,瘦素对激活在富含血清培养基中培养的HSC是不必要的(35). 此外,他们支持Hh途径是几种重要促纤维生成因子的保守靶点这一概念,其激活可触发各种反应(增殖活性增加、凋亡减少、间充质基因诱导和上皮特性抑制)促进肝MF群的生长和纤维化(5,6,21,42).
平行研究数据库/数据库具有遗传性ObRb缺陷的小鼠在确定ObRb-在瘦素介导的纤维化中的相对重要性以及瘦素以外的其他因子在调节受损肝脏的纤维化修复中的重要性方面具有丰富的信息。与传真/传真导致氨基酸替换的突变降低了瘦素与所有瘦素受体亚型结合的效率(43,44),的数据库/数据库突变特异性地靶向ObRb的细胞质尾部并剥夺其激活JAK/STAT信号的能力(45,46). 因此,瘦素仍然能够激活PI3K/AKT信号数据库/数据库HSC。如其他报道的硫代乙酰胺治疗数据库/数据库老鼠(10),数据库/数据库与具有功能性ObRbs的WT小鼠相比,喂食MCD饮食诱导慢性脂肪肝损伤的小鼠,其肌成纤维细胞标记物的上调作用要弱得多,肝纤维化也要少得多,但仍积累了明显的纤维瘢痕。因此,瘦素-ObRb相互作用在肝损伤背景下监控肝MF人群的生长方面发挥着重要作用,就像在培养的HSC中一样。然而,在完整的动物中,如培养的HSC中,瘦素的这些纤维增殖作用可以通过激活类似纤维生成程序的其他因素进行补偿,至少在部分补偿。这些发现促进了对瘦素促进肝纤维化机制的基本理解,并对瘦素调节的其他过程,特别是发育和致癌过程中发生的脂肪生成和EMT事件,具有潜在的广泛影响。
2使用的缩写如下:
- MF公司
- 肌纤维母细胞
- α-SMA
- α-平滑肌肌动蛋白
- 电子病历
- 上皮-间充质转化
- 小时
- 刺猬
- HSC公司
- 肝星状细胞
- MCD公司
- 蛋氨酸胆碱缺乏
- MF-HSC公司
- 肌纤维母细胞性HSC
- PPARγ
- 过氧化物酶体增殖物激活受体γ
- 私人投资公司
- 打补丁的
- Q-HSC公司
- 静态HSC
- 定量RT-PCR
- 定量RT-PCR
- sFRP1型
- 可溶性卷曲相关肽1
- 嘘
- 声波刺猬。
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