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临床投资杂志。2010年11月1日；120(11): 4129–4140.
2010年10月18日在线发布。 数字对象标识：10.1172/JCI41732
PMCID公司：项目经理2964968
PMID：20978355

趋化因子Ccl5拮抗剂改善小鼠实验性肝纤维化

玛丽·路易斯·贝雷斯,1 罗里·科恩,2 安娜·鲁兰,1 米尔科·莫雷诺-扎尔迪瓦尔,1 丹尼尔·海因里克斯,1 哈塞·萨欣,1 佩特拉·施密茨,1 康拉德·L·斯特雷茨,1 托马斯·伯格,三 尼古拉·加斯勒,4 拉尔夫·魏基尔琴,5 阿曼达·普劳德富特,6 克里斯蒂安·韦伯,2 克里斯蒂安·特劳特温,1和赫尔曼·瓦斯穆特1
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补充资料

摘要

肝星状细胞对慢性炎症反应的激活是肝纤维化发展的关键一步。然而，参与免疫细胞和星状细胞相互作用的分子仍不清楚。在此，我们确定趋化因子CCL5（也称为RANTES）是这种相互作用的中心介质，它在损伤后在小鼠和人类肝脏中诱导。首先，我们发现肝纤维化患者CCL5号机组单倍型与肝内CCL5号机组mRNA表达与严重肝纤维化相关。与此一致，我们检测到Ccl5公司四氯化碳（CCl）诱导的2种小鼠肝纤维化模型中的mRNA和CCL5蛋白4)或食用蛋氨酸和胆碱缺乏（MCD）饮食。在这些模型中，Ccl5公司–/–小鼠肝纤维化减轻，星状细胞活化和免疫细胞浸润减少。移植Ccl5公司-WT受者骨髓不足可减轻肝纤维化，从而确定浸润性造血细胞是Ccl5的主要来源。然后我们发现CCL5受体拮抗剂Met-CCL5抑制培养的星状细胞迁移、增殖、趋化因子和胶原分泌。重要的是，体内注射Met-CCL5可显著改善小鼠的肝纤维化，并能加速纤维化的消退。我们的结果确定了一种通过拮抗Ccl5受体来减少实验性肝纤维化的成功治疗方法。

介绍

慢性肝病是世界范围内死亡和发病的主要原因。在慢性肝损伤中，慢性丙型肝炎病毒感染和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是美国和欧洲最常见的导致肝纤维化和终末期肝病（包括肝细胞癌）的疾病(1). 在这些疾病中，肝纤维化被认为是对持续肝细胞损伤的慢性伤口愈合反应的结果，这会导致肝脏内的炎症反应和随后肝星状细胞的激活，从而产生过量的细胞外基质蛋白(2,三). 长期以来，已确立的肝纤维化被认为是一个静态过程，但最近这一概念受到了挑战，因为发现纤维化甚至肝硬化在相当多的病例中是可逆的(4). 这些结果激发了人们对可能定义关键途径的热情，关键途径的调节可能会影响慢性肝病的自然病史并导致纤维化的消退。

慢性肝损伤期间的炎症反应是一个动态过程，不同免疫细胞（T细胞、巨噬细胞和树突状细胞）在肝内积聚(5). 这些细胞的迁移和定位由肝细胞、胆道上皮细胞和内皮细胞产生的趋化因子和细胞因子的模式决定(6,7). 重要的新数据还表明肝星状细胞参与免疫细胞向组织损伤部位的募集(8). 值得注意的是，活化的星状细胞分泌大量趋化因子（CCL2、CCL3、CCL5、CCL11、CXCL8、CXCL9和CXCL10），从而形成纤维化肝病期间免疫反应的大小和质量(8). 在这些趋化因子中，CCL2和最近的CXCL9因其对肝星状细胞和肝内免疫环境的双重作用而被确定为组织瘢痕形成的重要介质(9–11). 然而，尚未开发出直接的激动或拮抗策略来探讨其对组织损伤的具体贡献。

在当前的研究中，我们重点关注CCL5（也称为RANTES），这是一种7.8-kDa CC趋化因子，在人和小鼠肝脏损伤后强烈表达(12,13). CCL5最初被认为是T细胞特异性蛋白，但后来发现由多种细胞类型产生，包括血小板、巨噬细胞、内皮细胞和星状细胞(14). CCL5通过与3种特定G蛋白偶联受体（CCR1、CCR3和CCR5）相互作用，将T细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、NK细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞招募到炎症部位。值得注意的是，CCR5已经在分离的肝星状细胞上被描述，表明这些细胞是肝脏内CCL5的来源和靶点(13,15). 此外，最近发现2个结合CCL5、CCR1和CCR5的受体可促进小鼠体内肝纤维化(13). CCL5及其受体也被证明在其他炎症疾病中具有有害作用，包括急性Con A诱导的肝衰竭(16,17)以及动脉粥样硬化和肥胖，它们与肝脏疾病有共同的病理生理途径(18,19). CCL5的这些有趣作用和特异性CCL5受体拮抗剂Met-CCL5的可用性(20–22)使这种趋化因子对人类和实验性肝病的进一步研究特别有趣。

与这些先前的发现一起，我们在这里表明CCL5在跨物种的肝纤维化中起着关键作用，并且使用Met-CCL5对其受体进行基因缺失或药理拮抗可以改善体内实验性肝纤维化。

结果

趋化因子CCL5与人类进行性肝纤维化有关。

我们首先评估了CCL5号机组在三级转诊中心招募的HCV感染患者队列中出现肝纤维化(23). 在这个队列中，当前HapMap的分布CCL5号机组轻度纤维化患者（F0/F1）与晚期纤维化患者（F2-F4）相比，单倍型差异显著；P（P）= 0.01; 图​图1A），1A） ，由置换测试确定，可校正多次测试(24). 整体单倍型分布的差异是由于第三流行单倍型的频率较高(CCL5_H3型)晚期纤维化患者（15.4%）与轻度纤维化患者（5.9%，P（P）< 0.05; 图​图1A）。1A） ●●●●。这种单倍型的存在与严重纤维化的优势比（OR）为2.83有关。该疾病相关单倍型由rs11652536标记，显示出与功能不平衡的强连锁CCL5号机组启动子SNP（-28G/C，rs2280788；http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/). 在报告分析中，后一种SNP已被证明增加CCL5的表达(25)，尽管在我们的研究中，我们只能检测到携带rs11652536小等位基因的受试者的CCL5血清水平有略微升高的趋势（补充图1；本文在线提供的补充材料；doi:10.1172/JCI41732DS1). 然而，在一个独立的HCV感染受试者队列中，观察到的rs11652536与纤维化严重程度的相关性得到了验证（补充表1）。在显示了CCL5号机组对于肝纤维化，我们接下来研究了肝内mRNA的表达CCL5号机组在不同的肝纤维化疾病中。如图所示​图1B，1B、 的CCL5号机组与仅有轻度纤维化的肝脏样本相比，HCV感染的晚期纤维化肝脏中的mRNA显著增加(P（P）< 0.05). 我们确认增加了CCL5号机组NASH和纤维化患者肝样本中的mRNA表达与仅脂肪肝但无纤维化的受试者相比（图​（图1C；1C类；P（P）<0.05），表明CCL5号机组表达与不同病因的肝纤维化疾病相关。

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CCL5与人类肝纤维化的关系。

(A类)单体型分析CCL5号机组轻度（F0/F1期，2n个=200）或晚期（F2–F4阶段，2n个=222）肝纤维化。轻度纤维化患者与重度纤维化患者之间的整体单倍型分布存在显著差异(P（P）= 0.01). 特别是第三种最常见的单倍型，CCL5_H3型与轻度纤维化患者（5.9%，OR 2.83*P（P）< 0.05). (B类)CCL5号机组与轻度纤维化患者相比，晚期HCV诱导纤维化患者的mRNA表达显著升高(*P（P）< 0.05). (C类)协会CCL5号机组NASH致纤维化患者肝纤维化的mRNA表达得到证实(*P（P）< 0.05).

实验性肝纤维化动物模型中Ccl5表达增加。

接下来，我们评估了受到两种实验性肝纤维化模型（四氯化碳（CCl））影响的C57BL/6 WT小鼠的Ccl5肝内表达4)注射和蛋氨酸和胆碱缺乏（MCD）饮食。在这两种模型中，Ccl5公司与未经处理的对照小鼠相比，mRNA水平显著增加（图​（图2A；2A；P（P）与未经治疗的小鼠相比均<0.01），这与最近公布的胆管结扎数据一致(13). 重要的是，观察到的Ccl5公司Ccl5蛋白水平证实了治疗动物肝脏中的mRNA水平（图​（图2B；2B类；P（P）<0.01和P（P）<0.001，比较CCl4MCD小鼠和未经治疗的小鼠）。为了评估肝纤维化中浸润免疫细胞或肝常驻细胞是否主要表达Ccl5，我们制作了骨髓嵌合体，并在其中移植Ccl5公司-淘汰赛(Ccl5公司–/–)骨髓输给WT受体(Ccl5公司–/–→ WT小鼠）和WT骨髓Ccl5公司–/–收件人（WT→Ccl5公司–/–老鼠）。与对照小鼠（WT骨髓转化为WT受体[WT→WT小鼠]）和WT相比→Ccl5公司–/–老鼠，Ccl5公司–/–→野生型嵌合体在CCl中表现出显著降低的Ccl5蛋白水平4-受损肝脏（两者P（P）< 0.01; 图​图2C）。2C） ●●●●。为了进一步观察哪些免疫细胞表达Ccl5，我们对CCl中的Ccl5进行了免疫荧光染色4-治疗动物。未经处理的对照肝仅显示出微弱的Ccl5染色，但在纤维化诱导后，在血管周围检测到强烈的Ccl5信号（图​（图2D，2D、 顶部和中间面板）。与抗CD3结合显示，大量Ccl5阳性细胞是浸润受损肝脏的T细胞（图​（图2D，2D、 底部面板）。

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Ccl5与小鼠实验性肝纤维化的关系。

(A类)抄送5两种CCl处理小鼠的总肝脏中mRNA表达均显著增加46周或MCD饮食8周(**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001). (B类)增加的表达Ccl5公司在两种肝损伤模型中的蛋白质水平也很明显(**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001). (C类)在接受来自Ccl5公司–/–老鼠(Ccl5公司–/–→ CCl后WT）4与接受WT骨髓（WT→WT）的WT小鼠相比的挑战(**P（P）<0.01）或Ccl5公司–/–小鼠移植WT骨髓（WT→Ccl5公司–/–) (#P（P）<0.05），表明造血细胞是CCl期间Ccl5的主要来源4-诱导肝纤维化。(D类)小鼠肝脏中Ccl5的免疫组织化学检测显示，正常肝脏中仅有微弱染色（原始放大倍数×100[顶面板]）。CCl治疗后，Ccl5的表达主要在血管周围增加4（原始放大倍数，×100[中间面板]）。与抗CD3（T细胞）结合显示，大量Ccl5阳性细胞对CD3也呈阳性（原始放大倍数×200[底部面板]）。

Ccl5基因缺失可减少体内实验性肝纤维化。

根据这些发现，我们假设Ccl5公司应该会降低小鼠发生肝纤维化的倾向。我们这样对待抄送5WT和Ccl5公司–/–患有CCl的动物4诱导肝纤维化。如图所示​图3A，三A、，Ccl5公司–/–与WT同胞相比，小鼠肝纤维化程度较轻。组织学上的天狼星红阳性区域减少，说明了这种差异（图​（图3A；三A；P（P）<0.001），胶原蛋白特异性氨基酸羟脯氨酸的肝含量降低（图​（图3A；三A；P（P）< 0.05). 敲除动物的ALT值也显著降低（图​（图3B；三B类；P（P）<0.01）6周CCl后4治疗。降低的ALT水平Ccl5公司–/–单次注射CCl 24小时后，小鼠与WT小鼠相比已经明显4（补充图2A），表明炎症性肝细胞损伤在Ccl5公司–/–小鼠与WT同窝小鼠进行比较。

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实验性肝纤维化Ccl5公司-击倒老鼠。

(A类)WT和Ccl5公司–/–CCl激发后的小鼠4（原始放大倍数，×40）。减少肝纤维化Ccl5公司–/–老鼠(n个=12/组）通过显著降低的天狼星红-阳性区域进行验证(***P（P）<0.001）和羟脯氨酸浓度降低(*P（P）< 0.05). (B类)Ccl5公司–/–与WT同窝小鼠相比，小鼠的ALT值也较低(**P（P）< 0.01). (C类)治疗Ccl5公司–/–CCl小鼠4导致mRNA水平显著降低第1a1列,Tgfb1型,时间1、和伊尔6（全部带有P（P）值至少<0.05*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001），与WT小鼠相比。(D类)免疫组织化学显示肝内α-SMA阳性细胞减少Ccl5公司–/–小鼠在肝纤维化诱导后与WT小鼠进行比较（原始放大倍数，×100）。α-SMA蛋白表达的减少也明显见于Ccl5公司–/–小鼠（代表性样品）。(电子)改善了Ccl5公司–/–老鼠(n个=12/组），如典型的天狼星红染色（原始放大倍数，×40）所示。胶原蛋白沉积减少Ccl5公司–/–动物通过缩小的天狼星红-阳性区域进行验证(***P（P）<0.001）和较低的羟脯氨酸浓度(*P（P）< 0.05). (F类)如CCl中所述4模型中，ALT值也在Ccl5公司–/–喂食MCD饮食后的小鼠(**P（P）< 0.01). (G公司)同样，第1a1列和时间1mRNA减少Ccl5公司–/–用MCD饮食喂养8周后，小鼠与其窝友进行比较(*P（P）< 0.05). (H（H）)此外，Ccl5公司–/–小鼠表现出降低肝脏甘油三酯水平的趋势(P（P）= 0.1).

为了进一步确定Ccl5在实验性肝纤维化中的作用，我们测定了肝纤维化相关关键基因的表达Ccl5公司–/–慢性CCl后的小鼠及其窝友4管理。如图所示​图3C，三C、 减少缺乏肝纤维化的小鼠抄送5与不同基因的表达改变有关，这些基因与细胞外基质蛋白的沉积和翻转密切相关。这些包括第1a1列,Tgfb1型,百万英镑9,时间1，和炎症细胞因子伊尔6(26). 由于大多数这些基因也与肝星状细胞的生物学有关(27)，我们还评估了CCl治疗后这些细胞的激活情况4根据之前的结果，α-SMA的免疫荧光染色显示Ccl5公司–/–小鼠与野生动物比较。这一发现通过全肝提取物中α-SMA的Western blot分析得到证实（图​（图3D），三D） 表明星状细胞的活化因以下基因的缺失而强烈降低Ccl5公司在小鼠中。这似乎是由于免疫介导的激活发生了变化，因为从WT分离的原代星状细胞与从WT中分离的原发性星状细胞之间的体外激活没有差异Ccl5公司–/–小鼠（补充图3）。与这些结果一致，炎症浸润在Ccl5公司–/–小鼠，显示慢性CCl后肝内巨噬细胞和T细胞显著减少4给药（补充图2B）。

值得注意的是，我们在CCI中复制了我们的发现4饮食诱导肝损伤模型中的肝纤维化模型。用MCD饮食喂养小鼠8周后，Ccl5公司–/–与WT同窝小鼠相比，小鼠的肝纤维化程度再次降低。这种差异在组织学检查中很明显，并通过羟脯氨酸水平显著降低得到证实（图​（图3E）。三E） ●●●●。如CCl中所述4模型，Ccl5公司–/–小鼠的ALT值也降低了（图​（图3F；三F；P（P）<0.01）和抑制纤维化前mRNA表达（图​（图3G）三G） 与野生动物相比。Ccl5公司–/–与WT同窝小鼠相比，小鼠的肝脏甘油三酯水平也有降低的趋势（图​（图3H；三H；P（P）=0.1），表明Ccl5也可能对脂肪性肝炎相关纤维化的代谢参数产生影响。

从造血细胞中删除Ccl5足以改善体内肝纤维化。

CCL5由肝常驻细胞分泌(8,13)以及浸润免疫细胞(14). 为了明确哪些细胞是靶细胞，哪些是Ccl5的主要来源，我们进行了骨髓移植实验，其中Ccl5公司–/–骨髓重建为WT受体(Ccl5公司–/–→WT小鼠），反之亦然（WT→Ccl5公司–/–小鼠）。在这些实验中，用WT骨髓移植的WT小鼠（WT→WT小鼠）作为对照。所有移植小鼠均接受CCl4造模6周。如图所示​图4，4，将WT骨髓移植到Ccl5公司–/–收件人（WT→Ccl5公司–/–与WT→WT小鼠相比，仅导致肝纤维化中度减轻。相反，接受来自Ccl5公司–/–组织学、羟脯氨酸水平和关键纤维化基因mRNA表达的抑制证明，供体肝瘢痕明显减轻（图​（图4）。4). 这些结果进一步支持了我们的假设，即毒性损伤后肝纤维化的发展需要浸润免疫细胞表达Ccl5。

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骨髓嵌合小鼠。

(A类)接受骨髓的WT小鼠Ccl5公司–/–与对照组相比，小鼠肝纤维化明显减轻Ccl5公司–/–或移植WT骨髓的WT动物(n个=7–8/组；原始放大倍数，×40）(B类)肝损伤倾向降低Ccl5公司–/–→ 组织学上的下天狼星红阳性区域也显示为WT小鼠(***P（P）< 0.001), (C类)羟脯氨酸肝含量降低(***P（P）<0.001），以及(D类)较低的ALT值(*P（P）< 0.05). (电子)纤维化相关基因的mRNA表达，第1a1列,时间1、和Tgfb1型，在Ccl5–/–→ WT小鼠与其他组的比较(***P（P）< 0.001, **P（P）< 0.01, *P（P）< 0.05).

Met-CCL5拮抗CCL5对星状细胞的作用。

骨髓嵌合体实验表明，肝浸润细胞是Ccl5的有效来源（图​（图2C），2C） ，我们接下来评估了CCL5和CCL5受体拮抗剂Met-CCL5对永生化的直接生物学作用(28)和原代肝星状细胞，一种已知的CCL5在肝纤维化期间的常驻靶细胞类型(13). Met-CCL5是一种重组CCL5类似物，其起始蛋氨酸残基在原核细胞中重组生产后保留，从而产生小鼠CCL5受体CCR5和CCR1的有效拮抗剂(20,22). 如图所示​图5A，5A、 Met-CCL5能够显著抑制星状细胞向CCL5的迁移，这是星状细胞在纤维化过程中的一个重要生物学方面。此外，Met-CCL5显著抑制CCL5-和CCL5/Tnf-α诱导的Ccl2分泌，Ccl2是一种已知的纤维化前趋化因子(10)（图​（图5B）。5B） ●●●●。如上所示，大多数Ccl5由受损肝脏内的免疫细胞分泌。因此，我们研究了脾细胞培养条件培养基对肝星状细胞生物学行为的直接影响。当星状细胞与来自WT衍生脾细胞的条件培养基孵育时，它们的迁移、增殖和胶原蛋白分泌比与对照培养液孵育的细胞强烈增加。相比之下，星状细胞的所有这些特征都被从Ccl5公司–/–小鼠或用Met-CCL5预处理星状细胞（所有P（P）< 0.01; 图​图5，5（C–E）。相反，根据Annexin-V阳性测定，Met-CCL5并未改变星状细胞的凋亡诱导（补充图4A）。重要的是，永生化星状细胞的结果在原代肝星状细胞中得到了再现，其胶原蛋白的生成和增殖特征证明了对Ccl5的反应（补充图4、B和C）。综上所述，这些结果表明CCL5拮抗剂Met-CCL5具有强烈抑制免疫细胞和星状细胞之间相互作用的潜力。

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体外证据表明Ccl5在肝纤维化中的作用。

(A类)在Boyden室实验中评估了星状细胞向Ccl5的迁移。星形细胞积极向Ccl5迁移(***P（P）<0.001，与培养基相比），这被Met-CCL5预处理细胞强烈抑制。(B类)Ccl5和Ccl5/Tnf-α刺激星状细胞导致Ccl2分泌增加(*P（P）<0.05，与未刺激细胞相比），这可以被Met-CCL5显著抑制(#P（P）<0.05，与Ccl5-和Ccl5/Tnf-α刺激细胞相比）。WT小鼠活化T细胞富集脾细胞培养上清液强烈刺激迁移(C类)，增殖(D类)和胶原蛋白分泌(电子)星状细胞。星状细胞的这些纤维化前表型被来自以下两种脾细胞的上清液严重钝化：抄送5–/–小鼠或用Met-CCL5预处理星状细胞(**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001). 所有体外实验至少进行两次，每次四次。

Met-CCL5的药理拮抗作用可降低体内肝纤维化。

基于这些体外数据，我们评估了Met-CCL5对CCL5受体的药理拮抗是否可以改变体内肝纤维化的进展。我们首先给WT小鼠每日服用Met-CCL5（10μg）或载体，同时服用12 CCl4注射超过6周。最后一次CCl后三天4注射，处死动物并评估纤维化表型。如图所示​图6，6天狼星红阳性区域的量化和肝脏羟脯氨酸含量的生化测量证明，与车用小鼠相比，使用Met-CCL5治疗的小鼠的肝脏瘢痕明显减轻(P（P）<0.05和P（P）分别<0.01）。根据在Ccl5公司–/–小鼠和我们的体外数据，关键促纤维化基因第1a1列和时间1与溶媒治疗相比，服用Met-CCL5显著抑制（图​（图6C），6C） α-SMA蛋白表达也一样（补充图5A）。由于CCL5是一种已知的免疫细胞化学引诱剂，我们假设服用Met-CCL5时，损伤肝脏中的炎症浸润会发生变化。因此，我们通过FACS分析和免疫组织化学来评估免疫细胞在肝内的浸润。而服用Met-CCL5对NK和NKT细胞的数量没有显著影响（图​（图6D），6D） T细胞，特别是CD8的数量+与车辆处理小鼠相比，Met-CCL5处理小鼠的T细胞显著减少(P（P）< 0.0001,P（P）分别<0.00001；图​图6E）。6E） ●●●●。此外，CD68的数量+经Met-CCL5处理的动物的巨噬细胞显著减少（图​（图6F），6F） ，而B220+B细胞和CD11c+树突状细胞与车辆处理小鼠相比没有显著变化（补充图5）。

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Met-CCL5对肝纤维化的体内抑制作用。

(A类)CCl的代表性天狼星红色染色4-治疗C57BL/6 WT小鼠，同时给药溶媒或Met-CCL5(n个=10/组；原始放大倍数，×40）。(B类)经Met-CCL5治疗的小鼠的纤维化程度减轻，这一点通过显著降低的天狼星红阳性区域得到验证(*P（P）<0.05）和羟脯氨酸浓度降低(**P（P）< 0.01). (C类)Met-CCL5治疗小鼠的纤维化反应减少，进一步证明是显著减少第1a1列和时间1mRNA水平(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01). (D类)经溶媒和Met-CCL5治疗的动物中NK1.1和CD3阳性细胞浸润的代表性FACS印迹显示，Met-CCL5-治疗小鼠的肝脏中T细胞浸润减少，而NK和NKT细胞的数量没有显著改变。(电子)T细胞浸润（FACS）的统计分析显示，使用Met-CCL5治疗后，CD3-，特别是CD8-阳性细胞的数量显著减少(***P（P）< 0.001). (F类)此外，CD68的数量+-与经载体处理的小鼠相比，经Met-CCL5处理的动物中的阳性巨噬细胞也减少(*P（P）< 0.05,n个=10/组）。(G公司)通过组织学（原始放大倍数×40）在MCD纤维化模型中验证Met-CCL5的抗纤维化潜力。(H（H）)组织学上较低的天狼星红阳性区域证明Met-CCL5治疗小鼠肝损伤减轻(**P（P）<0.01）并显著降低羟脯氨酸水平(**P（P）<0.01）。

为了证实Met-CCL5的抗纤维化作用，我们让喂食MCD饮食的小鼠每天注射Met-CCL 5（10μg/天）或载体注射。如图所示​图6，6在该模型中，G和H，Met-CCL5也能够显著降低肝纤维化，这表明Met-CCL 5可以在不同病因的肝脏疾病中实现抗纤维化作用。与其他模型一样，服用Met-CCL5也会导致ALT水平降低和纤维症相关基因的抑制（补充图6，分别为a和B）。

Met-CCL5加速体内纤维化消退。

在后一个实验中，Met-CCL5与纤维化刺激同时服用，因此显示可以改善肝脏瘢痕形成的进展。在下一组实验中，我们测试了以下假设：Met-CCL 5治疗也可以诱导已确立的肝纤维化的消退。为此，用CCl攻击C57BL/6小鼠4持续8周建立严重纤维化。然后将小鼠分为两组，一组在纤维化消退期间每天注射Met-CCL5，另一组每天注射溶媒，如图所示​图7A，7A、 与使用载体治疗的动物相比，Met-CCL5治疗确实加快了肝脏瘢痕的消退。7天后，这种差异在组织学上很明显（图​（图7B），7B） 在同一时间点，Met-CCL5治疗小鼠的羟脯氨酸水平降低证实了这一发现（图​（图7C；7C类；P（P）< 0.05). 7天后，Met-CCL5处理小鼠肝脏中胶原蛋白含量的显著变化是在抑制第1a1列和时间1纤维化高峰后3天mRNA表达（图​（图7D；7D类；P（P）< 0.05).

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Met-CCL5在体内加速肝纤维化的消退。

(A类)用CCl攻击C57BL/6小鼠4持续8周以建立晚期肝瘢痕。最后一次CCl后三天4注射（在纤维化高峰期），小鼠接受Met-CCL5或载体(n个=8/组），并在7天的总持续时间内通过组织学检查评估纤维化消退。在第7天，接受Met-CCL5的小鼠显示出与车辆治疗组相比，残余纤维化显著减少（原始放大倍数，×40）。(B类)两组之间的差异可以通过Met-CCL5治疗小鼠中天狼星红阳性区域的减少来证明(*P（P）<0.05）和(C类)通过在纤维化消退的同一时间点显著降低羟脯氨酸含量(*P（P）< 0.05). (D类)在功能上第1a1列和时间1在开始Met-CCL5或车辆治疗后的第3天已经显著减少(*P（P）< 0.05).

讨论

在此，我们提供证据证明CC趋化因子CCL5是不同慢性肝病肝纤维化的分子介质，并且Met-CCL5对CCL5受体的药理拮抗作用足以减少实验性肝瘢痕形成并增强其在体内的消退。

不同的证据表明CCL5在本质上参与了肝纤维化。的作用CCL5号机组首次使用遗传和分子分析在不同人类肝病中进行评估。我们的单倍型分析显示了功能的遗传关联CCL5号机组HCV感染肝纤维化严重程度的基因变异。最近的研究仅调查了CCL5号机组丙型肝炎病毒感染患者的启动子(29,30). 这些后来的研究报告了在基因的-28位和-304位变异的关联CCL5号机组基因，与肝活检炎症分级有关。然而，单个SNP研究容易被过度解释，因为没有考虑遗传位点的连锁不平衡(31). 因此，我们选择了单倍型分析，所有标签SNP都来自HapMap项目的完整数据集(32). 重要的是，我们在一个独立队列中复制了我们的基因发现。然而，我们只能在携带风险相关标记SNP的次要等位基因的携带者中检测到CCL5血清水平略微升高的趋势。这表明，基因决定的血清水平可能只对风险等位基因携带者的纤维化增加起到轻微作用，进一步研究这种SNP的功能重要性可能是值得的。

在我们分析的第二步中，我们发现CCL5号机组与肝纤维化的存在密切相关。虽然这已经被建议用于丙型肝炎病毒(12,13,33)，据我们所知，我们的数据首次显示了CCL5号机组脂肪性肝病中mRNA表达和纤维化的存在，无HCV复合感染。表达增加Ccl5公司在本研究中，在毒性和代谢性肝纤维化动物模型的mRNA和蛋白水平上也得到了证实。肝损伤小鼠中mRNA的高水平表达与最近发表的一篇文章一致(13)而蛋白质水平尚未分析。然而，鉴于对微小RNA和翻译后基因调控的其他方面的知识不断扩展，研究趋化因子蛋白水平似乎是强制性的。重要的是，我们通过产生骨髓嵌合小鼠和免疫组织化学方法，确定造血细胞，更具体地说，T细胞是受损肝脏内Ccl5蛋白的主要来源。由于已知T细胞和巨噬细胞共同分泌CCL5，这些结果支持了这样一种假设，即肝内浸润细胞对组织损伤程度有显著影响(6,11).

然而，后一种观察结果本质上是关联的，无法区分因果关系。因此，我们分析Ccl5公司–/–老鼠和他们的WT室友在公认的CCl中进行纤维化进展4和MCD肝损伤模型。这些实验基于一个先验假设，即Ccl5公司会减少体内的肝脏疤痕。如图所示​图3，三,抄送5–/–与同窝的WT小鼠相比，小鼠确实有显著降低严重纤维化的倾向。尤其是，Ccl5公司–/–小鼠的ALT水平也降低，这表明肝脏中的炎性肝细胞损伤也由Ccl5决定，而先天免疫系统的其他介质需要进一步确定(34).

基于这些结果，我们假设在我们的模型中，浸润的造血（免疫）细胞是Ccl5的主要来源，而肝星状细胞应该是Ccl的主要靶点。为了澄清这些假设，我们进行了骨髓移植Ccl5公司–/–小鼠变成WT小鼠，反之亦然。结果表明，删除Ccl5公司在肝脏常驻细胞中，仅导致纤维化表型的中度改变，而Ccl5公司组织学、羟脯氨酸和纤维素酶相关基因表达证明，造血细胞导致肝瘢痕形成显著减少。这些结果与动脉粥样硬化的数据一致(18)事实上，支持了我们的假设，即星状细胞是靶细胞(15)而不是来源(8)CCl中Ccl5的4-诱导性纤维化，这与Seki等人的最新发现一致(13). 然而，根据已知的Ccl5化学引诱剂特性(14)在Ccl5缺乏小鼠或接受Met-Ccl5治疗的动物中，T细胞和巨噬细胞（均表达Ccl5受体）也减少。T细胞和巨噬细胞浸润的减少可能导致肝细胞副损伤减少，反过来，ALT水平降低，这在我们所有的体内模型中都得到了一致的证明。

我们进一步研究了Ccl5对原代和永生化星状细胞的直接影响(28). 如图所示​图5，5，Ccl5对星状细胞的迁移和增殖有显著影响，这些细胞被Ccl5拮抗剂Met-Ccl5强烈抑制。Met-CCL5还能够显著减少CCL5介导的Ccl2释放，Ccl2是星状细胞产生的一种关键的纤维化前趋化因子。然而，这些实验只研究单个分子对星状细胞表型的影响，而在体内不同的分子相互作用。因此，我们对T细胞富集脾细胞培养物的条件培养基对星状细胞的增殖、迁移和胶原生成的影响进行了关键的体外实验。如图所示​图5，5，使用来自Ccl5公司–/–小鼠或用Met-CCL5预处理星状细胞确实强烈抑制了所有与纤维化相关的星状细胞表型。这些结果强化了免疫细胞和星状细胞之间直接相互作用的概念，星状细胞最近被描述为肝纤维化的重要途径(5). 根据我们的数据，我们表明免疫细胞分泌的Ccl5是这种相互作用的主要介质之一，体内的Met-Ccl5可能会抑制Ccl5效应。

这导致了我们进行了一项中心实验，在该实验中，我们将Met-CCL5与CCl联合应用于WT小鼠4治疗或MCD饮食。如图所示​图6，6与使用汽车治疗的动物相比，使用Met-CCL5治疗的动物确实发生了明显较少的肝损伤。Met-CCL5的作用在组织学、生化（羟脯氨酸）和分子(第1a1列和时间1mRNA）水平，表明CCL5受体拮抗剂对肝脏瘢痕形成具有深刻的药理作用。此外，我们发现T细胞（主要是CD8）浸润减少+经Met-CCL5治疗的小鼠肝脏中的T细胞）和巨噬细胞，它们被认为直接促进纤维化(35,36).

后一项实验侧重于Met-CCL5对纤维化进展的影响，而在纤维化消退期间，趋化因子拮抗策略的影响在临床上更具相关性。因此，我们给受到CCl攻击的小鼠注射Met-CCL54在纤维化高峰期，测定这些动物与车用治疗动物的纤维化消退。在这些情况下，Met-CCL5确实能够在随访期间加速实验性纤维化的消退（图​（图7），7)为临床前试验中CCL5对抗策略的进一步研究提供了理论基础(37).

总之，我们在这里提供了体外和体内证据，证明CC趋化因子CCL5是实验性肝纤维化的关键介质。至关重要的是，我们表明CCL5受体的药理拮抗作用足以调节体内肝脏瘢痕形成的进展和消退，从而描述了我们认为的第一种抗纤维化治疗，它拮抗实验性肝病中的单一趋化因子途径。

方法

人类研究人群。

总的来说，211名欧洲血统慢性HCV感染患者被纳入了基因分析(23). 根据抗-HCV试验阳性（雅培）和HCV-RNA试验阳性（罗氏）诊断为慢性HCV感染。在所有受试者中，通过适当的血清学检测排除了其他肝病。所有患者的平均酒精摄入量均未超过每天20克。根据Desmet和Scheuer评分系统，所有患者均在抗病毒治疗前进行肝活检，纤维化和炎症由一名病理学家进行评分(38). 来自CharitéUniversity Hospital胃肠科的一组欧洲血统患者作为基因分析的验证样本。

此外，从54例慢性HCV感染患者、20例脂肪肝患者和22例NASH患者中分离出了总的肝脏mRNA，这些患者接受了肝脏活检以进行疾病分期，如前所述(11). 我们还测定了72例慢性丙型肝炎患者血清样本中CCL5的血清浓度，与CCL5号机组使用CCL5 ELISA（研发系统）进行基因分型。患者在纳入研究前给予知情同意，研究方案得到亚琛大学和柏林大学伦理委员会的批准。

人类遗传分析。

我们从国际HapMap项目的完整数据集中鉴定了2个SNPs，该项目涵盖了CCL5号机组17号染色体上带有Haploview 4.0的基因(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/). 这些SNP（rs2291299和rs11652536）使用5′-内切酶（TaqMan）分析和Applied Biosystems的assays-on-Demand进行基因分型。然后将基因型数据上传到PHASE 2.0(24)，并推断出单倍型。这些单倍型在轻度纤维化（F0/F1）和晚期纤维化（F2–F4）患者之间的分布通过排列测试进行比较，该测试正式修正了亚琛大学筛查队列中的多项测试(24). 在单倍型分布上显示出显著差异后，特定单倍型的频率(CCL5_H1到CCL5_H4型)采用Fisher精确检验对不同纤维化程度的队列进行比较，并计算高危等位基因携带者重度纤维化的OR。单倍型是根据其频率命名的，来源于CCL5_H1类到CCL5_H4型在验证队列中CCL5_H3型对单倍型标签SNP rs11652536进行基因分型，并使用德国慕尼黑工业大学人类遗传学研究所提供的遗传软件对数据进行分析(网址：http://ihg.gsf.de).

人肝活检中CCL5 mRNA的表达分析。

如前所述，使用SuperScript（Invitrogen）分离并反向转录肝脏总RNA(11). 定量RT-PCR用于CCL5号机组采用按需检测（应用生物系统）。

小鼠体内实验。

靶向删除Ccl5公司基因(Ccl5公司–/–小鼠）从Jackson实验室获得，并回交到C57BL/6背景上超过10代。动物护理和实验是在德国科隆Bezirksregierung动物实验审查委员会书面批准实验后进行的。带有WT的LittermatesCcl5公司在C57BL/6背景上作为对照。这个Ccl5公司–/–我们研究中使用的小鼠没有明显的形态或功能异常表型，但这些动物的T细胞增殖减少(39).

小鼠接受2种不同的纤维化模型。在第一个模型中，Ccl5公司–/–和WT小鼠(n个=每组12只小鼠）接受CCl腹腔注射4持续6周（0.6 mg/kg，每周两次）。最后一次注射后3天处死小鼠。在第二个模型中，Ccl5公司–/–和WT小鼠(n个=每组12只小鼠）喂食MCD饮食（MP Biomedicals Europe）8周，这是NASH的既定模型(40).

在另一项实验中，C57BL/6 WT小鼠接受CCl4注射6周，每天与10μg Met-CCL5静脉注射或生理盐水静脉注射并行治疗。Met-CCL5是CCL5受体CCR1和CCR5的选择性拮抗剂。我们小组以前已经描述过它的合成(16,41). Met-CCL5的体内剂量是根据我们在动脉粥样硬化动物模型中的经验选择的(18). 最后一次CCl后3天处死小鼠4注入以进行进一步分析。在为期8周的MCD饮食喂养实验中，使用相同的Met-CCL5给药方案诱导代谢性肝纤维化(n个=10只小鼠/组）。

在另一组实验中，C57BL/6 WT小鼠接受CCl4注射8周以建立明显的纤维化。CCl公司4然后停止，计算出纤维化峰值发生在最后一次CCl后3天4注射（纤维化消退的第0天）。然后在小鼠肝纤维化高峰后3天和7天监测肝纤维化的消退，小鼠接受Met-CCL5（10μg/d）或溶媒(n个=8只小鼠/组/时间点）。

在所有动物中，通过使用NIH ImageJ软件对每张幻灯片上10个低倍（放大倍数×40）场的天狼星红阳性区域进行定量，对肝纤维化进行组织学评估(网址：http://rsbweb.nih.gov/). 如前所述，肝纤维化也通过胶原蛋白特异性氨基酸羟脯氨酸的光度测定进行生化评估(42).

Ccl5 ELISA和α-SMA Western blot。

将速冻的肝脏样品置于1 ml RIPA缓冲液（20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2%Nonide P40、0.1%SDS、0.5%Na-deoxycholate）和蛋白酶抑制剂（微型完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒片，罗氏应用科学）中培养30分钟，以分离总蛋白。按照制造商的说明，使用小鼠ELISA（R&D系统）进行两次肝内Ccl5分析。肝内Ccl5浓度以pg/mg肝总蛋白表示。

使用单克隆鼠抗鼠α-SMA抗体（Millipore）从总肝蛋白进行α-SMA的Western blotting。使用辣根过氧化物酶结合抗鼠IgG（DAKO）和SuperSignal化学发光底物（Thermo Fisher Scientific）观察一级抗体。GAPDH被用作负荷控制。

肝甘油三酯水平。

在均质肝组织中测定肝甘油三酯含量。标准曲线是根据甘油三酯液色单分析（人类诊断）的分析方案绘制的。将每个肝脏样本的2μg放入96 well ELISA板中。添加200μl试剂盒试剂后，在室温下培养样品45分钟。在60分钟的孵育期内，在492 nm OD下测量样品。

小鼠肝组织的免疫荧光染色。

用山羊抗鼠多克隆Ccl5抗体（sc-1410，Santa Cruz Biotechnology Inc.）在丙酮固定的5μm肝组织冰冻切片上对Ccl5进行免疫荧光染色。用大鼠抗小鼠CD3抗体（ABD Serotec）进行CD3的共培养。用鼠抗鼠α-SMA单克隆抗体（Millipore）对α-SMA进行染色。

为了分析巨噬细胞、B细胞和树突状细胞的肝内含量，使用单克隆大鼠抗小鼠CD68抗体（ABD Serotec）、单克隆大白鼠抗小鼠B220抗体（Cederlane Laboratories）或单克隆亚美尼亚仓鼠抗CD11c抗体（eBioscience）对切片进行染色。所有染色均由适当的同型对照品控制。

骨髓移植。

我们移植了Ccl5公司–/–或WT小鼠(n个=7–8/组），如前所述，在消融γ射线照射后，将其分为6至8周龄的受体（均为C57BL/6J背景）(18). 重建4周后，小鼠接受6周CCl治疗4，如上所述。

CCL5和小鼠纤维素瘤相关基因的表达分析。

从小鼠肝脏中分离总RNA，并使用SuperScript（Invitrogen）进行逆转录。定量RT-PCR用于Ccl5公司,第1a1列,时间1,Tgfb1型,百万英镑9、和伊尔6采用按需分析（应用生物系统）。

肝免疫细胞分离和流式细胞术分析。

使用机械和酶消化法从新鲜收获的肝脏中分离出单细胞悬浮液。在800℃下离心20分钟，从悬浮液中纯化活的白细胞克，使用密度梯度分离介质（Lympolyte-H，Cederlane Laboratories）。从梯度/上清液界面收集PBMC，然后在补充有1%牛血清白蛋白和2 mM EDTA的Hank平衡盐溶液中洗涤。对于流式细胞术分析，使用CD45、CD3、CD4、CD8和NK1.1（电子生物科学）的荧光染色抗体对细胞进行染色，并使用FACSCanto II（Becton Dickinson）对相对数量进行量化。使用FlowJo软件（Tree Star）分析数据。

细胞迁移分析。

使用改良的Boyden室进行细胞迁移分析。简单来说，星状细胞（4×104细胞/孔）置于DMEM的上腔中，无FCS，与100 ng Met-CCL5预孵育30分钟，并在下腔中暴露于重组小鼠CCL5（20 ng）。Met-CCL5的体外剂量在1到1000 ng/ml的浓度梯度上调整为最小有效剂量。在另一个实验中，星状细胞暴露于来自WT小鼠脾细胞的条件培养液中，无论是否含有Met-CCL 5（100 ng/ml），或来自Ccl5公司–/–下腔中的脾细胞（见下文）。在37°C下孵育4小时后，在6个随机选择的（放大倍数×100）区域中对迁移到下室的细胞进行计数。所有实验均至少重复两次，共四次。

用Ccl5和Met-Ccl5刺激小鼠星状细胞系GRX。

小鼠肝星状细胞系GRX的培养已在前面描述过(28). 对于趋化因子刺激，细胞在含有1%胎牛血清的DMEM（PAA Laboratories）中饥饿24小时，并用20 ng/ml重组小鼠Ccl5单独或与0.25 ng/ml TNF-α（两种研发系统）联合刺激，加或不加100 ng/ml Met-Ccl5，刺激24小时。按照制造商的说明，使用小鼠ELISA（R&D Systems）一式两份测定上清液中的Ccl2浓度。Ccl2浓度以pg/ml上清液为单位。

细胞增殖试验。

按照制造商的说明，通过基于DNA合成过程中BrdU掺入量的比色免疫分析（Cell Proliferation ELISA，Roche Applied Science）评估原代或永生化肝星状细胞的增殖。简言之，将细胞在不含胎牛血清的DMEM培养基（PAA Laboratories）中饥饿16小时，并用来自WT脾细胞的条件培养基（含或不含Met-CCL5（100ng/ml））或来自Ccl5公司–/–脾细胞（见下文）。预培养后，用BrdU标记细胞2小时。在去除标记介质、固定细胞和DNA变性后，通过添加抗BrdU过氧化物酶抗体并测量随后的底物反应来评估BrdU掺入。

用条件培养基分离脾细胞并刺激GRX细胞。

脾细胞来自Ccl5公司–/–并且使用标准方案分离WT小鼠。细胞培养24小时并转移到另一个组织培养瓶中，减少粘附细胞的百分比。细胞计数后，细胞浓度调整为2×106每毫升细胞数。对于条件培养基Ccl5公司–/–或WT小鼠用10μg/ml伴刀豆球蛋白A（Sigma-Aldrich）孵育48小时，并通过PES膜（Nalgene；0.1-μm网孔直径）过滤以去除细胞和碎片。培养的GRX细胞用WT小鼠脾细胞的条件培养基孵育24小时，使用或不使用Met-CCL5（100 ng/ml）预处理30分钟，或从Ccl5公司–/–脾细胞。获得上清液，并使用多克隆兔抗鼠I型胶原抗体（Monosan）通过Western blot分析评估胶原浓度。使用辣根过氧化物酶结合抗兔IgG（DAKO）和SuperSignal化学发光底物（Thermo Fisher Scientific）观察一级抗体。使用Quantity One软件（Bio-Read）对谱带进行半定量分析。

小鼠原代肝星状细胞的分离和培养。

从C57BL/6小鼠和Ccl5公司–/–小鼠，如我们小组之前所述(43). 分离后，细胞在补充有10%胎牛血清（Biochrom KG）的DMEM（PAA Laboratories）中培养，4 mM我-谷氨酰胺（PAA实验室）、100 IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素（PAA实验）。首次电镀后1天更换培养基，之后每三天更换一次，同时培养物保持在37°C，5%CO2，在潮湿的空气中。

统计学。

数据以平均值±SEM表示。连续变量通过双面比较t吨在方差不相等的情况下进行韦尔奇修正。列联表中的变量通过Fisher精确检验进行比较，我们还计算了遗传分析的OR。P（P）在所有分析中，小于0.05的值被认为是显著的。使用GraphPad Prism 4.0进行统计测试。

补充材料

补充数据：
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致谢

这项研究得到了德意志基金会（SFB/TRR 57）和亚琛大学医学院的资助（START和IZKF对Wasmuth阁下的资助）。

脚注

利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。

本文引文： 临床投资杂志。2010;120(11):4129–4140. doi:10.11172/JCI41732。

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文章来自临床研究杂志由以下人员提供美国临床研究学会