摩尔细胞心脏病学杂志。作者手稿；PMC 2011年12月1日提供。
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HSPB1对聚集型CryAB突变体的选择性降解由泛素-蛋白酶体途径介导
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张华立
一美国犹他州盐湖城犹他大学医学院内科心内科心血管转化生物医学中心84132
纳马卡尔·拉贾塞卡兰
一美国犹他州盐湖城犹他大学医学院内科心内科心血管转化生物医学中心，犹他州84132
安德拉斯·奥罗斯
一美国犹他州盐湖城犹他大学医学院内科心内科心血管转化生物医学中心，犹他州84132
Xianzhong Xiao先生
b条中南大学病理生理学系，湖南省长沙市41008
马丁·雷赫斯泰纳
c（c）犹他大学生物化学系，美国犹他州盐湖城医学院，犹他州84132
Ivor J.本杰明
一美国犹他州盐湖城犹他大学医学院内科心内科心血管转化生物医学中心，犹他州84132
c（c）犹他大学生物化学系，美国犹他州盐湖城医学院，犹他州84132
一美国犹他州盐湖城犹他大学医学院内科心内科心血管转化生物医学中心，犹他州84132
b条中南大学病理生理学系，湖南长沙41008
c（c）犹他大学生物化学系，美国犹他州盐湖城医学院，犹他州84132
- 补充资料
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摘要
编码小分子热休克蛋白（sHSPs）的基因的致病突变构成了一个不断增长的遗传性肌原纤维疾病家族。在本研究中，我们发现当在H9c2大鼠心脏细胞中过度表达时，三个结构直径CryAB突变体R120G、450delA和464delCT主要存在于洗涤剂不溶性组分中。我们发现，HSPB1（一种相关的sHSP）的过度表达或敲除都会影响聚集蛋白CryAB突变体的溶解度、稳定性和降解。HSPB1过度表达对R120G和/或450delA的溶解度和蛋白质聚集体的影响可以忽略不计，但增加了溶解度并阻止了464delCT聚集体的形成。HSPB1敲除降低了所有CryAB突变体的溶解度并增加了蛋白聚集体，表明HSPB1在基础条件下清除CryAB-突变体中起着关键作用。我们提供了四条证据，证明HSPB1对R120G、450delA和464delCT突变体的选择性清除是由泛素-蛋白酶体系统（UPS）介导的。首先，我们发现蛋白酶体抑制剂治疗增加了所有CryAB突变体的水平。其次，R120G和450delA的过度表达与H9c2细胞中其特异泛素结合物的积累相对应。第三，HSPB1的敲除直接增加了所有多泛素结合物的水平。第四，蛋白酶体抑制消除了HSPB1过表达对464delCT表达的选择性衰减。我们的结论是，CryAB突变体和HSPB1过度表达之间的这种选择性相互作用可能对临床表现和潜在治疗具有重要意义。
关键词：CryAB、HSPB1、聚集物、降解、溶解性、稳定性、蛋白酶体、巨自噬
1.简介
CryAB（αB-crystallin；HSPB5）是一种具有伴侣样性质的小分子热休克蛋白（sHSP），在晶状体、心脏和骨骼肌中大量表达[1]. sHSPs作为分子伴侣，在正常情况下，尤其是在应激条件下，阻止蛋白质聚集并加速未折叠蛋白质的清除[2]. CryAB还被证明通过NN2B-U和Ig结构域的直接相互作用结合并增加丝状蛋白titin的去折叠力[三].
已确定CryAB中的几个突变会导致不同组织的退化，包括眼睛晶状体和/或心肌和骨骼肌。在生化水平上，突变的CryAB蛋白在评估时会失去其伴侣样特性在体外客户蛋白[4–6]. 在CryAB中发现的第一个突变是错义突变R120G；它导致显性功能丧失，导致肌原纤维肌病和白内障形成[7]. 转基因小鼠心肌细胞中R120G的过度表达导致其表型与R120G CryAB相关心肌病患者的表型惊人相似[8,9]. 这种表型的特征是蛋白质错误折叠和突变体CryAB的大细胞质聚集。
CryAB的三个截短版本（450delA、Q151X和464delCT）也已确定[10,11]. Berry及其同事首次报道，来自450delA CryAB的分离先天性白内障产生了一种异常蛋白，该蛋白由密码子150第3外显子的移码突变产生，含有184个残基[10]. 塞尔岑和恩格尔[11]首次报道，464delCT CryAB在一名肌原纤维肌病患者中因四肢束带周围无力、膈膜麻痹而死亡，并死于呼吸衰竭。该突变来自464位的2碱基对缺失，产生了162aa的截短蛋白，而不是175个残基。据报道，Q151X和464delCT在转染COS-7细胞或新生心肌细胞中形成细胞质聚集物的趋势增加[12,13]. 截断的CryAB突变倾向于自聚集，这表明C末端延伸对寡聚化很重要[12]. 尽管聚集型CryAB突变在病理学上仅限于晶状体（450delA）或肌肉（Q151X，464delCT）或两者（R120G），但蛋白质聚集是所有四种突变的关键组织病理学特征。
这种病理表现在发病时往往与年龄有关，以组织受限的方式分布，严重程度上具有不同的外显率。然而，可能增加选择性细胞和组织中耐药性和/或敏感性的潜在机制和致病因素仍有部分了解。在抵抗因子中，编码热休克蛋白家族的基因与防止蛋白质错误折叠和改善蛋白质构象疾病中细胞功能的生物过程有关。在本研究中，我们假设真核细胞中主要的27kDa蛋白HSPB1（Hsp27）可能通过其与与蛋白质降解相关的客户蛋白的分子相互作用、减轻蛋白质折叠、凋亡、线粒体相互作用和疾病进展中的伴侣样活性而赋予此类有益特性。
鉴于缺乏有关突变CryAB蛋白分解代谢的降解途径的信息，我们询问泛素-蛋白酶体系统（UPS）或自噬-溶酶体途径是否参与其降解。事实上，我们的研究结果首次表明，HSPB1在突变体CryAB客户端蛋白的UPS依赖性降解中发挥着中心作用，但效率却截然不同。
2.材料和方法
2.2. 细胞培养和转染
H9c2胚胎大鼠心脏细胞在补充有10%胎牛血清（FCS；Invitrogen）和100 u青霉素/100μg链霉素/ml培养基的DMEM（Invitrogen）中在5%的CO中生长2潮湿的大气。炸薯条+/+或CHIP−/−MEF由Cam Patterson（北卡罗来纳大学）提供。
转染前一天，细胞被胰蛋白酶化，并在不含抗生素的生长培养基中电镀，以实现80%的融合。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）在6厘米的培养皿中进行瞬时转染，单个质粒为3μg，两个质粒为6μg。细胞在一氧化碳中培养2在检测转基因表达之前，培养箱中培养48小时。
ON-TARGET加SMART池siRNA大鼠HSPB1（目录号L-080155-00）和非靶向siRNA（目录号D-001810-01-05）来自Thermo Scientific Dharmacon RNAi Technologies。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）与2μg构建物和200 pmol HSPB1 siRNA或非靶向siRNA在6孔板中进行共转染。试验前，将细胞培养72小时。
2.3. 细胞分离、SDS-PAGE和免疫印迹
在6 cm培养皿上生长的细胞在用0.25 ml 50 mM Tris–HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1%Triton X-100溶解之前，用冰镇磷酸盐缓冲盐水冲洗两次。在冰上孵育30分钟后，通过在4°C下以12000 rpm离心10分钟来澄清裂解产物。将上清液用作洗涤剂可溶性组分。将所得颗粒部分洗涤两次，并在100μl 1×SDS缓冲液（50 mM Tris–HCl，pH 6.8，2%SDS，100 mM DTT，10%甘油）中超声处理30 s，作为不溶于洗涤剂的部分。使用1×SDS缓冲液从转染细胞中提取整个细胞裂解液。在12%甘氨酸SDS-PAGE凝胶上分离洗涤剂可溶部分、不可溶部分和全细胞裂解物，并转移到PVDF膜上。室温下，将膜在含0.1%TWEEN-20（TBST）的TBS中5%干乳中封闭1小时，然后与含0.2%BSA的TBST中指示的一级抗体孵育。抗-c-Myc（sc-40，Santa Cruz生物技术）、HRP-结合抗泛素（PW0150，Biomol international）、抗-CHIP（#2080，Cell Signaling Technology）和抗Beclin（#3738，细胞信号技术）在1:1000稀释度下使用。以1:2000稀释度使用抗β-肌动蛋白（A5441，Sigma-Aldrich）、抗GAPDH（#2118，细胞信号技术）、抗HSP25（SPA-801，检测设计，用于大鼠物种HSPB1）和抗HSP27（sc-1049，Santa Cruz生物技术，用于人类物种HSPB）。免疫印迹信号用Super Signal West Pico化学发光底物（Pierce Biotechnology）可视化。
2.4. 免疫荧光显微镜
H9c2细胞在2孔室（3.8 cm）中生长2)，转染所有CryAB突变体，48小时后用PBS洗涤两次，用4%（v/v）多聚甲醛固定，并用0.2%Triton X-100渗透。随后，在室温下将细胞与初级小鼠单克隆c-myc抗体（在PBS中稀释1:200，在1%BSA中）和与Alexa Fluor（Invitrogen）偶联的次级山羊抗鼠抗体（在PBS中稀释1:1000）孵育2小时。使用FV1000-xy倒置共焦显微镜收集图像。
2.5. 环己酰亚胺追踪试验
使用环己酰亚胺酶评估蛋白质稳定性。用编码myc标记的CryAB突变体的质粒瞬时转染H9c2细胞，24小时后，细胞在1×SDS缓冲液中收获前用20μg/ml环己酰亚胺（Sigma）处理指定时间。用抗myc抗体对裂解液（20μg蛋白质/车道）进行Western blot分析。
2.6. 免疫沉淀/免疫印迹
用空载体或CryAB突变编码质粒瞬时转染H9c2细胞，48小时后，用冷PBS洗涤细胞，并在RIPA缓冲液中收获细胞（50 mM Tris–HCl，pH=7.4，150 mM NaCl，1%NP-40，1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS）。将裂解液在4℃下轻轻摇晃30分钟，然后在12000℃下离心克将等分上清液（400μg蛋白质）与来自皮尔斯哺乳动物c-Myc Tag IP/Co-IP试剂盒（Thermo Scientific）的10μl抗c-Myc琼脂糖在旋转柱中孵育10分钟，然后在4°c下旋转过夜。琼脂糖用TBS加0.05%吐温-20洗涤3次，然后用非还原性样品缓冲液洗脱，以尽量减少共洗脱抗体片段的干扰。洗脱的蛋白质在SDS/PAGE凝胶上溶解，并进行Western blot分析。
2.7. 数据分析
所有实验重复3次。对于western blots，图中显示了一个具有代表性的图像。使用Image J软件进行蛋白质印迹信号的密度测定。数值表示为平均值±SE。学生的t吨检验用于统计分析。
3.结果
3.1. 聚集倾向的CryAB突变体在H9c2细胞中表现出不同的溶解度
在条纹组织中，CryAB伴侣与客户蛋白（如结蛋白和titin）相互作用，以保持肌肉完整性并防止蛋白质聚集和变性。相反，伴侣活性的丧失和R120G CryAB突变体聚集性的增加与晶体病变有关[14]. 我们和其他人已经证明，CryAB R120G突变存在于肌病心脏的不溶性部分[8,9]. 为了确定CryAB突变体是否也聚集在H9c2细胞中，我们在转染相应质粒两天后，从表达Myc-tagged野生型（WT）、R120G、450delA和464delCT Cry AB的细胞中检测了全细胞裂解物的免疫印迹()使用抗c-Myc和/或抗CryAB抗体。我们观察到WT、R120G、450delA和464delCT CryAB的蛋白表达水平相似(). 根据设计，抗CryAB抗体可识别WT或R120G中包含的C末端残基，但450delA和464delCT均不缺乏类似残基。在H9c2细胞中，抗CryAB抗体识别内源性CryAB-的基本水平，并且在转染48小时后外源性WT或R120G增加11倍(). 为了评估不同C端CryAB突变体对细胞内溶解性的影响，我们通过SDS-PAGE和免疫印迹检测了洗涤剂可溶性和洗涤剂不溶性组分，使用的抗-Myc抗体专门识别所有外源基因产物(). 正如所料，WT CryAB几乎完全存在于可溶性部分(). R120G在可溶部分和不可溶部分之间的分配几乎相等()而450delA和464delCT几乎完全位于不溶性部分(). 我们的结果概括了CryAB突变体溶解度降低的生化特征体内和在体外.
H9c2细胞中聚集倾向性CryAB突变体的过度表达。（A） 单氨基酸取代（R120G）和缺失（450delA和464delCT）的示意图。（B） 用Myc-tagged WT、R120G、450delA和464delCT质粒瞬时转染H9c2细胞。用抗Myc和抗CryAB探针进行western blot，测定全细胞裂解液中的CryAB-稳态水平。通过用抗β-肌动蛋白抗体重制印迹（下面板）来确认相同的负荷；（C） 使用NIH ImageJ软件对针对β-肌动蛋白标准化的CryAB WT和突变体进行定量。将三个实验中的水平平均并绘制。通过电泳分离转染细胞制备的（D–E）洗涤剂可溶性和（F–G）洗涤剂不溶性组分，并使用抗Myc抗体进行western blot分析，以确定WT和CryAB突变体的溶解度。通过用抗β-肌动蛋白抗体重制印迹，证实了相同的负荷。
3.2. H9c2细胞中CryAB突变体的细胞质聚集形成
为了确定CryAB突变体溶解度降低是否是由于聚集形成所致，我们通过免疫荧光显微镜检查了CryAB-突变体和WT蛋白的细胞内分布。正如所预期的那样，WT CryAB均匀分布在H9c2细胞的细胞质中，而一些表达致病Cry AB突变体的H9c1细胞含有细胞质和/或核周聚集物(). 在10个随机选择的显微镜视野中，我们计算了含有聚集物的c-myc阳性细胞的数量与c-myc阴性细胞总数的关系。表达WT CryAB的细胞均不含聚集物，而表达R120G的细胞含有15±4%的聚集物，相比之下，表达450delA和464delCT的细胞聚集物形成率分别达到50±7%和30±3%(). 450delA和464delCT聚集体的丰度与它们几乎完全在不溶性组分中检测到的一致。
H9c2细胞中CryAB突变体的聚集形成。WT（A）、R120G（B）、450delA（C）和464delCT（D）的典型共焦显微免疫荧光图像。用所指示的表达构建体转染H9c2细胞。48小时后，用抗Myc抗体固定细胞，然后用与Alexa Fluor 488（绿色）偶联的山羊抗鼠IgG进行免疫染色。细胞核被DAPI染成蓝色。箭头表示蛋白质聚集体。
3.3. HSPB1过度表达可选择性增加聚集蛋白CryAB突变体的溶解度
尽管蛋白质聚集体在疾病进展中的确切致病作用仍存在争议[15,16]在实验模型和人类中，这种病理学特征与发病率增加和寿命缩短有关[17]. 因此，人们高度关注利用化学、遗传和其他手段改善蛋白质聚集的策略。HSPB1是sHSPs家族的主要27kDa成员，与天然CryAB形成异寡聚体。据报道，HSPB1在聚集体中积累，聚集体由突变的错误折叠蛋白、泛素、β-微管蛋白、SEC61α和伴侣蛋白组成，可能有助于蛋白质的溶解和/或清除[18]. 在R120G肌病心脏中，我们发现HSPB1在可溶性部分中适度增加，但在不溶性部分中增加了25倍以上。与R120G CryAB的这种共聚集可能会增加R120G心肌病心脏的疾病易感性[9]. 在H9c2细胞中，我们发现所有这些突变的CryAB蛋白都能与HSPB1相互作用(，下部面板）。HSPB1在表达R120G和450delA突变体的细胞的洗涤剂不可溶部分中明显增加，但在表达464delCT突变体细胞的部分中没有增加(、3号车道、4号车道和5号车道）。
用CryAB突变体转染H9c2细胞后HSPB1在亚细胞组分中的分布。（A） 将转染载体CryAB-WT和CryAB突变质粒的H9c2细胞的裂解液进行IP抗Myc，然后进行抗Myc抗体或抗HSPB1抗体（SPA-801）。通过电泳分离转染细胞制备的（B，C）洗涤剂可溶性（B）和洗涤剂不可溶性（C）组分，并使用抗HSPB1抗体进行Western blot分析，以确定HSPB1的分布。通过用抗β-肌动蛋白抗体重制印迹，证实了相同的负荷。
为了研究HSPB1在CryAB突变体聚集形成中的作用，我们用myc标记的CryAB-WT和突变体共同转染了HA标记的人HSPB1。在H9c2细胞中，HSPB1过度表达对WT、R120G或450delA表达的影响可以忽略不计(，通道3-8，上部面板和4B），但显著降低了全细胞裂解液中464delCT的水平(，9–10车道，上部面板和). 此外，HSPB1过度表达后，464delCT有显著的重新分布。在与载体对照联合转染的H9c2细胞中，464delCT几乎完全存在于不溶性部分中。相比之下，HSPB1过度表达后，464delCT仅存在于可溶性组分中，尽管数量有所减少(，9和10号车道，上部面板和;，9和10号车道，上部面板和). 有趣的是，R120G和450delA（而非464delCT）将外源性HSPB1隔离在不溶性组分中(，6、8车道，中间面板）。突变体R120G和450delA对HSPB1的明显优势可能解释了为什么HSPB1的过表达没有增加R120G和/或450delA的溶解度。
HSPB1过度表达对CryAB突变体表达和溶解度的影响。（A、C、E）H9c2细胞与Myc-tagged R120G、450delA或464delCT联合pCMV-HA载体或HA标记的人HSPB1共转染。转染48小时后，使用抗Myc和抗HSPB1抗体（sc-1049）通过免疫印迹分析整个裂解物（A）、洗涤剂可溶性（C）和洗涤剂不溶性（E）级分。箭头表示H9c2细胞中的内源性HSPB1。重制β-肌动蛋白印迹以使蛋白质负荷正常化。（B，D，F）密度测定值表示为以平均任意单位表示的β-肌动蛋白的相对强度*第页与pCMV-HA载体组相比，<0.05。（G） 从10个不同的共聚焦错吸场测定了与Myc-tagged CryAB突变体和pCMV-HA载体或HA标记的人HSPB1共转染的H9c2细胞中c-Myc阳性细胞与聚集物的百分比*第页与pCMV-HA载体相比，<0.01。
与分馏结果一致，共焦图像显示，与HSPB1共转染的464delCT细胞质中出现均匀的弥漫荧光，表明464delCT的聚集形成减少(). 相比之下，HSPB1过度表达对H9c2细胞中R120G或450delA聚集形成的影响微不足道(). 总之，我们的发现表明，CryAB突变体和HSPB1的不同但迄今尚未确定的相互作用似乎会影响CryAB突变体和HSPB1在H9c2细胞中的溶解度。
3.4. HSPB1下调增加CryAB突变蛋白的积累
为了解决HSPB1对突变蛋白降解的影响，我们使用siRNA来降低HSPB1的水平。我们观察到HSPB1的敲低75%增加了所有三种CryAB突变蛋白的浓度(). 然而，生化分级研究表明，可溶性450delA和464delCT CryAB表达水平的降低与可溶性HSPB1水平的降低平行；HSPB1的敲除适度增加了不溶性组分中所有三种CryAB突变蛋白(). 通过免疫细胞化学，我们证实HSPB1 siRNA持续增加表达CryAB聚集体的细胞数量(). 我们得出结论，HSPB1的表达增加了CryAB突变蛋白在基础条件下的溶解度。
HSPB1敲低对CryAB突变体表达和溶解度的影响。（A，C，E）H9c2细胞与Myc-tagged R120G，450delA或464delCT共转染，并与非靶向siRNA或HSPB1 siRNA共转染。转染72 h后，使用抗Myc和抗HSPB1抗体通过免疫印迹分析整个裂解物（A），洗涤剂-可溶性（C）和洗涤剂-不溶性（E）部分。对GAPDH或β-肌动蛋白的印迹进行重新标记，确认负载相等。（B，D，F）密度测定值表示为GAPDH或β-actin的相对强度，以平均任意单位表示*第页<0.05，与非靶siRNA组相比。（G） 从10个不同的共聚焦误吸场测定了与Myc-tagged CryAB突变体和非靶siRNA或HSPB1 siRNA共同转染的H9c2细胞中c-Myc阳性细胞与聚集物的百分比*第页<0.02，与非靶siRNA组相比。
3.5. 聚集倾向CryAB突变体的代谢
促进聚集形成的突变可能会影响蛋白质周转，这可能有助于疾病的发病机制。为了确定CryAB的突变是否会影响蛋白质的周转，我们用环己酰亚胺瞬时转染H9c2细胞。如所示脉冲追踪实验表明，放线菌酮处理后，R120G的水平至少在24小时内保持稳定()但治疗6小时、12小时和24小时后，450delA水平分别降至对照组的77±3.6%、53.4±4%、48.6±2.2%()治疗24小时后，与对照组相比，464delCT突变体降解为83.3±3.7%(). 正如所料，不同的CryAB突变蛋白在H9c2细胞中具有不同的半衰期。
聚集倾向CryAB突变体的代谢。用20μg/ml环己酰亚胺处理转染R120G（A）、450delA（C）或464delCT（E）质粒24 h的（A，C，E）H9c2细胞，并在指定的时间点用1×SDS缓冲液收集细胞。用C-myc抗体通过Western blot分析检测CryAB突变体。GAPDH被用作负荷控制。（B，D，F）不同时间CryAB突变蛋白水平的量化。数值代表平均值±SE，n个=3.
由于HSPB1影响所有三个CryAB突变体的溶解度，我们接下来确定HSPB1是否参与CryAB-突变体蛋白质的周转。如所示，在HSPB1过表达的情况下，R120G CryAB突变体的水平保持稳定(). 有趣的是，HSPB1的过度表达降低了450delA的降解()，但增强了464delCT的降解(). 一种可能的解释是HSPB1过度表达增加了464delCT的溶解度，使其成为降解途径的更好底物。
HSPB1过度表达对聚集倾向CryAB突变体代谢的影响。用20μg/ml环己酰亚胺处理与Myc-tagged R120G（A）、450delA（C）或464delCT（E）联合转染的H9c2细胞，再加上pCMV-HA载体或HA标记的人HSPB1，共转染24 h，并在指定的时间点用1×SDS缓冲液收集细胞。用C-myc抗体通过Western blot分析检测CryAB突变体。GAPDH被用作负荷控制。（B，D，F）在不同时间点对CryAB突变蛋白水平进行量化。数值代表平均值±SE，n个=3.
3.6. 聚集倾向性CryAB突变体的降解由UPS介导，而非宏自噬途径
泛素-蛋白酶体和自噬-溶酶体途径是真核生物蛋白质降解的两条主要途径。为了确定蛋白酶体途径在清除聚集倾向的CryAB突变体中的作用，将蛋白酶体抑制剂MG132和环氧霉素应用于转染适当质粒的H9c2细胞。我们观察到蛋白酶体途径的抑制导致所有三个CryAB突变体的积累()，表明它们至少部分地被UPS降级。
聚集倾向的CryAB突变体通过泛素-蛋白酶体途径降解，但不通过宏观自噬途径降解。将转染CryAB突变质粒的（A，C）H9c2细胞在细胞培养基中暴露于5μM MG-132（A）、1μM Epoxomicin（C）或DMSO，作为对照，再暴露15 h。在12%SDS-PAGE凝胶上分离全细胞裂解物。使用C-myc抗体检测CryAB突变体，并通过检测β-肌动蛋白检查负载。（B，D）MG-132（B）或Epoxomicin（D）处理后CryAB突变蛋白水平的定量。数值代表平均值±SE，n个=3. *第页与DMSO组相比，<0.05。将转染R120G、450delA或464delCT的（E，F）H9c2细胞暴露于0.4μg/ml雷帕霉素（E）、10 mM 3-MA或80 nM巴非霉素A1（F）中指定的时间。在12%SDS-PAGE凝胶上分离全细胞裂解物，并用抗myc、抗LC3、抗beclin和抗p62抗体进行检测。通过用抗β-肌动蛋白抗体重制印迹，证实了相同的负荷。所有实验重复3次。显示了一个具有代表性的斑点。
自噬有三种类型：宏观自噬、伴侣介导的自噬（CMA）和微观自噬。雷帕霉素是一种抗真菌抗生素，广泛用于刺激大细胞自噬[19]而3-甲基腺嘌呤（3-MA）和Bafilomycin A1是该过程的特征性抑制剂[20,21]. 由于巨自噬被认为是自噬的主要类型，我们使用这些化合物来研究H9c2细胞中聚集倾向的CryAB突变体是否通过宏自噬-溶酶体途径降解。用编码聚集倾向CryAB突变体的质粒瞬时转染后，H9c2细胞暴露于雷帕霉素不同时间点。Western印迹分析显示，用雷帕霉素处理24小时或48小时后，CryAB突变蛋白的水平没有降低，但雷帕霉素处理后，自噬活性的两个标志物beclin和LC3-II升高，而自噬的选择性底物p62在雷帕霉素处理后降低(). 用3-MA和Bafilomycin A1抑制大自噬24小时也没有导致突变CryAB蛋白水平的明显增加(). 大自噬激活剂或抑制剂化合物对CryAB突变蛋白水平没有任何影响，这表明它们在H9c2细胞中通过大自噬途径降解。
3.7. 泛素结合物在表达聚集倾向CryAB突变体的H9c2细胞中的积累
许多研究表明，UPS功能异常与一系列聚丙基谷氨酰胺神经退行性疾病有关。我们之前已经证明，表达CryAB R120G小鼠而非WT-CryAB小鼠的心脏中泛素化蛋白逐渐增加[22]. 为了探讨聚集蛋白CryAB突变体对UPS蛋白水解功能的任何影响，我们测量了瞬时转染H9c2细胞的全细胞裂解液中的多泛素化蛋白水平。表达R120G和450delA突变体的H9c2细胞中积累的几种不同的泛素结合物(不同于蛋白酶体抑制后观察到的各种类型的多泛素结合物水平的显著增加(). 它们的分子量表明，这些独特物种是CryAB-ubiquitin结合物。为了验证这一假设，使用抗c-myc琼脂糖对myc标记的CryAB突变体进行免疫沉淀，免疫沉淀分析证实R120G或450delA或其相互作用蛋白的泛素化增加(，车道3和车道4）。我们的数据表明，在H9c2细胞中R120G和450delA突变体中泛素结合物的积累不是整体蛋白酶体抑制的结果。
泛素化结合物在R120G和450delA转染的H9c2细胞中积累。（A） 用载体CryAB-WT和CryAB突变质粒瞬时转染H9c2细胞48 h，并用泛素抗体检测单或多泛素化蛋白。箭头显示了异常的泛素化结合物。使用5或10μM MG132处理H9c2细胞，以显示蛋白酶体抑制下的全局多泛素化蛋白。（B） 将转染载体CryAB-WT和CryAB突变质粒的H9c2细胞裂解液进行IP抗Myc，然后进行抗泛素免疫印迹（上部）或抗Myc抗体（中部）。
3.8. HSPB1的过度表达或下调导致多泛素结合物的差异性变化
我们以前的数据表明，HSPB1的过度表达或敲低都会影响聚集蛋白CryAB突变体的溶解性、稳定性和降解。热休克蛋白27（HSP27）和26S蛋白酶体在aggresome中的Colocalization表明HSP27在泛素依赖性降解中发挥作用。最近，Garrido等人[23,24]据报道，HSPB1在各种细胞类型中的过表达增强了26S蛋白酶体对泛素化蛋白的降解。我们目前的数据表明，HSPB1过度表达分别降低了基础状态和464delCT转染细胞中泛素化蛋白的丰度，但在R120G和450delA突变体中没有降低()这与HSPB1过度表达降低464delCT水平一致。在蛋白酶体抑制剂MG132的存在下，HSPB1过度表达对464delCT的降解被消除(). 此外，HSPB1敲除增加了表达所有三个CryAB突变体的细胞中的多泛素结合物。总之，HSPB1对R120G、450delA和464delCT突变体的选择性降解是由泛素-蛋白酶体系统介导的。
HSPB1通过泛素-蛋白酶体途径选择性降解聚集型CryAB突变体。（A） 用抗泛素抗体检测Myc-tagged R120G、450delA或464delCT与pCMV-HA载体或HA标记的人HSPB1共转染后的全细胞裂解物。重新标记β-肌动蛋白印迹，确认负载相等。（B） 用CryAB突变质粒转染H9c2细胞，再加上pCMV-HA载体或HA标记的人HSPB1，在细胞培养基中再暴露5μM MG-132 15 h。以β-肌动蛋白为负荷对照。（C） MG-132处理后CryAB突变蛋白水平的定量。数值代表平均值±SE，n个=3. *第页与载体组相比，<0.05#第页与HA-HSPB1组相比，<0.05。（D） 用抗泛素抗体检测与非靶siRNA或特异性HSPB1 siRNA共转染的Myc-tagged R120G、450delA或464delCT的全细胞裂解物。重新标记β-肌动蛋白印迹，确认负载相等。
4.讨论
在发现错义R120G hCryAB导致人类多系统疾病（称为“结蛋白相关肌病”）后，对突变伴侣分子发病机制的探索引起了人们的极大关注。众所周知，热休克蛋白在蛋白质构象疾病中起到保护作用，并为聚集蛋白提供第一道防线，因为它们能够增强错误折叠蛋白的适当折叠[25,26]. 我们目前的研究旨在检测涉及其他两个致病CryAB突变体450delA和464delCT的细胞机制，以及相关蛋白聚集体是否与瞬时转染H9c2细胞时HSPB1表达的生物物理和结构特性有关。
R120G代表典型的错义CryAB突变，而450delA和464delCT分别导致了与全长Cry AB相比的延伸和截断。以前，这两个突变体都是从包涵体中纯化出来的，并且只能在野生型CryAB存在的情况下进行重折叠在体外[12]. 我们目前的工作表明，450delA和464delCT主要存在于瞬时转染H9c2细胞的不溶性部分(和). 由于C末端区域有助于450delA和464delCT的溶解度，可以想象，用截短蛋白中的错义残基替换正常C末端会改变与HSPB1的溶解性或伴随相互作用。
HSPB1，受HSF1转录控制[27]在许多蛋白质构象疾病中积聚成包涵体[28]. 例如，查韦斯·佐德尔（Chavez Zodel）及其同事证明HSPB1可以防止PTK2细胞中R120G CryAB的错误折叠、寡聚和攻击性形成[18]. 同样，伊藤和同事们[29]据报道，HSPB1在HeLa细胞中的表达减少了包涵体的数量，并增加了R120G-CryAB的溶解度。在本研究中，我们的数据表明，HSPB1过度表达对R120G或450delA的溶解度影响微乎其微，但显著增加了464delCT CryAB的溶解力(). HSPB1过度表达的这种选择性效应并不排除其在基础条件下蛋白质降解中已确立的生物学作用。具体而言，我们发现HSPB1敲低显著降低了所有三个CryAB突变体的溶解度和清除率()表明单个CryAB突变体和HSPB1之间的这些不同反应可能为H9c2细胞的关键生物学特性提供了新的见解。
小的热休克蛋白具有三个结构域：一个中央保守的α-晶体蛋白结构域，两侧是N端和C端可变结构域。N末端区域被指定为寡聚、亚基组装和底物结合的特性；同时，C末端结构域对溶解度和伴侣功能起着关键作用[30]. 如所示，最近的结构-功能分析将C末端区域细分为“尾部”和“延伸”亚区，这两个亚区在功能上分别与同源二聚和底物识别有关[31]. 尾部亚区促进sHSP二聚体的结合，而延伸亚区分解二聚体并增加溶解性。
C-末端亚区的这种相反影响表明了几个潜在的结果。一种可能性是C末端亚区的长度影响其蛋白质溶解度。在CryAB突变体中，464delCT截短被HSPB1过表达所溶解。或者，464delCT的较短延伸增加其客户蛋白识别。有趣的是，聚集蛋白R120G和450delA的C末端延伸均大于464delCT，这表明HSPB1过度表达可能是一种溶解机制。当结合其致病功能时体内，我们相信CryAB突变体之间的这些序列变化有助于我们发现HSPB1依赖于蛋白质溶解度和聚集的相互作用。
HSPB1选择性降解H9c2细胞中的464delCT，但R120G和450delA都没有，增溶可能会产生什么后果？半衰期短的蛋白质大多被蛋白酶体降解，半衰期长的细胞溶质蛋白质也被自噬途径降解[32,33]. 泛素-蛋白酶体系统（UPS）降解短命核蛋白或细胞溶质蛋白以及从内质网中挤出的错误折叠蛋白[34]. 通过识别和选择性降解错误折叠的蛋白质，UPS保护细胞免受蛋白质聚集的潜在毒性影响[34]. UPS的底物需要展开才能通过狭窄的桶形蛋白酶体，这使得易于聚集的蛋白质成为UPS的不良底物[35,36]. 我们的数据表明可溶的但非不溶性CryAB突变体在H9c2细胞中通过泛素-蛋白酶体途径被降解，蛋白酶体的抑制均显著增加了突变体Cry AB的水平。我们发现，与464delCT相比，放线菌酮处理24小时后464delCT/HSPB1的联合表达显著降低蛋白质含量()强烈支持HSPB1过度表达对蛋白质清除或稳定性或两者都有直接影响的观点。这些证据表明，针对464delCT的治疗性干预可能会逆转主要的负面影响，这一有趣的可能性体内[11].
自噬可以通过介导溶酶体中细胞质蛋白的大量降解，通过去除过大的聚集物来有效清除蛋白酶体介导的蛋白酶体，从而减轻蛋白酶体抑制[37]. 令人惊讶的是，我们发现H9c2细胞中的CryAB突变体R120G、450delA和464delCT并不依赖于宏自噬途径进行降解。然而，缺乏宏观自噬证据可能是实验系统CryAB突变体在H9c2细胞中24小时或48小时表达的局限性。这与Wong最近的报告一致等. [38]这表明并非所有的蛋白内含物或攻击性蛋白都会被自噬降解。可以想象，突变型CryABs过度表达并不能如实地再现完整器官或生物体中发现的（病理）生理因素代谢、慢性病和其他环境因素。
尽管定义了影响聚集蛋白降解的因素，但可能会发现新的途径作为治疗干预的药物靶点[39]. 很容易推测HSPB1过度表达可能会对疾病的表现和/或进展（如464delCT）产生直接的有益影响，而类似的操作可能对完整生物体中的R120G和/或450delA产生轻微或有害的后果。我们前面的研究将为在人类疾病（病理）生理相关动物模型中检验这些假设提供概念证明。
致谢
这项工作得到了国家心脏、肺和血液研究所（ARRA Award 2 R01 HL063834-06 to IJB）、2009 NIH董事先锋奖1DP1OD006438-01、克里斯蒂·T·史密斯基金会（IJB。我们感谢贾斯汀·贝内什（牛津大学）提出的有益建议。詹妮弗·施洛夫（Jennifer Schroff）在编写这份手稿的过程中提供了出色的编辑协助。
补充数据可以在doi:10.1016/j.yjmcc.2010.09.004上找到本文的相关内容。
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1Piatigorsky J.晶状体蛋白及其基因：多样性和组织特异性表达。美国财务会计准则委员会J。1989;三(8):1933–40.[公共医学][谷歌学者] 2Benjamin IJ，McMillan DR.应激（热休克）蛋白质：心血管生物学和疾病中的分子伴侣。Circ研究。1998;83:117–32.[公共医学][谷歌学者] 三。Zhu Y，Bogomolovas J，Labeit S，Granzier H。心肌组织中titin N2B元素的单分子力谱：分子伴侣αB-晶体蛋白对疾病致病突变的影响。生物化学杂志。2009;284(20):13914–23. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Kumar LV，Ramakrishna T，Rao CM。αa和αB结晶蛋白中保守精氨酸残基突变的结构和功能后果。生物化学杂志。1999;274(34):24137–41.[公共医学][谷歌学者] 5Perng MD、Muchowski PJ、van Den IP、Wu GJ、Hutcheson AM、Clark JI等。αB-晶体蛋白中的心肌病和晶状体白内障突变改变了其蛋白质结构、伴侣活性以及与体外中间丝的相互作用。生物化学杂志。1999;274(47):33235–43.[公共医学][谷歌学者] 6Bova MP、Yaron O、Huang Q、Ding L、Haley DA、Stewart PL等。αB-晶体蛋白R120G突变与结蛋白相关肌病有关，导致结构不规则和伴侣样功能缺陷。美国国家科学院程序。1999;96(11):6137–42. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Vicart P、Caron A、Guicheney P、Li Z、Prevost MC、Faure A等。αB-晶体蛋白伴侣基因的错义突变导致结蛋白相关肌病。自然遗传学。1998;20(1):92–5.[公共医学][谷歌学者] 8Wang X，Osinska H，Klevitsky R，Gerdes AM，Nieman M，Lorenz J等。R120G-alphaB-crystallin的表达导致小鼠结蛋白和alphaB-晶体蛋白异常聚集和心肌病。Circ研究。2001;89(1):84–91.[公共医学][谷歌学者] 9.Rajasekaran NS、Connell P、Christians ES、Yan LJ、Taylor RP、Orosz A等。人类αB晶体蛋白突变导致小鼠氧化还原应激和蛋白聚集性心肌病。单元格。2007;130(3):427–39. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Berry V、Francis P、Reddy MA、Collyer D、Vithana E、MacKay I等。α-B晶体蛋白基因（CRYAB）突变导致人类显性先天性后极性白内障。美国人类遗传学杂志。2001;69(5):1141–5. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Selcen D，Engel AG。新型显性负性α-B-晶体蛋白突变引起的肌原纤维肌病。Ann Neurol公司。2003;54(6):804–10.[公共医学][谷歌学者] 12Hayes VH、Devlin G、Quinlan RA。肌病引起的Q151X突变截断αB-晶体蛋白，显著破坏蛋白质的稳定性，导致转染细胞中聚集形成。生物化学杂志。2008;283(16):10500–12. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Simon S、Fontaine JM、Martin JL、Sun X、Hoppe AD、Welsh MJ等。肌病相关αB-晶体蛋白突变体：异常磷酸化、细胞内位置以及与其他小热休克蛋白的相互作用。生物化学杂志。2007;282(47):34276–87.[公共医学][谷歌学者] 14Goldfarb LG、Olive M、Vicart P、Goebel HH。中间丝疾病：韧带病。高级实验医学生物。2008;642:131–64. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Arrasate M、Mitra S、Schweitzer ES、Segal MR、Finkbeiner S。包涵体形成降低突变型亨廷顿蛋白水平和神经元死亡风险。自然。2004;431(7010):805–10.[公共医学][谷歌学者] 16Takahashi T、Kikuchi S、Katada S、Nagai Y、Nishizawa M、Onodera O。包涵体形成前形成的可溶性聚谷氨酰胺低聚物具有细胞毒性。Hum Mol基因。2008;17(3):345–56.[公共医学][谷歌学者] 17Perutz MF，Windle AH公司。谷氨酰胺重复序列增加导致神经退行性疾病中神经死亡的原因。自然。2001;412(6843):143–4.[公共医学][谷歌学者] 18Chavez Zobel AT、Loranger A、Marceau N、Theriault JR、Lambert H、Landry J.独特的伴侣机制可以通过引起肌病的R120GαB-晶体蛋白突变体延迟攻击性蛋白的形成。Hum摩尔将军。2003;12(13):1609–20.[公共医学][谷歌学者] 19Ravikumar B、Vacher C、Berger Z、Davies JE、Luo S、Oroz LG等。在亨廷顿病的苍蝇和小鼠模型中，抑制mTOR可诱导自噬并降低聚谷氨酰胺扩增的毒性。自然遗传学。2004;36(6):585–95.[公共医学][谷歌学者] 20Seglen PO、Gordon PB。3-甲基腺嘌呤：分离大鼠肝细胞自噬/溶酶体蛋白降解的特异性抑制剂。美国国家科学院程序。1982;79(6):1889–92. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Yamamoto A、Tagawa Y、Yoshimori T、Moriyama Y、Masaki R、Tashiro Y。Bafilomycin A1通过抑制大鼠肝癌细胞系H-4-II-E细胞中自噬体和溶酶体之间的融合来防止自噬空泡的成熟。细胞结构功能。1998;23(1):33–42.[公共医学][谷歌学者] 22Chen Q，Liu JB，Horak KM，Zheng H，Kumarapeli AR，Li J，等。肌浆内淀粉样变通过影响底物摄取损害心肌细胞蛋白酶体的蛋白水解功能。圆形Res。2005;97(10):1018–26.[公共医学][谷歌学者] 23Parcellier A、Schmitt E、Gurbuxani S、Seigneurin Berny D、Pance A、Chantome A等。HSP27是一种参与IκB蛋白酶体降解的泛素结合蛋白。分子细胞生物学。2003;23(16):5790–802. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Parcellier A、Brunet M、Schmitt E、Col E、Didelot C、Hammann A等。HSP27有利于p27Kip1的泛素化和蛋白酶体降解，并有助于应激细胞中S期的重新进入。美国财务会计准则委员会J。2006;20(8):1179–81.[公共医学][谷歌学者] 25Firdaus WJ、Wyttenbach A、Diaz-Latoud C、Currie RW、Arrigo AP。分析由扩大的聚谷氨酰胺亨廷顿蛋白外显子1诱导的氧化事件，这些外显子通过热休克蛋白的表达或抗氧化剂的治疗进行差异性恢复。FEBS J公司。2006;273(13):3076–93.[公共医学][谷歌学者] 26Wyttenbach A、Sauvageot O、Carmichael J、Diaz-Latoud C、Arrigo AP、Rubinsztein DC。热休克蛋白27可防止细胞聚谷氨酰胺毒性，并抑制亨廷顿蛋白引起的活性氧物种增加。Hum Mol基因。2002;11(9):1137–51.[公共医学][谷歌学者] 27Christians ES、Yan LJ、Benjamin IJ。热休克因子1和热休克蛋白：防止急性细胞损伤的关键伙伴。关键护理医学。2002;30（1补充）：S43–50。[公共医学][谷歌学者] 28Muchowski PJ，Wacker JL。分子伴侣对神经变性的调节。国家版次。2005;6(1):11–22.[公共医学][谷歌学者] 29Ito H、Kamei K、Iwamoto I、Inaguma Y、Tsuzuki M、Kishikawa M等。Hsp27抑制由R120GαB-晶体蛋白表达诱导的包涵体形成，这是结蛋白相关肌病的一个原因。细胞分子生命科学。2003;60(6):1217–23. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Sun Y，MacRae TH。小分子热休克蛋白：分子结构和伴侣功能。细胞分子生命科学。2005;62(21):2460–76. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Laganowsky A、Benesch JL、Landau M、Ding L、Sawaya MR、Cascio D等。截短的αA和αB结晶蛋白的晶体结构揭示了对晶状体功能重要的多分散性的结构机制。蛋白质科学。2010;19(5):1031–43. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Glickman MH，Ciechanover A.泛素蛋白酶体蛋白水解途径：为了构建而破坏。Physiol修订版4月。2002;82(2):373–428.[公共医学][谷歌学者] 33自噬：在疾病和健康中。趋势细胞生物学。2004;14(2):70–7.[公共医学][谷歌学者] 34Hershko A，Ciechanover A.泛素系统。生物化学年度收益。1998;67:425–79.[公共医学][谷歌学者] 35Verhoef LG，Lindsten K，Masucci MG，Dantuma NP。聚集体形成抑制聚谷氨酰胺蛋白质的蛋白酶体降解。Hum Mol基因。2002;11(22):2689–700.[公共医学][谷歌学者] 36Stefanis L、Larsen KE、Rideout HJ、Sulzer D、Greene LA。PC12细胞中A53T突变而非野生型α-同核蛋白的表达会导致泛素依赖性降解系统的改变、多巴胺释放的丧失和自噬细胞死亡。神经科学杂志。2001;21(24):9549–60. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37Yolimitsu T，Klionsky DJ。自噬：自我吞噬的分子机制。细胞死亡不同。2005;12（补充2）：1542–52。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 38Wong ES、Tan JM、Soong WE、Hussein K、Nukina N、Dawson VL等。自噬介导的侵害者清除并非普遍现象。Hum Mol基因。2008;17(16):2570–82. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Sajjad MU、Samson B、Wyttenbach A.热休克蛋白：慢性神经变性的治疗药物靶点？当前药物生物技术。2010;11(2):198–215.[公共医学][谷歌学者] 
