聚糖结合的评估
为了评估野生型半乳糖凝集素-3和突变体之间碳水化合物结合精细特异性的差异，我们使用了两种不同的互补方法；406元素固定化聚糖阵列评估结合趋势(和补充表S2、a和b)并对15种选定的糖进行基于溶液的FA分析，以获得更准确的亲和力(,补充图S2和表S3).
野生型半乳糖凝集素-3及其突变体的糖基阵列分析。每个图都显示了绑定（如细钢筋)将荧光标记的半乳糖凝集素（野生型或突变型，最终浓度200μg/ml）添加到179个潜在半乳糖结合聚糖中的每一个，表示为RFU×10−4在年轴。结合数据显示了两次，其中聚糖由可能位于半乳糖凝集素C-D位点的二糖分组(面板a)或可能位于B位点的单糖，即与C位半乳糖的3位相关(面板b). 在这两个面板中，聚糖是根据其与野生型半乳糖凝集素-3（来自左边到正确的). 聚糖的分组特征如下所示x个轴使用功能糖组学联盟推荐的符号。对于站点C-D，它们来自左边到正确的，Galβ1–4GlcNAc，Galβ1–3GlcNAc，Galβ1–4Glc，Galβ1–3GalNAc和其他。对于站点B，它们是硫酸盐-3、NeuAcα2-3、GalNAcα1-3、Galα1-3、GlcNAcβ1-3，什么都没有（即站点C中的Gal是终端）。这个右下角示意图属于面板a显示野生型半乳糖凝集素-3和所有突变体与阵列上其余227个聚糖的背景结合非常低，因为它们不含β-半乳糖，或者它们所含的所有含β-半乳糖苷的二糖都被取代位阻C和D位点的结合而被阻止，所以它们不可能结合半乳糖凝集素(2)如中所述,b条和c（c）R186I突变体比其他突变体具有更高的背景（五个峰>1000 RFU，最大2674），但不足以混淆解释。结合、聚糖结构和原始聚糖编号的数值见补充表S2、a和b.
野生型半乳糖凝集素-3及其突变体的荧光各向异性分析。每个面板显示一个条形图相对亲和力((K（K）一突变体）/(K（K）一半乳糖凝集素-3重量）=(K（K）d日半乳糖凝集素-3重量/K（K）d日突变）1个突变，用于15种不同的荧光标记糖探针（1-15）。相对亲和力的平均值基于在冷冻条件下（～4°C）使用荧光各向异性分析进行的分析，n个≥4，详见补充图S2和表S3糖类探针如图下方的表格双糖最有可能在C-D位点结合，如大胆的.
在阵列上，227个聚糖作为非结合对照物，因为它们缺乏β-半乳糖，或者它们所拥有的所有含β-半乳糖的二糖都被阻止位点C和D结合的取代物阻断，如,b条和c（c）所有这些聚糖与野生型半乳糖凝集素-3和所有突变体的结合都很低(一,底部,右侧面板).
其余179个潜在的半乳糖凝集素结合聚糖是那些具有至少一个β-半乳糖苷残基的聚糖，根据上述标准，其在C位点的结合未被阻断。这些在中显示了两次.英寸面板a它们被分为阵列聚糖中发现的四种二糖类型之一，能够与野生型半乳糖凝集素-3的C-D位点结合面板b它们根据可能在站点B中发现的部分的性质进行分组(即与位点C中Gal残基的3-位连接）。各组内的聚糖如所示根据野生型半乳糖凝集素-3（来自左上方到右下方).
野生型半乳糖凝集素-3与一（位点C-D），但它也没有与各组的一些聚糖结合。后者往往是具有短糖链的，例如二糖、三糖或四糖，即使已知它们能结合半乳糖凝集素-3，它们在阵列上显然也不能很好地识别。具有可用于C-D位点结合的LacNAc的聚糖结合最好且最频繁（阵列上94个聚糖中的45个），具有可利用Galβ1–3GlcNAc的糖也结合良好（36个中的15个），而只有乳糖的糖结合较弱（24个中的6个），只有Galβ1-3GalNAc的糖类根本不结合。野生型半乳糖凝集素-3也对各组的代表有明确的结合作用b条（位点B），证明其广泛的多方面精细特异性。
亲缘关系(K（K）d日)通过FA分析测定了15种不同的荧光标记糖探针(19,37)并与野生型galectin-3进行比较，总结如下并在中详细介绍补充图S2和表S3不同探针的相对亲和力再次与引言中描述的galectin-3特异性相一致，例如对LacNAc的偏好高于乳糖（探针2与1） β-Gal的2–3唾液酸化耐受性（探针6–8），GlcNAcβ1–3延伸耐受性或偏好性（探针9–15），以及强烈偏好a-四糖（探针5）。
该FA分析还测量了半乳糖凝集素探针复合物的各向异性（如A类最大值)间接报告结合糖在半乳糖凝集素结合槽中的位置，如补充结果和索尔梅等。(37). 这个A类最大值除3和8之外，所有探针的野生型半乳糖凝集素-3的值都相对较高（110–140 mA），这表明除探针3和8外，探针荧光团在与半乳糖凝蛋白结合时经历类似的节段运动，从而提供了内部半乳糖(大胆的在表中)探针10–15位于位置C；如果这些探针的末端Gal位于C位点，则荧光团将进一步从蛋白质表面移除，并且A类最大值会比galectin-1低很多。4进一步支持探针10–15的内部Gal位于站点C的建议，这是因为它们具有类似的性质A类最大值与探针11、12和15的值相同的糖类，其中末端GalβGlcNAc残基通过GlcNAc（探针11和15）上的岩藻糖基化或Gal（探针12）上的6-唾液酸化阻止在C-D位点结合(,b条和c（c）). 将Galβ1–3GlcNAc放置在C-D位点的探针3和8具有A类最大值与Galβ1–4GlcNAc位于C-D位点的其他探针相比，该值低得多（约40 mA）。推测这是由于荧光团投射到E位点的方式不同所致(c（c）)这样，当Galβ1–3GlcNAc位于C-D部位时，荧光团的节段运动受到较少限制。
D位点的点突变
galectin-3对Galβ1–4GlcNAc（LacNAc）的偏好高于Galβ1-4Glc（Lac）、Galβ1-3GlcNAc和Galβ1-3 GalNAc，这可能是因为它的N个-乙酰基与Glu-165和Glu-184的羧酸盐离子对中保守的Arg-186形成的π电子表面堆积(32) (b条); 相反，乳糖呈现OH，而两个3-键二糖在该位置呈现CHOH(c（c）)，显然提供了较弱的交互作用。因此，我们制作了两个突变体来替换Arg-186，一个用Ser（R186S）替换，另一个用Ile（R186I）替换，如在galectin-8N中发现的，与galectin-3相比，Ile对上述二糖具有相反的偏好性。在FA分析中，两个突变体都失去了与LacNAc或Galβ1–3GlcNAc可能位于C-D位点的聚糖的结合(例如2、3、7和8英寸)然而，它们对C-D位点的聚糖与Lac的亲和力降低；R186S对可溶性LacNAc的亲和力降低了70倍(32)而其对乳糖的亲和力仅降低了约四倍。在阵列上，半乳糖凝集素-3 R186S仅结合一个聚糖()，一个N个-触角上含有Galβ1–3GlcNAc的聚糖，并被血型B决定簇覆盖。R186I突变体在阵列上结合了更多的聚糖()，大多数还被血型A或B决定簇所覆盖，这些取代基可能弥补了C-D位点双糖亲和力的降低。
C位点附近的点突变
其中一个突变G182A位于C位点附近，因为它失去了半乳糖凝集素-3所显示的两种有趣的肿瘤生长促进作用；即细胞内抗凋亡作用(43)以及从N-Ras到K-Ras激活的转变的诱导(44). 这个突变体最初是因为序列180NWGR公司183半乳糖凝集素-3类似于Bcl-2蛋白家族中的保守序列(43)但其糖结合特异性尚未见报道。G182A突变最显著的影响是，它优先（尽管不是唯一）与阵列上含有聚糖的Galβ1–3GlcNAc失去结合(,面板a). 建模并没有提出一种机制，因为Gly-182和Ala-182都不会与C-D位点的双糖接触(). 然而，与减速端结构的破坏性相互作用(即C-D位点Galβ1–3GlcNAc二糖的剩余聚糖）可能发生在突变体中，因为这些结构更多地指向Gly-182(c（c）). 在FA分析中A类最大值与野生型半乳糖凝集素-3和所有其他突变体（mA～60～90）相比，含有Galβ1–3GlcNAc的探针3和8的G182A突变体的值增加（至～110 mA）(补充表S3)，表示效果(例如移动性降低）(即连接物和荧光素部分）。
Asn-180也是序列的一部分180NWGR公司183，其侧链指向溶液中，远离位点C，方向与Trp-181侧链相反(一). 双突变体K176L/N180T是通过引物设计中的错误获得的，与K176L（如下所述）相比，它在碳水化合物结合特异性方面没有太大差异，但它对一些较长的GlcNAcβ延伸半乳糖苷的亲和力略有增加().
B位点的点突变
如引言所述，半乳糖凝集素-3可以耐受C位半乳糖在OH3的许多不同取代。X射线晶体学和建模表明，糖链的这些添加物可能与Arg-144、Ala-146、Asp-148和Lys-176的侧链相互作用，共同构成位点B，如图所示,a–c.
站点B中的交互建模。连接到C位点Gal的3位的单糖和选定的氨基酸侧链如下所示棒状模型标记了一些位置和官能团，氢键表示为虚线galectin-3 CRD的透明表面显示为背景。一，显示了NeuAc在NeuAca2–3Galβ1–4Glc中的一个可能位置，基于NeuAc-α2–3Lac与galectin-8的N-CRD的络合物(19); 在NeuAcα2–3Lac与真菌半乳糖凝集素复合物的x射线晶体结构中发现了另一个类似的位置(40)，尽管在这种情况下站点B的结构不同。b条图中显示了GlcNAcβ在乳糖-N-新四糖（Galβ1–4GlcNAcβ1–3Galβ1-4Glc）中的位置，以及半乳糖-N-新四糖与半乳糖-CRD复合物的x射线晶体结构中的氨基酸侧链。5 c（c）图中显示了GalNAcα在血型a四糖（GalNAcα1–3（Fucα1–2）Galβ1–4Glc）中的位置，该四糖基于与真菌半乳糖凝集素的复合物(39). 模型由MacroModel（9.7版）生成，图像由PyMOL生成。
建模表明，NeuAcα在站点B中的一些替代位置具有类似的能量最小值，最好的位置显示在一在所有这些化合物中，C1羧基都朝向Arg-144的侧链，该侧链是柔性的，可以适应形成氢键。Arg-144显然很重要，因为R144S突变体失去了对阵列上唾液酸化（和硫酸化）半乳糖苷的亲和力(b条)FA-assay中使用的探针6–9()，对相应的仓鼠galectin-3突变体也有影响(27).
A146Q突变与3-唾液酸化半乳糖苷结合，亲和力略有降低。该突变体是为了探索半乳糖凝集素-8N对3-唾液酸半乳糖苷的强亲和力增强的基础(19). 半乳糖凝集素-8N中相应残基Gln-47的较大侧链迫使Arg-45的侧链（对应于半乳糖凝素-3的Arg-144）形成不同的构象（PDB代码2岁以下)相对于中所示的一与中所示类似c（c）因此，Gln-47和Arg-45的侧链与唾液酸羧基之间可能存在氢键（参考文献。19未显示）。类似的相互作用可以解释为什么半乳糖凝集素-3 A146Q突变保持与3-唾液酸半乳糖苷的结合()，但亲和力的降低清楚地表明，它们本身并不能解释半乳糖凝集素-8N对3-唾液酸半乳糖苷的强烈偏好。
Asp-148和/或Lys-176也可以与位点B中的NeuAcα部分相互作用，如一以及Lys-176与OH8的替代构象（未显示）。Lys-176对B位点结合NeuAcα显然很重要，因为K176L突变体失去了唾液酸化半乳糖苷的亲和力(b条和). 该模型还解释了为什么半乳糖凝集素-3与3-键结合N个-乙醇酰神经氨酸（NeuGc）也同样适用(补充表S2); 如所示一，（NeuAc中NAc的）氧化甲基指向溶液。
在B位点的GlcNAcβ模型中(b条)，OH6可能通过氢键与Arg-144和Asp-148相互作用。前者似乎很重要，因为R144S突变体失去了对所有GlcNAcβ1-3取代半乳糖苷的亲和力(9–15在里面). A146Q突变体对GlcNAcβ1–3取代半乳糖苷的亲和力虽然较低，但仍保持不变()可能是因为如上所述，Gln强制Arg-144的替代位置。与此一致，半乳糖凝集素-8N（Q47A）的反向突变增加了GlcNAcβ1–3取代半乳糖苷的亲和力(14). K176L突变体与GlcNAcβ1-3取代的半乳糖苷的结合明显好于野生型半乳糖凝集素-3，但在图b条相反，间接的相互作用/影响是可能的(例如水介导），因为流动性发生了特别强烈的变化(45)和位置5Lys-176侧链与配体结合。GlcNAcβ的OH3和OH4远离蛋白质的取向(b条)解释了为什么在这里添加Fucα（如化合物中11和15在里面)不会阻止与半乳糖凝集素的相互作用，就像GlcNAc位于D位点一样(,b条和c（c）).
在B位GalNAcα模型中(c（c）)，其OH6通过氢键与Trp-181相互作用。Galα也是如此，这可能解释了为什么GalNAcα1-3和Galα1-3半乳糖苷都能以增强的活性结合半乳糖凝集素-3。Arg-144被GalNAc的NAc强迫进入交替构象，但可能通过氢键与之相互作用。构象变化和额外的氢键显然没有带来任何亲和力的净增加，因为R144S突变事实上增加了GalNAcα延伸半乳糖苷的亲和力(5在里面). A146Q突变体对B位点GalNAcα的聚糖选择性丧失亲和力，而对Galα（B血型）的聚糖则没有亲和力(b条). 一种可能的解释是，Gln侧链会与GalNAcα的NAc发生空间位阻冲突，但不会与B位点的Galα发生空间位效冲突，半乳糖凝集素-8N对GalNAcα延伸半乳糖苷的亲和力极低，但对聚糖阵列中发现的一些Galα延伸半乳糖苷仍具有显著亲和力（卡尔森补充表S1等。(19).
组合突变
为了进一步增加B位点galectin-3和galectin-8N CRD之间的相似性，我们将A146Q突变与K176L、K176L/N180T和R186I突变结合。这导致每个组分突变体的结合特性丢失，没有证据表明结合中有其他变化().
半乳糖凝集素-3精细特异性的进化变化
半乳糖凝集素-3的序列和独特的结构域组织允许在所研究的每种脊椎动物物种（包括鱼类、两栖动物、鸟类和哺乳动物）中确定单个半乳糖凝蛋白-3的同源性(46). 构成C-D位点的氨基酸已经完全保守，但在这里研究的B位点的氨基酸中，不同物种之间存在差异，在A位点中还存在其他差异。为了探索这是如何改变碳水化合物结合特异性的，我们分析了爪蟾半乳糖凝集素-3和小鼠半乳糖凝素-3的FA检测方法与上述突变体的检测方法相同。
在爪蟾半乳糖凝集素-3 B位点的两种氨基酸与人半乳糖凝素-3存在差异；Lys-176对Met和Asn-180对Arg的特异性爪蟾半乳糖凝集素-3确实与K176L突变体相似，因为它与唾液酸化半乳糖苷（no。6,7、和8在里面,左边)与人半乳糖凝集素-3相比，它的相对亲和力要低得多，而它与一些用GlcNAcβ延伸的蛋白（编号9-15）的相对亲和性更高。爪蟾与乳糖和LacNAc相比，galectin-3对C-D位点的Galβ1–3GlcNAc也有明显的偏好，这可能是由于氨基酸序列的其他差异，例如Arg替代Asn-180。
亲和力的荧光各向异性分析爪蟾(左边)和鼠标(正确的)半乳糖凝集素-3与人半乳糖凝素-3的关系。进行了分析，结果如下所示，显示条形图的相对亲和力爪蟾和小鼠galectin-3((K（K）一爪蟾或小鼠galectin-3）/(K（K）一人半乳糖凝集素-3重量））用于15种不同的荧光素标记的糖探针(1–15).每个图表下方是人体galectin-3的模型一但有颜色黑色针对不同动物半乳糖凝集素和白色对于那些相同的。标记位置B中不同的残留物。
在小鼠galectin-3中，整个碳水化合物结合沟中唯一暴露于表面的变化是B位点的Ala-146到Val(,正确的)以及Gln-150与Arg在A位点和A位点远端的两个以上。小鼠galectin-3与所有测试的糖探针的亲和力较低，最显著的是与GlcNAcβ延伸的糖探针亲和力(即“聚氨基乳糖”型）延伸到位点B。这些差异可能部分是由于较大的Val侧链（与人半乳糖凝集素-3中的Ala-146相比）阻碍了延伸到位点B，但位点A的差异也可能起作用。
与人半乳糖凝集素3相比，大鼠半乳糖凝蛋白3有三种变化：Arg-144变为Ser，Ala-146变为Thr，Asp-148变为Asn。大鼠半乳糖凝集素-3不可用于本研究，但之前的详细研究(18,24)表明其具有与人半乳糖凝集素-3相似的特异性，但与NeuAcα2–3Lac的亲和力约低5倍。后者与R144S突变体的特异性相一致，这也显示了如上所述的α2–3唾液酸化半乳糖苷的亲和力下降。关于其他糖的结合，与Arg-144相互作用的丧失(,b条和c（c）)可能已经被Thr而不是Ala-146的存在所补偿。上述结果清楚地表明，半乳糖凝集素-3的B位点存在物种特异性序列差异，这些差异改变了碳水化合物结合特异性，并可能代表对每个物种产生或遇到的碳水化合物结构的适应。
细胞外添加半乳糖凝集素-3突变体的生物学效应；中性粒细胞的活化和结合
作为研究的最后一部分，我们希望利用半乳糖凝集素-3突变体来了解碳水化合物结合特异性与生物功能之间的相关性。我们首先研究了启动的中性粒细胞中NADPH-氧化酶的激活，这是半乳糖凝集素-3的一种典型作用(23,47,–49). 从外周血中纯化中性粒细胞，并用TNFα（引物）预孵育，然后通过添加半乳糖凝集素-3或突变体激活；新鲜的无污染中性粒细胞不被半乳糖凝集素-3激活(23). 对于每个半乳糖凝集素浓度，随着时间的推移测量细胞内和细胞外超氧阴离子的产生(补充图S3)使用化学发光分析。利用时间曲线的峰值将突变体与野生型半乳糖凝集素-3进行比较，后者在每个实验中作为对照平行运行().
野生型半乳糖凝集素-3和突变体激活TNFα引发的中性粒细胞的剂量反应。剂量(x个轴）响应(年轴）和突变体如所示灰色和黑色分别位于所有面板中。使用发光测定法测量活性氧物质的体外和细胞内释放。每个数据点是时间曲线的峰值（活性氧物种）响应（如补充图S3)，通过定义100%为最高浓度（3.5μ米)野生型galectin-3平行运行。n个= 3.
对于LacNAc结合缺陷突变体（R186S、R186I和A146Q/R186I），观察到最显著的效果，其没有诱导任何氧自由基从引发的中性粒细胞释放，这一观察结果表明，与糖蛋白中发现的LacNAc结合是中性粒细胞活化所必需的，并且与乳糖结合，正如糖脂中所发现的那样，这是不够的。与此相一致的是，R186S突变株也完全失去了结合人类血清糖蛋白的能力(50)另一个结果是，中性粒细胞促进凋亡细胞吞噬的能力(49).
在其他突变体的特异性中，结合含有GlcNAcβ1–3Gal的糖类的能力，如重复的多乳糖结构中所发现的，与激活启动的中性粒细胞的能力最相关。因此，获得糖亲和力的突变体将GlcNAcβ1–3放置在B位半乳糖苷（K176L和K176L/N180T）中，其效力明显增强，如剂量-反应曲线的左移所示(); 即使K176L/N180T浓度低至0.2μ米诱导中性粒细胞显著活化。另一方面，R144S突变株失去了对GlcNAcβ1–3取代半乳糖苷的亲和力，激活中性粒细胞的能力大大降低，如剂量-反应曲线右移所示，尽管它增加了对GalNAcα2–3取代的半乳糖甙的亲和力。与α2–3连接的唾液酸化半乳糖苷的结合与激活中性粒细胞的能力无关，因为对于最佳激活突变体（K176L和K176L/N180T）以及活性较差的突变体R144S，与这些聚糖的结合丢失。其他突变体激活启动的中性粒细胞的能力略有下降，对于剩余的组合突变体（A146Q/R186I、A146Q/K176L、A146Q/K176L/N180T），其效力与组合中活性最低的单个突变体相似(). 大多数突变体中保持的结合单个非趋向性LacNAc的能力也与激活中性粒细胞的能力无关。
这些结果表明，中性粒细胞上半乳糖凝集素-3的最佳激活受体包含重复的LacNAcβ1–3LacNAc部分，其中第二个LacNAc-必须可在C-D位点结合(例如虽然第一个LacNAc可以通过例如GlcNAc上的Fucα1–3。这种结构在中性粒细胞上非常突出和典型N个-和O（运行）-聚糖(51,–53)也在一些纯化的中性粒细胞糖蛋白中发现(54,–57). 此外，中性粒细胞N个-糖肽部分被发现与半乳糖凝集素-3紧密结合（麻雀表2中的粒细胞LAG糖肽等。(24)). 斯托维尔，这可能是一个相关的现象等。(17)结论是，基于神经氨酸酶和内β-半乳糖苷酶对细胞的处理，半乳糖凝集素-3诱导分化的HL60细胞（广泛使用的中性粒细胞模型）中磷脂酰丝氨酸的暴露也由多乳糖结构介导。
启动事件需要使中性粒细胞对半乳糖凝集素-3的激活敏感，除其他作用外，还需要动员细胞内颗粒成分到质膜，质膜可能充当半乳糖凝素-3受体(23,47,58). 因此，我们比较了野生型半乳糖凝集素-3和五个突变体与激发和非激发中性粒细胞的结合。中性粒细胞与野生型半乳糖凝集素-3和K176L突变体的结合情况大致相同，在TNFα启动后两种情况下均增加30-50%(). R186S突变体没有结合任何中性粒细胞制剂，而其他突变体在启动后表现为中等结合，没有显著增加。综上所述，这些观察结果表明，中性粒细胞启动导致细胞表面多乳糖样聚糖的增加。与这一建议一致的是，明胶酶和特定颗粒中发现了半乳糖凝集素-3受体(23). 细胞内颗粒的聚糖尚未详细分析，但有一篇关于中性粒细胞α-1-酸性糖蛋白的报告(59)另一个关于颗粒糖脂(60)确实表明具有重复LacNAc残基的结构水平增加。
野生型半乳糖凝集素-3和突变体与未激发和TNFα激发的中性粒细胞的结合。FITC-标记的半乳糖凝集素与新制备的中性粒细胞孵育，中性粒细胞在37℃孵育30分钟(白条)或使用TNFα(灰色条)在4°C下，不含TNFα(黑色条)作为防止颗粒动员的对照。用流式细胞术测量结合半乳糖凝集素的量，并将其作为荧光强度几何平均值的平均值和S.E(年axis）对不同批次的中性粒细胞进行三次实验。这个第页值是根据成对单尾计算得出的t吨测验；配对，以降低中性粒细胞和单尾细胞之间的变异性，以专门测试与TNFα孵育后结合增加的假设。
细胞内表达突变体的生物学效应；细胞内贩运
半乳糖凝集素-3通过从胞浆进入选定的囊泡，然后与糖蛋白结合并交联，参与糖蛋白的细胞内运输(28,61)它以依赖于细胞密度和成熟度的动态方式与不同的细胞内小泡相关联(62,63). 为了探索半乳糖凝集素-3碳水化合物结合特异性与此的关系，我们检测了野生型半乳糖凝素-3和两个突变体（R186S和G182A），它们在人类乳腺癌细胞系SKBR3中表达为EGFP融合蛋白，SKBR3不表达自己的半乳糖蛋白-3(64). 半乳糖凝集素-3存在于所有细胞的胞质溶胶中，可能存在于细胞核中，表现为覆盖细胞的弥漫性染色，尽管强度不同。半乳糖凝集素-3也清楚地进入了一些细胞中的小泡，在细胞内可见强荧光点(一). 这是一个动态过程，仅在少数细胞中可见圆点，估计约占细胞的15-30%，这取决于细胞的汇合程度。每个细胞的点数也有很大差异，从1到30左右不等(条形图在里面一). 大圆点相对较少的主要模式与再循环内体和相关隔室一致，如下图所示例如COS-1细胞和MDCK细胞(63).
GFP-半乳糖凝集素-3 wt和两个突变体在SKBR3乳腺癌细胞中的表达和定位。携带EGFP-galectin-3野生型基因的pEGFP-C1载体稳定转染人乳腺癌细胞株SKBR3(面板a)，EGFP-R186S(面板b)和EGFP-G182A(面板c)分别为。细胞培养在盖玻片上，固定在4%多聚甲醛中，用带有DAPI的Prolong防褪色试剂固定，并用荧光显微镜进行分析。含半乳糖凝集素的小泡数量（视为荧光点)每种情况下，每个细胞计数为300个细胞，表示为条形图在每个样品显微镜面板下。
R186S突变体被选为潜在阴性对照，因为它不结合上述常见糖蛋白。在MDCK细胞中表达为EGFP融合蛋白，它没有进入囊泡，也没有直接靶向糖蛋白的顶端(61)它不会在入侵周围堆积志贺菌属细菌(65)野生型galectin-3也是如此。在目前条件下，在乳腺癌细胞系SKBR3的囊泡中也不可见(b条)galectin-3野生型为。
G182A突变体被纳入这些实验是因为它已经失去了野生型半乳糖凝集素-3（如上所述）基于胞浆的肿瘤生长促进作用，并且如本研究所示，它已经改变了碳水化合物结合特异性。G182A突变确实在SKBR3囊泡中积累，但每个细胞的数量要少得多(c（c）)与野生型galectin-3相比。一些细胞中有一个点的模式类似于galectin-3与Madin-Darby犬肾细胞中心体的短暂结合(62)，尽管可能还有其他解释。在这两种情况下，很明显G182A突变改变了半乳糖凝集素-3的细胞内转运。因此，半乳糖凝集素-3的碳水化合物结合特异性及其在膀胱内分选中的作用与之前提出的细胞溶质抗凋亡和Ras调节作用之间可能存在联系(43,44). 这种联系的进一步证据是半乳糖凝集素-3通过其糖结合活性的抑制剂逆转其抗凋亡作用(66).
其他半乳糖凝集素突变体的研究
少数研究分析了半乳糖凝集素突变体的生物学效应，但大多数情况下仅与简单的碳水化合物结合活性有关（或缺乏糖结合活性），而精细特异性的作用可能被忽视。半乳糖凝集素-1（R73H）中与Arg-186相对应的残基突变导致与积雪草素的结合丧失，这可能是由于此处发现的LacNAc亲和力的选择性丧失，尽管没有测试对乳糖的亲和力(67). 蘑菇半乳糖凝集素的最新结构和突变研究(68)，相应的突变体（R85A）失去了细胞外凋亡诱导活性，但保留了乳糖结合活性，这一结果也可以解释为选择性丧失了对LacNAc的亲和力，因此失去了与细胞表面糖蛋白的结合。这项和其他研究还分析了碳水化合物识别位点以外的突变体，可能破坏半乳糖凝集素的其他功能相互作用，例如二聚体的形成。然而，本研究的目的是将对碳水化合物结合精细特异性的影响与生物功能具体联系起来，以开始回答以下问题。
半乳糖凝集素-3多面特异性的作用是什么？
在这里，我们表明，依赖于Arg-186的D位点4-连接GlcNAc的偏好是半乳糖凝集素-3与糖蛋白、细胞表面、中性粒细胞活化和进入囊泡所必需的。中性粒细胞的最佳激活还需要调节B位点的GlcNAcβ，因此，C-D位点的内部LacNAc，表明与多乳糖多糖结合。即使半乳糖凝集素-3激活中性粒细胞不需要末端LacNAc残基的结合、NeuAcα2–3取代基的耐受性以及B位点对GalNAcα（和Galα）的偏好，这些性质在其他情况下也可能很重要。例如，血清糖蛋白将半乳糖凝集素-3与μ米亲和力或更好，即使它们不包含聚乳糖胺结构(50). 因此，半乳糖凝集素-3必须结合在这些分子上发现的相对罕见的末端或α2–3唾液酸化的LacNAc残基，因为它不能结合到更常见的NeuAcα2–6封端结构。与含GalNAcα或Galα血型决定簇的结合在肠上皮细胞中可能很重要N个-聚糖被这些结构而不是唾液酸所覆盖(69)其中galectin-3在指导某些糖蛋白的顶端靶向方面起着重要作用(70). 也可能在结合微生物中发挥作用(4,31).
虽然尚未完全表征，但似乎很清楚，半乳糖凝集素-3所显示的多方面特异性为不同的细胞类型和/或细胞隔室赋予了它不同的属性，这取决于与存在的聚糖结构的匹配，这一属性已被证明在半乳糖凝素-8的细胞内分选中很重要(14). 我们小组正在对这里报道的突变体进行类似的分析，现在很清楚，相对于野生型半乳糖凝集素-3，它们在内吞后也显示出细胞内分选的差异。
