介绍
维甲酸（RA）是脊椎动物发育和体内平衡的重要调节因子，因为它在细胞凋亡、细胞分化和增殖等基本过程中发挥作用1;2RA的作用是通过与作为核受体（NR）超家族成员的维甲酸受体（RAR）结合来介导的三有三种不同的RAR：RARα（NR1B1）、RARβ（NR1B2）和RARγ（NR1B3），它们在大多数细胞类型中表达4NR超家族成员是DNA结合转录因子，其调节转录的能力受到特定配体结合的调节4;5;6;7RAR和其他非甾体激素受体，如维生素D受体（VDR）和甲状腺激素受体（TR），作为异二聚体与一个维甲酸X受体结合到靶基因调控元件内的激素反应元件（HRE）。相反，类固醇激素受体，包括雌激素（ER）、雄激素（AR）、孕激素（PR）和糖皮质激素（GR）受体，作为同二聚体结合到各自的HRE三.
在缺乏配体的情况下，RAR-RXR异二聚体被认为与RARE结合，并通过与辅压因子（CoR）NCoR或SMRT结合而主动抑制转录7;8;9这两种蛋白质存在于含有组蛋白脱乙酰酶（HDAC）HDAC3的阻遏复合物中10;11HDAC可以使组蛋白N末端尾部的赖氨酸残基脱乙酰12组蛋白尾部乙酰化缺失通过形成更浓缩的核小体结构阻止转录13以及降低通过溴代多巴胺与组蛋白尾部结合的辅活化因子的亲和力14在与生理激动剂RA结合后，RAR-RXR异二聚体发生构象变化，导致共抑制复合物的释放三随后，RAR-RXR异二聚体可与辅活化剂结合15，如类固醇受体辅激活因子（p160s）16，组蛋白乙酰转移酶（HAT）p300/CBP4和其他。由这些辅活化子介导的组蛋白修饰可以为含有特殊溴代腺嘌呤的染色质修饰物创建结合位点17;18许多依赖ATP的染色质重塑物（SWI/SNF）利用ATP水解的能量重新定位核小体，其中含有溴代腺苷，因此可以针对有标记的核小体19.特定组蛋白残基的乙酰化20染色质重塑导致染色质纤维的去凝聚，从而更容易招募RNA聚合酶II和RA介导转录所需的其他蛋白质21;22最近有研究表明，为了发生RAR介导的转录，需要拓扑异构酶II（TopoIIβ）和聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP-1）在RA靶基因（RARβ）处形成双链断裂启动子中间产物23此外，在RARβ转录开始之前，PARP-1是转录机制元件移位所必需的24.
调控胚胎模式和器官发生的同源盒（Hox）蛋白的表达25RA可激活胚胎癌细胞（EC）和胚胎干细胞（ES）26;27在许多Hox基因的增强子中发现了维甲酸反应元件（RARE）26;28;29Hox基因表达也受Polycomb组蛋白（PcG）负调控30尽管PcG蛋白被招募到Hox基因中的机制尚未确定。生物化学和遗传学研究表明，PcG蛋白存在于至少两个单独的蛋白质复合体中：多梳抑制复合体2/3（PRC2）和多梳抑制复合物1（PRC1）30;31PRC2/3被认为参与基因沉默的启动，而PRC1则参与基因抑制的稳定维持。SUZ12是PRC2/3复合物的组成部分，也是SUZ12 mRNA的表达，在结肠、乳腺和肝脏肿瘤中上调32此外，PRC2复合物包含组蛋白甲基转移酶EZH2，它可以将组蛋白H3（H3K27me3）的赖氨酸27（K27）三甲基化33.H3K27的甲基化体外增加色域蛋白Polycomb（Pc）与染色质的结合33;34;35因此，H3K27三甲基化被认为是PRC1募集的结合位点。
染色质免疫沉淀分析（ChIP）已广泛用于监测各种NR（最显著的是ER）和辅因子被招募到调节元件以响应配体的动力学研究36;37;38然而，关于RARE上转录复合物组装动力学对RA的反应的研究还很有限19;24;39大部分工作都完成了体外用重组染色质模板。因此，我们启动了实验来监测RA治疗期间F9 EC细胞中RAR-RXR异二聚体和辅因子与RARE的关联动力学。特别是，我们解决了在没有配体的情况下RAR-RXR异二聚体是否与RARE结合的问题。此外，我们监测了联合激活剂被招募到调节区域以应对RA的动力学。我们还监测了组蛋白修饰（例如乙酰化和甲基化），这些修饰通常与RA治疗期间这些RARE的转录激活有关。最后，观察到Hox基因同时受RA和PcG蛋白调节，促使我们研究PcG蛋白质是否与RA调节元件相关，以及RA对这种关联有何影响。
结果
霍克萨1,Cyp26A1细胞、和风险调整比率β2在RA-处理的F9细胞中以类似的动力学诱导mRNA
我们选择F9 EC细胞系作为模型系统来研究所有-反式-维甲酸（RA）介导的转录调控。F9细胞对RA治疗的反应是分化为原始内胚层三;40我们的研究重点是霍克萨1,第26周期、和风险调整比率β2基因，因为这三个基因通过特征良好的RARE被RA转录激活26;41;42;43用1μM RA处理野生型F9细胞不同时间，获取RNA。通过半定量RT-PCR监测所选靶基因的表达。这个霍克萨1,Cyp26A1细胞、和风险调整比率β2RA以相似的动力学强烈诱导基因(). 三个靶基因的表达可以在添加RA后两小时内检测到，并且表达水平在12至24小时内持续增加。为了确保在RT-PCR分析中使用每个时间点的等量RNA，核糖体磷酸蛋白36B4“看家基因”的表达44受到监测，并显示不会因RA治疗而波动().
RT-PCR测定F9细胞RA靶基因的诱导。（A）F9细胞用RA处理指定时间，并采集RNA。采集的RNA通过半定量RT-PCR进行分析。每个实验重复至少3次；显示的数据来自一个实验。通过连续稀释24小时时间点模板证明PCR反应的线性。通过标准凝胶电泳观察产品。（B）实时PCR定量RT-PCR产物。结果显示了三个独立实验（±SE）的平均值，每个定量PCR均进行了三次。每个图形的y轴具有不同的比例。
半定量RT-PCR结果通过实时PCR分析得到确认和定量(). 用RA治疗两小时后，所有三个RA靶基因的诱导率均超过三倍(). 用1μM RA处理F9细胞24小时后，每个RA靶基因的诱导率都超过28倍。实时PCR结果证实，在RA时间进程治疗期间，36B4 mRNA水平没有显著变化().
RA治疗前后F9细胞中RARγ和RXRα与RARE相关
目前公认的核受体基因调控模型认为，RAR-RXR异二聚体在缺乏配体的情况下与RARE结合，并通过招募NcoR和SMRT等共抑制因子来积极抑制转录三;8因此，人们认为RAR-RXR异二聚体与RARE构成关联，并且这种关联不受配体暴露的影响。我们通过使用2步ChIP分析来检测RA治疗前和治疗期间F9细胞中RARγ和RXRα与RARE的相关性，从而验证了这一假设。我们无法使用标准的ChIP分析检测RARγ与目标RARE的关联，因此使用了最近描述的更灵敏的两步交联方案45细胞在RA存在或不存在的条件下培养不同时间，然后用蛋白交联试剂二巯基戊二酸（DSG）处理。然后按照传统的ChIP分析方法将细胞固定在甲醛中，并按所述制备可溶性染色质。使用RARγ和RXRα抗体从可溶性染色质中免疫沉淀蛋白-DNA复合物。非特异性兔IgG抗体也用作2步ChIP分析的阴性对照。
我们特别监测了RARγ和RXRα与霍克萨126和风险调整比率β246RARE以及两个已知的调节第26周期. The霍克萨1RARE位于霍克萨1基因，而风险调整比率β2RARE位于转录起始位点上游约55 bp().第26周期包含转录起始位点上游约70 bp的RARE，标记为R142以及最近描述的表示为R2的RARE43，发现R1上游约1950 bp(). 此外，我们监测了RARγ-RXRα与霍克萨1基因（PP）(). 通过蛋白质印迹和免疫沉淀（IP）分析证明了RARγ抗血清的特异性(). 据我们所知，我们的研究是首次监测活细胞中RARγ同型与RARE的特异性关联。作为ChIP分析中DNA非特异性免疫沉淀的对照，我们还测量了位于霍克斯b1基因（−18kb霍克斯b1). 还进行了非特异性IgG对照(). 通过实时PCR检测对ChIP检测中恢复的上述基因座水平进行定量。我们定义褶皱富集作为IP中特定位点的输入%除以霍克斯b1相同IP中的−18kb 3'阴性对照区().
RA治疗期间F9细胞中RARg和RXRa与RARE的关联。（A）ChIP分析中监测的与各自转录起始位点相关的位点图。DNA由细黑线表示。灰色方框表示DNA转录到mRNA的区域，而黑色方框表示mRNA拼接和翻译的区域。RARE的位置由向下的箭头指示，实际的RARE序列直接显示在箭头下方，用粗体字母表示结合位点。弯曲的箭头表示转录起始位点，而阴影标记表示外显子/内含子基因结构，这还没有详细说明。粗黑线表示ChIP分析期间DNA扩增的区域。示意图大致按比例绘制。（B）证明抗RARγ抗体的特异性。从Cos细胞制备全细胞提取物（WCE），这些Cos细胞要么模拟转染（m），要么转染表达RARγ（γ）、RARβ（β）或RARγ的质粒。在12%SDS-PAGE凝胶上运行每种Cos-WCE 5 mg，然后进行Western Blot分析。使用1:200稀释度的抗-RARγ蓝洗脱液检测RARγ。实验进行了3次。（C）免疫沉淀分析也证实了RARγ抗血清的特异性。模拟转染（m）或转染表达RARβ（β）或RARγ（γ）的质粒的Cos细胞被代谢标记为(35S） 蛋氨酸。从这些细胞中制备细胞提取物，并与RARγ抗血清一起用于IP（D）F9细胞经RA处理不同时间后，用DSG和甲醛固定细胞并加工成可溶性染色质。用RARγ、RXRα或IgG抗体对染色质样品进行免疫印迹，并用实时PCR定量结合DNA。折叠富集被定义为IP中特定位点的输入百分比除以同一IP中Hoxb1−18kb 3'阴性对照区的输入百分比。每个实验至少重复三次，每个样品的定量PCR分析一式三份。数据表示为免疫沉淀前输入DNA的百分比（平均值±SE）。使用Graphpad Prism 4.0进行统计分析。*符号表示统计显著差异(第页<0.05）。在统计学上存在显著差异(第页<0.05）在所有RARγIP和非特异性IgG阴性对照之间，以及在所有检测的RARE中所有RXRαIP和IgG阳性对照之间，但没有统计学意义(第页>0.05）相对于IgG阴性对照，RARγ和RXRα之间观察到的差异霍克萨1第页。
发现RARγ和RXRα与霍克萨1罕见，无论是否存在RA(). 在利用未经处理的F9细胞制备的可溶性染色质进行ChIP分析时霍克萨1与使用非特异性IgG在IP中发现的约1.6倍富集相比，RXRa IP中观察到RARE(，左上面板，0h）。此外，我们观察到约8.8倍的霍克萨1利用相同可溶性染色质的RARγIP中的RARE。RXRα与霍克萨1RARE不受RA的影响，因为RA治疗期间浓缩水平保持相对稳定(，左上面板）。RARγ水平霍克萨1RA治疗后RARE增加(，左上面板，比较0h、2h和6h，第页值<0.05）。相反，RARγ和RXRα与霍克萨1自该位点在RARγ和RXRαIP中的富集水平以来，PP区域与在非特异性IgG IP中观察到的富集水平相似(，上部中间面板）。
RARγ和RXRα也与第26周期RA治疗前F9细胞中的R1和R2 RARE(，0小时）。对于第26周期在所有测试时间点，与R1 RARE相比，R2 RARE的RARγ和RXRα水平更高。例如，与这些相同IP中R1 RARE的约5.5倍富集相比，0小时时RXRαIP中R2 RARE的富集约22倍(，下部面板，0h）。这些结果与最近的一份报告一致，该报告表明，在瞬时转染试验中，R2 RARE介导的RA诱导水平高于R1 RARE43用RA处理F9细胞并没有改变RXRα或RARγ与第26周期RARE（稀有）(，下部面板）。RARγ的富集水平高于RXRα第26周期R2在所有时间点都很稀少。
RARγ和RXRα与风险调整比率β2RA治疗前罕见(，右下面板0 h）。我们在风险调整比率β2RARE与最近的一份报告一致，其中发现RAR与风险调整比率β2RA处理小鼠EC P19细胞中的启动子24再次，我们没有观察到RARγ与风险调整比率β2罕见。然而风险调整比率β2RA治疗期间RARE降低(，比较0小时和24小时）。根据中显示的结果，我们得出结论，在RA治疗之前和期间，RARγ和RXRα与RARE相关。
在RA治疗F9细胞的过程中，共激活物p300和pCIP的招募与RARE类似
接下来，我们通过使用传统的1步ChIP分析，研究了RA刺激的辅因子募集到RARE的动力学。具体来说，我们追踪了p160共激活物pCIP的相关性16，以及组蛋白乙酰转移酶p3004在RA治疗F9细胞期间，RARE。在添加RA之前，低水平的pCIP与霍克萨1很少，因为有约2.2倍的霍克萨1相对于−18kb而言，稀少霍克斯b1负控制轨迹(，左上面板，0h）。RA治疗2小时后，pCIP在霍克萨1相对于−18kb而言，稀少霍克斯b1阴性控制位点。正如预期的那样，−18kb的水平霍克斯b1RA治疗后，“阴性对照”基因座在ChIP分析中没有增加(). 此外，在使用非特异性兔IgG的ChIP分析中，免疫沉淀的测试位点数量与霍克斯b1在所有测试时间点免疫沉淀的−18kb阴性对照区（数据未显示在，请参阅). pCIP水平在霍克萨1PP区域()，表明辅激活子pCIP被特异性招募到下游并发挥其作用霍克萨1增强剂。
RA治疗期间F9细胞中pCIP和p300对RARE的招募。用RA处理F9细胞不同时间。然后用甲醛固定细胞并加工成可溶染色质。染色质样品用免疫沉淀（A）抗pCIP抗体或（B）抗p300抗体和结合DNA通过实时PCR定量。为了进行比较，用霍克斯b1−18kb 3'阴性对照基因座。每个实验至少重复三次，每个样品的定量PCR分析一式三份。数据表示为免疫沉淀前输入DNA的百分比（平均值±SE）。使用Graphpad Prism 4.0进行统计分析。统计样本(第页<0.05）不同于时间0的样本用*符号表示。
RA治疗期间F9细胞中RARE聚合酶II的招募。F9细胞用RA处理不同时间，然后用甲醛固定细胞并加工成可溶性染色质。染色质样品用免疫沉淀（A）识别RNA聚合酶II CTD磷酸化丝氨酸5或（B）用实时PCR定量分析非特异性兔IgG和结合DNA。为了进行比较，用霍克斯b1−18kb 3'阴性对照基因座。每个实验至少重复三次，定量PCR分析一式三份。数据表示为免疫沉淀前输入DNA的百分比（平均值±SE）。
pCIP向第26周期罕见的是在霍克萨1尽管褶皱富集（相对于霍克斯b1−18kb阴性对照基因座）和诱导（从时间0开始折叠富集的变化）在第26周期罕见(，6.1富集2h）。这个第26周期R2 RARE的特征43在编写这份手稿的过程中；因此，我们只监测了联合激活剂的招募第26周期本研究中R1罕见。pCIP的基础水平较高风险调整比率β2罕见()相对于在霍克萨1和第26周期RARE，pCIP水平在风险调整比率β2罕见(2 h）。该结果与之前的报告一致24这表明许多转录机制与风险调整比率β2RA治疗前P19 EC细胞中罕见。
本研究中监测的RA介导的HAT p300向RARE募集的动力学与pCIP的结果相似。p300在霍克萨1RA治疗2小时后，罕见的玫瑰色~ 9.4倍(). 与pCIP的情况一样，p300与霍克萨1时间进程中任意点的PP区域(). 此外，与pCIP一样，p300水平在第26周期罕见，但未达到霍克萨1罕见(，在6小时时约3.4倍诱导）。p300的高基础水平出现在风险调整比率β2罕见(，0h富集约2.5倍），p300水平增加约2.5倍(2小时）。从这些结果中，我们得出结论，RA介导的pCIP和p300的募集模式与我们测试的RARE相似。
RA患者F9细胞治疗过程中RNA聚合酶II与RARE的相关性
我们通过使用识别pol II羧基末端结构域（CTD）磷酸化丝氨酸5的抗体来监测RNA聚合酶II（pol II）与RARE的关联47在其他系统中，CTD的丝氨酸5磷酸化与转录起始有关48在没有RA的情况下，发现pol II的低水平与霍克萨1罕见(，0小时）。RA治疗6小时后，pol II水平在霍克萨1罕见()，类似于中所示的更改用于pCIP和p300。与pCIP和p300相比，发现pol II与霍克萨1聚丙烯()在没有RA的情况下，由于RA治疗，其水平会随着时间增加约3倍(). Hoxb1−18kb阴性对照区Hoxa1 PP中pol II的富集水平高于霍克萨1所有时间点都很少(). 鉴于在第二次警察招募中观察到的霍克萨1PP和RARE区域，我们得出结论，至少在最初，pol II被招募到霍克萨1PP独立于霍克萨1罕见。
类似于霍克萨1PP，pol II也与风险调整比率β2缺少配体时为RARE()根据−18kb的~6.9倍富集度判断霍克斯b1阴性控制位点。这一结果与之前的两份报告一致，这两份报告都表明pol II与风险调整比率β2P19 EC细胞中的RARE24;49聚合酶II水平在风险调整比率β2RA治疗期间罕见(，1小时）。我们的结果表明RA信号在表达霍克萨1和风险调整比率β2mRNA影响pol II募集后转录过程的一个步骤。
相比之下霍克萨1PP和风险调整比率β2罕见，只有低水平的pol II()发现与关联第26周期R1在缺乏配体的情况下为RARE。用RA处理F9细胞后，在第26周期R1稀有。而较高水平的pCIP和p300与霍克萨1相对于第26周期RA治疗期间R1罕见()，在第26周期R1 RARE与霍克萨1RA治疗期间罕见(). 最后，我们注意到，尽管第26周期和风险调整比率β2基因都位于转录起始位点附近()，这两种不同RARE的pol II关联模式明显不同。Pol II在风险调整比率β2RARE，而极低水平的pol II与RA治疗前的Cyp26 RARE相关。此外，Cyp26 RARE的pol II水平比风险调整比率β2RA反应罕见().
当在ChIP分析中使用非特异性兔IgG时，免疫沉淀的测试位点数量与所有测试点的Hoxb1−18kb阴性对照免疫沉淀量非常相似。这一结果表明，在RA治疗期间，在我们的试验位点观察到的pCIP、p300和pol II富集水平的变化反映了细胞的生物反应。
RA治疗后RARE组蛋白H3的乙酰化和二甲基化不会增加
适于转录的活性“开放”染色质通常与组蛋白乙酰化以及赖氨酸4的H3甲基化有关。因此，我们使用识别组蛋白H3尾部（H3K9，K14ac）乙酰化赖氨酸残基9（K9）和14（K14）的抗体，对由RA处理的F9细胞制备的可溶性染色质进行了ChIP分析。雄激素、雌激素和甲状腺核受体靶基因的配体依赖性H3K9、K14ac增加37;50;51然而，在P19 EC细胞中风险调整比率β2发现RARE含有组成性高水平的H3K9、K14ac，经RA治疗后未进一步增加39我们也没有观察到RA依赖性的H3K9、K14ac水平在风险调整比率β2罕见(). 此外，H3K9、K14ac水平在霍克萨1很少或在霍克萨1PP区域(RA治疗24小时后，H3K9、K14ac水平仅较治疗0小时略有增加（不到两倍）第26周期R1稀有(). −18kb霍克斯b13'基因座也与H3K9、K14ac相关，因为较高水平的−18kb霍克斯b1该位点在H3K9、K14ac-ChIPs中相对于ChIPs和本研究中使用的其他抗体进行免疫沉淀。例如，−18kb霍克斯b1在用H3K9、K14ac抗体进行的ChIP测定中，相当于约2.5%输入的基因座水平被免疫沉淀，相比之下，在用pCIP抗体进行的ChIP测定中，约0.06%的输入被降低。
RA处理不会改变F9细胞中组蛋白H3尾部在RARE处的乙酰化和二甲基化修饰。用RA处理F9细胞不同时间，然后用甲醛固定细胞并加工成可溶性染色质。染色质样品用免疫沉淀（A）抗H3K9、K14ac抗体或（B）实时PCR定量检测抗H3K4me2抗体和结合DNA。为了进行比较，用霍克斯b1−18kb 3'阴性对照基因座。从细胞培养开始，重复每个实验至少三次，并进行三次定量PCR分析。数据表示为免疫沉淀前输入DNA的百分比（平均值±SE）。
我们还对由RA处理的F9细胞制备的可溶性染色质进行了ChIP分析，该细胞具有识别组蛋白H3尾部赖氨酸4二甲基化的抗体（H3K4me2）。以前的报告已经证明，这种表观遗传组蛋白修饰在活性转录基因中富集18;52;53配体治疗的结果还表明，该标记在雄激素和雌激素靶基因的启动子处富集37;51然而，乙酰化组蛋白H3也是如此()，在RA治疗之前，在我们的所有测试位点检测到H3K4二甲基化水平较高(). 该结果与一份报告一致，该报告显示H3K4二甲基化与霍克斯小鼠原代成纤维细胞中的簇52此外，组蛋白甲基转移酶混合血系白血病（MLL1）已被证明在霍克斯U937细胞中的域54.H3K4me2水平在任何位点均未因RA治疗而增加(). 因此，我们的数据表明，至少对于我们监测的RA调节的靶基因座，组蛋白H3尾部的乙酰化和二甲基化先于RA，并且这些水平不会因RA治疗而改变。
在没有RA的情况下，SUZ12与F9细胞中的RARE相关，这种关联可以通过RA治疗减弱
Hox基因表达模式在一定程度上受到负调控PcG蛋白的空间限制34;55;56因此，我们研究了a）PcG蛋白是否与霍克萨1RARE和PP区域以及b）这种相互作用是否因RA的存在而改变。我们使用识别PcG蛋白SUZ12的抗体进行了ChIP分析。Kirimizis及其同事57纯化并在ChIP分析中使用该抗体，以证明SUZ12与第一个多年电价SW480结肠癌细胞中的基因以及其他新的结合位点。此外，我们试图用针对PRC2/3组分EZH2甲基转移酶的抗体进行ChIP测定，但这些都没有成功。
我们没有使用−18kb霍克斯b1该区域作为SUZ12 ChIP分析的阴性对照，因为观察到该位点水平的RA依赖性降低（见讨论）。因此，我们使用骨桥蛋白维生素D反应元件（VDRE）基因座为阴性对照，因为骨桥蛋白是成骨细胞中最丰富的糖蛋白，该基因的表达受降钙激素和细胞因子的调节58如预期，骨桥蛋白正如RT-PCR监测的那样，F9细胞的表达水平没有因RA暴露而改变（数据未显示）。水平骨桥蛋白在F9细胞中RA处理过程中，与SUZ12相关的VDRE DNA也保持恒定().
SUZ12在暴露于RA之前与F9细胞中的RARE相关，然后在RA治疗后解除相关。用RA处理F9细胞不同时间。然后用甲醛固定细胞并加工成可溶染色质。染色质样品用免疫沉淀（A）抗SUZ12抗体或（B）实时PCR定量检测抗H3K27me3抗体和结合DNA。为了进行比较，用骨桥蛋白VDRE阴性对照位点。的y轴第26周期（A）中的RARE图与其他位点图具有不同的尺度。从细胞培养开始，每个实验至少重复三次，并进行三次定量PCR分析。数据表示为免疫沉淀前输入DNA的百分比（平均值±SE）。
在没有RA的情况下，发现SUZ12与霍克萨1RARE和PP区域，根据分别约8.2倍和6.7倍的富集度判断()VDRE阴性对照基因座上游的这些基因座骨桥蛋白基因59暴露于RA后，SUZ12水平在霍克萨1RARE和PP区域(0小时至0.5小时）。在RA治疗过程中，这两个位点的SUZ12水平持续下降(). SUZ12水平下降了约14.4倍霍克萨1RA治疗12小时后罕见。SUZ12水平在霍克萨1暴露于RA 12小时后的PP区域(). 因此，我们得出结论SUZ12与霍克萨1基因，并且这种联系在暴露于RA后被破坏。
已经证明RA降低了PcG蛋白与调节区的关联霍克萨1基因，我们想确定PcG蛋白是否在RA介导的转录调控中发挥更广泛的作用。因此，我们还监测了SUZ12与第26周期R1和风险调整比率β2RA治疗F9细胞过程中的RARE。添加RA之前，发现SUZ12与风险调整比率β2罕见，根据该基因座比观察到的基因座富集约6.4判断骨桥蛋白VDRE公司(). 正如霍克萨1基因座，SUZ12在风险调整比率β2RARE在暴露于RA后迅速下降，在RA治疗12小时后风险调整比率β2RARE降低到观察到的背景水平骨桥蛋白控制VDRE().
在没有RA的情况下，SUZ12在第26周期R1 RARE相对于霍克萨1罕见(，约54倍富集第26周期0小时时稀有，而0小时时富集约8.2倍霍克萨1罕见）。尽管在第26周期R1 RARE相对于风险调整比率β2稀有和霍克萨1无RA的调节区域，RA治疗12小时后SUZ12水平第26周期R1 RARE也下降至观察到的背景水平骨桥蛋白VDRE公司(). 最初在第26周期R1 RARE可能与RA治疗后在该位点观察到的pol II募集的较大增加呈负相关(). SUZ12与我们测试的所有RARE相关，并且这种关联随着RA暴露而降低，这表明PcG蛋白在RA靶基因的转录抑制中具有更广泛的作用。
组蛋白H3的赖氨酸27在RARE下的三甲基化也会减少，以应对RA
SUZ12在生化上被定义为多梳PRC2/3复合物的一种成分，该复合物还含有组蛋白甲基转移酶EZH233PRC2/3复合物通过组蛋白H3的赖氨酸27（H3K27me3）的三甲基化保持部分沉默57如果SUZ12与RARE相关，作为功能性PRC2/3复合体的一部分，那么我们预计会在上述RARE处观察到H3K27me3标记。我们用一种单克隆抗体对RA处理的F9细胞制备的可溶性染色质进行了ChIP分析，该单克隆抗体特异性识别组蛋白H3修饰60在没有RA的情况下，H3K27me3在霍克萨1相对于骨桥蛋白控制VDRE(). 暴露于RA两小时后，这种表观遗传标记在霍克萨1RARE降至骨桥蛋白VDRE公司(). H3K27me3水平第26周期暴露于RA后，R1 RARE也降至背景水平()虽然表观遗传标记的水平在第26周期与霍克萨1罕见。因此，给定基因座的H3K27me3水平与SUZ12水平并不严格相关，因为我们观察到SUZ12在第26周期相对于霍克萨1罕见().
这些结果()证明在没有RA的情况下，H3K27me3标记可能通过PRC2/3复合物介导，出现在我们的测试RARE中。此外，与这些相同区域的SUZ12类似，H3K27me3水平因RA治疗而降低。后一个结果表明，H3K27me3表观遗传学标记可以被迅速去除，可能是通过募集一种能够逆转H3K27me3标记的未鉴定的去甲基化酶18经RA治疗后为RARE。为了支持这一提议，组蛋白脱甲基酶，赖氨酸特异性脱甲基酶1（LSD-1）已被证明与核受体（雄激素）相互作用，并且LSD-1是雄激素依赖性转录所必需的61.
移除RA后，SUZ12与第26周期R1稀有
我们已经证明，暴露于RA后，F9细胞中SUZ12与RA调节区的关联性降低。这一观察让我们询问，在RA处理的F9细胞中，去除RA后，SUZ12是否能与RARE重新结合。我们在RA存在下培养F9细胞24小时。经过24小时RA处理后，将培养基从细胞中抽出，然后用PBS冲洗这些细胞3次。然后将不含RA的新鲜培养基添加回这些细胞培养物中，然后在甲醛交联之前培养不同的时间长度（0.5、1、6或24小时）(). 在24小时RA处理后立即采集一些样品，并用PBS冲洗3次（用0表示，在)或在没有PBS冲洗的情况下交联（用（0）表示)以反映样品的采集条件–然后制备可溶性染色质，并将其用于带有SUZ12抗体的ChIP分析。
SUZ12与RARE快速结合，而RNA聚合酶II在去除RA后与RARE分离。（A）RA冲刷ChIP实验协议示意图。用RA处理F9细胞，然后用PBS冲洗，在甲醛交联和细胞收获之前，多次添加新鲜培养基。RA添加的时间用+RA和宽灰色条表示。PBS冲洗的时间，然后添加新鲜介质，用白色条的变化表示。阳性对照（pos）用RA处理48小时，在交联（x-link）之前未进行冲洗。阴性对照（neg）未接受RA治疗，也未在x-linking前冲洗。将“0”样本用RA处理24小时，然后立即进行x连锁并采集细胞。在24小时RA处理后，将“0漂洗”样品漂洗3次，然后立即将含有1%甲醛的培养基添加到培养皿中。添加RA和随后的步骤交错进行，以便所有样本同时进行x链接。（B）染色质样品用抗SUZ12抗体或（C）识别聚合酶II CTD磷酸化丝氨酸5并结合DNA的单克隆抗体通过实时PCR进行定量。每个基因座总输入的百分比被量化并归一化为阴性对照基因座。骨桥蛋白VDRE用作SUZ12 ChIP分析的阴性对照，Hoxb1−18kb区域用作pol II ChIP分析中的阴性对照。然后计算相对于0冲洗样品的折叠诱导率。每个实验至少重复三次，从细胞培养开始，每次实验均进行三次定量PCR分析。条形图表示折叠诱导（±SE）。使用Graphpad Prism 4.0进行统计分析。*符号表示统计显著性(第页<0.05），τ表示a第页值0.0685。除非另有说明，否则计算相对于0（冲洗）样品的统计显著性。
在第26周期在RA去除后1小时观察到R1 RARE[与“0（冲洗）”相比，诱导时间为1小时，约3.2倍]。SUZ12的水平在第26周期R1 RARE是对RA去除后时间增加的反应，因此，与在RA中培养24小时并在RA去除后立即收获的样品相比，在RA去除24小时后，该RARE中SUZ12的水平增加了约10.8倍[，将24小时与第26周期罕见]。在RA去除后立即收集的细胞制备的可溶性染色质中，在交联前未立即冲洗(，“0”），SUZ12在第26周期RARE与在第26周期“0（冲洗）”样本中很少[，将0与0进行比较（冲洗）]。此外，F9细胞经RA处理整个48小时作为阳性对照（pos），而F9细胞在未经RA处理的情况下培养48小时作为阴性对照（neg）。在第26周期未经RA处理的细胞相对于连续暴露于RA 48小时的细胞中的R1 RARE（pos）(，将neg与pos进行比较）。这些结果表明，从F9细胞中去除RA会导致SUZ12与第26周期R1稀有。
去除RA后，RARE处的RNA聚合酶II关联性降低
我们已经证明，在接受RA治疗的F9细胞中，RNA pol II被招募到第26周期R1，以小时为时间刻度(). 我们还证明，从F9细胞中去除RA后，SUZ12（可能是抑制性PRC2/3复合体的一部分）在类似的时间尺度上被招募到上述RARE(). 因此，我们希望确定是否将SUZ12招募到第26周期移除RA后，R1 RARE与pol II从相同RARE中分离一致。因此，我们还监测了pol II与第26周期R1在上述实验中去除RA后出现RARE。较高水平的pol II与第26周期经RA处理48小时的F9细胞中的R1 RARE与未暴露于RA的F9电池(，比较pos和neg），与中的结果一致.RA移除30分钟后，在第26周期R1稀有(，将“0漂洗”与0.5小时进行比较）。在RA移除后的后期，这种罕见的Pol II水平继续下降(). 我们得出结论，在F9细胞中去除RA后，pol II与第26周期R1 RARE与SUZ12招募到相同RARE的动力学呈负相关。
讨论
在本研究中，我们监测了RA治疗前后F9细胞中RARγ、RXRα、辅因子和组蛋白修饰与RA调节元件的关系。在RA治疗前，RARγ和RXRα与RARE相关，并且大部分RA暴露不会影响这些因素与RARE的关联水平(). 此外，在RA治疗期间，共激活剂pCIP和p300被招募到具有类似动力学的RARE中(). RNA pol II与RA调节元件的结合以基因特异性的方式变化。在霍克萨1和第26周期RA治疗前的R1 RARE和这些RARE的pol II水平在RA治疗后显著增加(). 相反，高水平的pol II与风险调整比率β2RARE和霍克萨1PP即使未经RA处理(). 我们还证明，与转录相关的某些组蛋白修饰水平（H3K9、K14ac和H3K4me2）在靶RARE中构成较高水平，并且在RA治疗期间没有增加().
此外，我们证明了PcG蛋白SUZ12与在没有RA的情况下测试的所有RARE相关，并且RA治疗可以减少这种关联(). 此外，在我们的靶RARE中检测到一个表观遗传标记（H3K27me3），该标记可能由PRC 2/3复合物介导，并且在这些RARE中的H3K17me3水平也随着RA而降低(). 最后，RA治疗，然后去除RA，导致SUZ12与目标RARE重新关联，并伴随这些相同RARE相关的pol II水平降低(). 我们在示意图模型中总结了这项研究的结果().
RARγ介导三个RA靶基因转录的模型。在没有RA的情况下，RARγ-RXRα异二聚体与风险调整比率β2,霍克萨1、和Cyp26A1细胞RARE可能通过与辅抑制因子的结合抑制转录。在没有RA的情况下，RA靶基因也与SUZ12相关。为了简单起见，我们描述了SUZ12覆盖整个风险调整比率β2和Cyp26A1细胞基因座，尽管这还没有实验确定。Pol II预先绑定到霍克萨1近端启动子（PP）和pol II、pCIP和p300预先绑定到风险调整比率β2罕见。配体结合后，与RARE结合的RARγ-RXRα异二聚体发生构象变化。如果RARγ-RXRα异二聚体与霍克萨1和Cyp26A1细胞R1 RARE，RA的结合导致pCIP/p300和pol II的招募。类风湿关节炎治疗也能使霍克萨13'很少与Hoxa1 PP区域相互作用。此外，Suz12在RA暴露后与三个RA靶基因分离。最后，RA需要在霍克萨州PP地区招募pol II后推动一个步骤1风险调整比率β2以便这些基因被转录。
RARγ和RXRα与RARE的关联
我们已经证明，在RA治疗之前，RARγ和RXRα与RARE相关，一般来说，相关性水平不受RA的影响。与我们的结果一致，Pavri等人。24也证明了RAR与风险调整比率β2P19 EC细胞中罕见。另一项最近的研究表明，非类固醇甲状腺激素（TR）核受体也与靶基因（TRβ）的TR反应元件（TRE）构成相关62然而，在同一项研究中，发现TR与另一个靶基因（TH/bZIP）的TRE的结合在TR处理后显著增加。此外，非甾体维生素D核受体的募集63同源结合位点以配体特异的方式出现。因此，问题是什么因素决定了非甾体核受体是否与调节元件构成相关。RARE中乙酰化和甲基化（K4）组蛋白的高基础水平()39可使含RARE的染色质在RA治疗前与RAR-RXR结合。如本研究所示，RA治疗期间乙酰化和甲基化水平没有进一步增加()因此，这些组蛋白修饰可能在RA治疗前达到最大水平。此外，体外研究表明，组蛋白乙酰化是RAR-RXR与核小体RARE结合所必需的64在其他核受体的情况下，组蛋白乙酰化和甲基化的配体特异性增加37;51已报告。因此，我们推测，与嵌入激素反应元件的染色质相关的表观遗传标记可能会影响各自核受体的结合特征。
在本研究中，我们专门监测了RARγ和RXRα与一些RARE的关联。然而，在F9细胞中表达的RAR（RARα，RARβ）和RXR（RXRβ，RXRγ）还有另外两种异构体三。RAR/RXR与给定RARE的关联是否以特定于同型的方式发生尚待确定。例如，RA诱导表达霍克萨1和第26周期在F9 RARγ−/−细胞中大大减少65因此，RARγ可能是与霍克萨1稀有和第26周期罕见。如果不是这样，那么RARα和RARβ在这些RARE中可能起什么作用？此外，我们发现RARγ与风险调整比率β2罕见()尽管如此风险调整比率β2RA在F9 RARγ−/−细胞中诱导表达65.
RA治疗期间，RARE的转录协同调节因子水平逐渐升高
辅因子向RA调节元件的募集动力学与RA诱导的霍克萨1,第26周期、和风险调整比率β2mRNA(). 一般来说，RA治疗后2小时内招募转录所需的协同调节因子，然后这些因子的水平达到稳定。在配体治疗后，我们没有观察到任何与我们的任何测试位点相关的转录因子的周期性循环，正如雄激素所观察到的那样50，雌激素36;37;38;66，糖皮质激素67和维生素D受体63然而，与我们的研究结果类似，Wang等人68表明AR和辅因子水平在16小时内逐渐增加PSA公司基因对配体的反应，AR关联动力学与PSA mRNA生成动力学相关。目前，控制NR和辅因子是否以离散周期或更渐进的方式被招募到启动子的因素尚不清楚。然而，真核增强子本质上是模块化的，包含多种转录因子的结合位点69;70例如霍克萨1增强子包含一个进化上保守的元素（CE2），它是表达霍克萨1在某些组织中，位于霍克萨1罕见71因此，共调节因子向调节元件的募集可能受到转录因子与相邻调节元件的结合的影响。
霍克萨1与霍克萨1PP区域
这个霍克萨1RARE位于霍克萨1PP区域()，这就提出了一个问题，即与这两个监管区域相关的因素如何能够进行沟通，从而启动霍克萨1mRNA表达。一种可能的解释是，因素与霍克萨1稀有和霍克萨1PP区域物理相互作用，导致插入DNA的折叠和/或成环。如果这样的模型是正确的，那么在霍克萨1RARE应靠近霍克萨1PP区域，这可以通过ChIP分析观察到。Park等人。72使用这种方法证明与上游TRE结合的TR与启动子近端G/C盒调节元件相关，以响应T三我们已经证明RARγ、RXRα、pCIP和p300与霍克萨1罕见(,三)但我们在霍克萨1PP区域。然而，pol II与霍克萨1以及pol II与霍克萨1PP暂时先于pol II与霍克萨1罕见(). 因此，pol II与霍克萨1通过与霍克萨1PP或pol II可能独立招募至霍克萨1RA治疗期间罕见。
SUZ12与缺乏RA的F9细胞中的RARE相关
PcG蛋白负性调节霍克斯基因34;55;56因此，我们监测了PcG蛋白SUZ12是否与霍克萨1监管区域。我们证明SUZ12与霍克萨1RA暴露前的RARE和PP区域，并且在RA治疗期间这种关联性降低(). 此外，与本研究中监测的其他共调节因子相比，SUZ12与无基因霍克斯b1−18kb 3'区域（数据未显示），在RA治疗期间，这种相关性也降低。在编写这份手稿的过程中，发表了绘制不同细胞系中SUZ12全基因组结合位点的研究73;74;75;76;77。与我们的结果一致，SUZ12与覆盖霍克斯人类ES细胞中的簇，74，以及D.黑腹果蝇Kc细胞77然而，对于大多数SUZ12靶基因，SUZ12位于转录起始位点区域74;76.
我们还证明了SUZ12与第26周期和风险调整比率β2无RA时的RARE(). 最近在人类胚胎二倍体成纤维细胞系TIG3中报道了SUZ12在调节这两个基因中的功能作用，73siRNA下调SUZ12在该细胞系中的表达导致第26周期和风险调整比率β2mRNA。SUZ12与几个RARE相关的事实表明，PcG蛋白在RA靶基因的负调控中具有全局作用。
RA调节区的染色质结构
我们观察到在我们的靶RARE同时存在与转录抑制（H3K27me3）和激活（H3K4me2）相关的组蛋白修饰(,). 在RA治疗过程中，H3K27me3的水平下降，而H3K4me2的水平在这些RARE中保持不变。含有这种“二价结构域”染色质结构的基因组区域最近被绘制出来，并显示与高度保守的非编码元件（HCNEs）和/或发育基因一致78我们还观察到，在RA治疗期间，在我们的目标RARE中发现的H3K9、K14ac修饰保持不变(). 这一结果表明，H3K9、K14ac标记有助于在二价结构域发现染色质结构。此外，我们的结果提出了一个问题，即是否所有RA靶基因都嵌入到二价结构域中。
RA介导的RA调控区多梳蛋白的分离
虽然由PcG蛋白介导的同源基因沉默在发育过程中是有丝分裂遗传的，因此在性质上是稳定的，但我们已经证明，暴露于RA可以迅速减少PcG蛋白质与RA靶基因的关联(). 此外，我们还发现，在RA治疗期间，RARE的表观遗传H3K27me3标记也迅速降低(). 我们的结果与最近的一份报告一致，该报告表明，在RA介导的人类EC细胞株NT2/D1的神经元分化过程中，SUZ12与靶基因的关联性降低73。我们还表明，从介质中取出RA后，SUZ12可以与RARE重新结合(). 因此，我们的数据表明，F9细胞中PcG蛋白与RARE的结合是默认状态，从RARE中去除PcG蛋白质需要暴露于RA。暴露于RA如何从机械上转化为PcG蛋白与RA调节元件的解离？这将是一个未来研究的主题。我们的研究提出的另一个问题是，PcG蛋白是否普遍与RARE序列相关，如果是，是否PcG蛋白质通过RARE序列或这些基因的其他未定义特征被特异性招募到RA靶基因。
PcG蛋白与RA靶基因的关联可能通过与RAR-RXR异二聚体的相互作用而产生。最近的一项研究表明，人类肿瘤抗原PRAME（黑色素瘤中优先表达的抗原）可以与配体RAR结合，并通过PcG蛋白的募集抑制转录，这一模型得到了支持79此外，作者还表明，在F9细胞中稳定表达PRAME可以阻止RA诱导的分化，并抑制RA诱导的基因表达。在野生型F9细胞的背景下，我们假设在没有RA的情况下，一种尚未识别的蛋白质可能同时与PcG蛋白和RAR-RXR异二聚体相互作用，从而允许PcG蛋白质向RA靶基因募集。
我们进行了ChIP研究，以监测RA治疗期间RARγ、RXRα和辅因子与RA调节区域的关联动力学。这些研究揭示了这些因子被招募到不同靶基因的模式和动力学。我们还揭示了PcG沉默和RAR信号之间的新联系。我们的数据表明，PcG蛋白可以通过与RARE的结合靶向基因组的特定区域(). 此外，我们已经证明，在RARE中由PRC 2/3复合物产生的SUZ12和抑制性表观遗传标记水平可以通过暴露于RA而减弱(). 因此，我们的数据表明，PcG介导的靶基因抑制可能通过一种机制得到缓解。更具体地说，本文的结果可以解释PcG如何介导对霍克斯RA治疗激活期间基因表达减轻。
材料和方法
细胞培养
F9野生型胚胎癌细胞在添加10%胎牛血清（Invitrogen）、2 mM谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基中培养。在RNA收获（5×10）前约48小时，将细胞置于明胶涂层的组织培养板中5细胞/60毫米培养皿）或甲醛固定（2.5×106细胞/20厘米培养皿）。用1μM视黄酸处理0、0.5、1、2、6、12和24小时是交错的，以便同时收集所有时间点。
抗体和化学品
全部-反式维甲酸（RA）从Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）获得，并溶解在乙醇中。用RARγ羧基末端对应15个氨基酸的肽免疫家兔，制备抗-RARγ血清。通过使用DEAE Affi-gel蓝凝胶柱（Bio-Rad，Hercules，CA）从粗血清中纯化多克隆抗RARγIgG。抗-RXRα（D-20，sc-553）、抗pCIP（M-397，sc-9119）和抗p300（N-15，sc-584）抗体购自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）。抗-H3K4me2（07-030）、抗H3K9、K14ac（06-599）和抗SUZ12（07-379）抗体购自Upstate Biotechnology（Lake Placid，NY）。RNA聚合酶II的抗磷蛋白Ser5 CTD（pCTDser5）购自Covance Research Products（加利福尼亚州里士满）。抗SUZ12（自停产以来为ab12201）和抗H3K27me3（mAbcam 6002）抗体购自Abcam Inc.（马萨诸塞州剑桥）。
RNA制备和RT-PCR
F9 EC细胞被放置在60mm的培养皿中（5×105细胞/培养皿），并按指示用RA处理。根据制造商的说明，使用Trizol试剂（Invitrogen Life Technologies，Carsbad，CA）制备总RNA。按照制造商的建议，使用50 ng寡核苷酸（脱氧胸苷）和50单位Superscript II（Invitrogen Life Technologies，Carsbad，CA）逆转录酶，从每个时间点对2μg RNA进行逆转录（RT）。合成的cDNA在用于半定量或实时PCR反应之前被稀释为1:10。每个实验都在三个独立的场合进行。
Western Blot和免疫沉淀分析
从Cos细胞制备全细胞提取物（WCE），这些细胞要么是模拟转染的（m），要么是转染表达RARα、RARβ或RARγ的质粒。在12%SDS-PAGE凝胶上运行5μg Cos WCE，然后转移至硝化纤维素膜（孔径0.45μm；目录号162-0090，加利福尼亚州Bio-Rad Hercules）。膜用Ponceau S（Sigma）染色，以确保适当转移和等效负载。在4°C下进行一级抗体孵育过夜。如上所述，使用1:200稀释度的抗-RARγ蓝洗脱液检测RARγ。在室温下与免疫球蛋白G辣根过氧化物酶结合二级抗体孵育1小时后（抗兔，1:40000稀释；sc-2030，圣克鲁斯生物技术公司），用超级信号底物（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）制备膜5分钟，并暴露于Biomax膜（伊士曼柯达，罗切斯特，纽约州）。在含有5%Blotto（Santa Cruz Biotechnology）和0.1%Tween 20的PBS中稀释第一抗体和第二抗体。对于IP分析，用表达RARγ或RARβ的质粒模拟转染或转染Cos细胞，并用100μ居里(35S） -蛋氨酸1小时。然后从每个细胞制备Cos细胞提取物，并用25μl RARγ蓝洗脱液免疫沉淀100μg每个提取物。IP复合物通过与25μl 50:50（v/v）的蛋白a-琼脂糖/TE混合物浆液培养来分离。在用ChIP裂解缓冲液进行三次洗涤后，蛋白A-sepharose-IP复合物再次悬浮在SDS加载缓冲液中，并在12%的SDS-1 PAGE凝胶上运行。然后固定凝胶并进行放射自显影。
ChIP分析
对于2步染色质免疫沉淀（ChIP）分析，2.5×106F9 EC细胞在20厘米的培养皿中生长，并用1μM维甲酸处理细胞，如图所示。电镀后约（~）36小时（~1.8–2.3×107细胞），用PBS短暂冲洗细胞，然后在室温下用10ml 2mM二琥珀酰亚胺戊二酸盐（DSG，Pierce，Rockford IL）/PBS固定，摇晃45分钟。使用前立即将粉末状DSG溶解在100%二甲基亚砜中，制备0.5 M储备浓度的DSG。然后用PBS短暂冲洗细胞，然后用10 ml 1%甲醛（新泽西州菲利普斯堡J.T.贝克）/PBS在室温下固定，摇晃10分钟。在只需要甲醛固定的一步ChIP实验中，通过将甲醛（37%）直接添加到培养基（1%终浓度）中并在室温下振荡孵育10分钟来固定细胞。在1步和2步ChIP测定中，通过将1.25M甘氨酸添加到200mM终浓度来猝灭甲醛固定。然后用冷磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，并通过向细胞颗粒中添加350μl裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH8.0]、150 mM NaCl、5mM EDTA、1%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.5×完整迷你蛋白酶抑制剂，目录号11836153001[罗氏分子生物化学公司，德国曼海姆]）进行裂解。调整添加到样品中的裂解缓冲液的量，以使平板之间的细胞数量差异正常化。在Branson 150 Sonifer上通过超声波2×15秒（设置3）剪切DNA，并通过在4°C下以14000转/分（rpm）离心10分钟来清除细胞碎片。对于每个免疫沉淀（IP），用裂解缓冲液将50μl可溶性染色质（通常在约350μl的总体积中）稀释十倍，并用25μl 50%蛋白质a-sepharose/PBS浆料（目录号17-0780-01）在4°C下预先清除1–2小时。
免疫沉淀在4℃下过夜，每种特定抗体2μg。通过在4°C下与50μl 50%蛋白ASepharose/PBS浆料（目录号17-0780-01（Amersham Biosciences））孵育2小时收集复合物。对于具有抗pCTD抗体的免疫沉淀，在添加珠之前1小时添加2.5μg抗IgM（M8644-1MG，Sigma-Aldrich）。在室温下用裂解缓冲液将珠洗两次，每次5分钟。用ChIP洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH8.5]，500 mM LiCl，5mM EDTA，1%NP-40，1%脱氧胆酸钠）再进行两次洗涤，然后在TE缓冲液中进行两次清洗（10mM Tris-盐酸[pH8.0]，1 mM EDTA）。用100μl洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH8.0]，1%SDS，1 mM EDTA）在65°C下孵育10分钟，然后涡流15秒，从珠子中洗脱免疫复合物。经过简单的离心步骤后，将洗脱的蛋白-DNA复合物转移到新试管中，将NaCl添加到最终浓度200 mM，并在65°C下培养样品过夜以反向交联。
使用Qiaquick Spin Kit（Qiagen Sciences，MD）纯化DNA，并通过实时PCR或半定量PCR进行分析。对于输入样品，将25μl（特定抗体IP用量的5.5%）添加到75μl洗脱缓冲液中，将NaCl添加到200 mM最终浓度，并在65°C下反向交联过夜。从细胞培养开始，每个ChIP实验至少在三个独立的场合进行。
RA冲刷ChIP实验
F9 EC电池（2.5×106)在20厘米的培养皿中培养，用RA处理24小时（脉冲）。然后从培养皿中抽出培养基，用PBS冲洗细胞3次。然后将缺乏RA的新鲜培养基添加回培养皿中，并在37°C下培养不同时间（chase）。RA治疗交错进行，以便所有板同时交联(). 例如，与-RA 6小时样品相比，-RA 24小时样品最初暴露于RA 18小时。因此，比-RA 6小时样品早18小时用PBS冲洗-RA 24小时样品。阳性对照样品暴露于RA 48小时，而阴性对照没有接受RA治疗。
半定量和实时PCR
用Taq聚合酶在含有PCR缓冲液（最终浓度为100 mM Tris-HCl[pH8.3]、100 mM KCl、1.8 mM MgCl）的20μl反应中进行半定量PCR2)，每个脱氧核苷三磷酸的0.1 mM浓度，每个引物的0.1μM浓度()和3μl模板。在MJ Research PTC-200热循环器中使用接地协议进行反应，如下所示：经过15秒94°C变性步骤后，初始退火/延伸温度从70°C（30秒）开始，在前20个循环中每个循环降低0.5°C。使用60°C退火/延伸步骤（30秒）的附加循环数（2–13）因每对引物而异。将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，并用溴化乙锭（0.3mg/ml）进行可视化。通过模板的3倍连续稀释证明线性范围内的扩增。在MJ Research Option DNA Engine上使用与上述相同的反应混合物进行实时PCR分析，并补充5%二甲基亚砜的最终浓度和1:20000稀释的SYBR绿色试剂（Invitrogen Life Technologies，Carsbad，CA）。上述触地协议通过以下修改用于放大：将70°C的初始退火/延伸步骤降低1.0°C，持续10个周期，然后再利用60°C的退火/延伸阶段再进行35个周期。在60°C退火/延伸步骤后的5秒77°C步骤中（温度根据引物对进行修改）监测荧光。实时数据通过使用输入样品的连续稀释产生的标准曲线进行量化。标准曲线在输入的30%至0.001%范围内呈线性。通过测量CT值并在标准曲线上插值%输入，对ChIP样品进行定量。每个实验重复至少3次，并进行一式三份的定量PCR。结果显示为三倍平均值，以及对应于标准误差的误差条。使用GraphPad Prism 4.0软件通过双向方差分析对ChIP分析进行统计分析。UCSC公司生物信息学PCR程序(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr)用于确保为ChIP设计的引物从适当的目标位点产生单个扩增子。
表1
| 地点 | 感应底漆（5'–3'） | 反义底漆（5'-3'） | 产品规模（bp） |
|---|
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ChIP引物
|
|
霍克萨1稀有的
|
TCTTGCTGTGACTGGAAGTCG公司
|
GAGCTCAGATAAACTGCTGGGACT公司
|
268
|
| 霍克萨1聚丙烯 | ATTGGCTGAGAGAGTCACGTG公司 | 加拿大政府 | 276 |
| 第26个日历年R1罕见 | CCCGATCCGCAATTAAAGATGA公司 | CTTTATAAGCCGCCCAGGTTAC公司 | 87 |
| 第26个日历年R2稀有 | TTCACTGAGATGTCACGGTCC公司 | TTCCCAATCCTTAGCCTGA公司 | 64 |
| 风险调整比率β2稀有的 | TGGCATTGTTGCACGCTGA公司 | 中交总公司TTTGGCAAAGAATAGA | 284 |
| −18千字节霍克斯b13' | ACTCACGCTCCCATTTCCACTT公司 | ctgcctgcctgctctctctctctctcaca | 411 |
|
骨桥蛋白
| GTATTCCAGTCTCACAACTGCTG公司 | CATACTGTGTCAGTGTCAGTTGG公司 | 336 |
|
RT-PCR引物
|
|
霍克萨1
一
| TGGAGGAAGTGGAAAGTTGGC公司 | ATGGGAGTCGAGAGGTTCC公司 | 484 |
|
b条
| TTCCCACTCGAGTGTGGTCCAAGC公司 | | 147 |
|
第26个日历年
| GAAACATTGCAGATGCTTCAG公司 | CGGCTGAAGGCCTGCATAATCAC公司 | 272 |
|
风险调整比率β2
| 海关总署 | 仙人掌 | 247 |
|
36立方英尺4英寸
| AGAACACCATCTGGAAA公司 | ACACCCTCACAGAGAAGCGAGT公司 | 448 |
|
骨桥蛋白
| TGACGAATCTCACCATTCGGATA公司 | TTTCCAGACTTGGTTCACAGCT公司 | 338 |
