大鼠胆管结扎后的细胞增殖和癌基因表达：胆管细胞特异性生长效应的证据

摘要

大鼠胆管结扎增殖反应的动力学和形态学特征^1——5以及70%的肝切除术^6——8已被广泛研究。假设这两种反应模式反映了不同的机制，我们比较了两种实验模型中的变化，包括癌基因表达的变化。结果证实了我们的假设，并显示了整个肝脏对任何部分损伤的反应都具有不可思议的协调性。

材料和方法

外科手术

手术在上午8点至10点之间进行，采用40 mg/kg奈米他丁麻醉，腹腔注射。

暂时性胆道梗阻

分离总胆管并在最低支流下方1 cm处横断，注意不要损坏胰管。然后对近端和远端导管末端进行插管，并通过硅胶管环（内径0.28mm；外径0.61mm）连接。环通过腹壁外穿，并用两条6-0丝线固定。用6-0号丝线将外引流管的中央部分捆扎，造成完全梗阻，0至48小时后通过结扎缓解了梗阻，恢复了通过外引流管进入远端导管的自由胆汁流。48小时后处死动物进行组织收集。

永久性总胆管梗阻

在相同的解剖后，用Accatino等人使用的相同技术结扎和横断共同导管。²

区域性胆道梗阻

右外侧叶、右内侧叶、左内侧叶和尾状叶的胆管分支被双重结扎和分开，左叶的胆管引流完好无损(图1)，约占大鼠肝质量的40%。亚甲基蓝注射证实阻塞和非阻塞叶之间没有导管交叉沟通(图2). 2天后将动物处死以收集组织。

在单独的窗口中打开

图1

区域性胆道梗阻程序，可用于研究大鼠阻塞性和非阻塞性肝脏。排出的非胆汁淤积部分约占肝脏重量的40%。

在单独的窗口中打开

图2

在胆总管内注射亚甲蓝证明阻塞叶和非阻塞叶之间缺乏导管交叉沟通。右叶受阻，左叶未受阻。

局部胆管梗阻加免疫抑制

环孢霉素和FK 506已被证明能增强部分肝切除术后的再生^9——11门腔静脉分流术。^11——13这些肝营养作用的机制尚不清楚。然而，它们可能是通过非实质细胞（NPC）的免疫调节。因此，进行了与刚才描述的完全相同的实验，除了在手术前用环孢菌素（口服10mg/kg/天）或FK 506（肌肉注射1mg/kg/天）预处理大鼠4天和手术后的前2天。

部分肝切除术

70%的肝部分切除术（PH）是按照希金斯和安德森的描述进行的。¹⁴30只动物（每组3只）接受70%的PH，并在12、24、36、48小时和3、4、5、6、7和8天后被处死。

假手术

20只对照大鼠仅行剖腹术。手术后0小时和48小时分别杀死10只和10只动物。

实验设计

这些组总结在表1本质上，定义了对总胆管梗阻的增殖和基因表达反应（第3组）以及引起这些反应所需的梗阻持续时间（第2组）。此外，在未经治疗的动物（第4组）和免疫抑制动物（第5组）中，测定了肝叶胆道梗阻对肝脏阻塞部分和引流部分的影响。将结果与假手术后大鼠（第1组和特定对照组）和70%肝切除后的结果进行比较（第6组）。

统计分析

使用IBM（Danbury，CT）PC上提供的双向ANOVA（Epistat软件）进行统计分析，并假设只有在P（P）< .05. 数据表示为（M±SD）。

结果

总胆管梗阻

标准组织病理学

假手术大鼠的肝脏正常。胆道梗阻的肝脏在2天时在门静脉区域有少量炎性细胞浸润。到第7天，有强烈增殖和新胆管形成的迹象(图3)据报道，它们被连接一些门静脉区域的纤细纤维结缔组织所包围。^1——5,28.²⁹假手术肝脏中的增生导管以及正常导管和小导管对细胞角蛋白19呈阳性，而肝细胞始终呈阴性（数据未显示），如Alpini等人所报道。^23,24

在单独的窗口中打开

图3

胆总管结扎后7天大鼠肝脏。胆管和非实质性肝细胞的增殖，在门脉区域之间形成桥接。（三色染色；原始放大倍数×100）

DNA合成

DNA合成在24小时开始增加，2天后达到最大值，到第6天几乎降至基线水平(图4).

在单独的窗口中打开

图4

总胆管梗阻后连续几天的DNA合成（平均值±SD）（每个时间点5只大鼠）。*第页<.005 VS.0时间控制。

BrdU公司

在核标记的BrdU阳性细胞中，DNA合成增加主要是导管细胞增殖的反映，而不是肝细胞的反映(图5). 在第3组的动物中，17%的胆管细胞在第2天反应高峰时被标记，而在开始时为1%。在这些肝脏的肝细胞中观察到较小的反应，2天后达到4.8%(图6，顶部面板）。

在单独的窗口中打开

图5

大鼠肝结扎胆总管后6天。增殖胆管上皮细胞（环状）和肝细胞中的BrdU掺入。（用BrdU抗体和苏木精进行免疫染色；原始放大倍数×400。）

在单独的窗口中打开

图6

总胆管梗阻（上部）和70%肝切除术（下部）后连续时间用BrdU标记的肝细胞和胆管细胞的百分比（平均值±SD）（n=3只大鼠每个时间点）。控制值（0次）是五只假手术大鼠的平均值*P（P）<0.005与假对照组†P（P）<.005 vs.同一时间点PH大鼠的值。

这些结果与70%PH值下的结果显著不同(图6，下部面板）。对于PH，胆管反应也会迅速发生，但与胆管梗阻（BDO）相比，它的寿命很短。此外，BrdU阳性肝细胞的百分比是BDO后的5倍以上(图6).

阻塞所需时间

在第2组动物中，胆道梗阻12小时甚至24小时都不会导致第2天处死时肝脏中BrdU阳性细胞的显著增加。然而，如果梗阻36小时后症状缓解，或在整个实验48小时内持续梗阻，导管细胞增殖（>15%）与第3组动物中的导管细胞增殖相似(图7).

在单独的窗口中打开

图7

不同持续时间的总胆道梗阻对2天处死动物（n=5只大鼠，每个时间点）导管细胞BrdU核标记百分比的影响（平均值±SD）。*P（P）<0.005 vs.时间0时的值。

基因表达

BDO后肝脏基因表达与70%PH后不同，且差异具有生理相关性。前48小时BDO最典型的特征是TGF缺乏表达α凝血酶原基因表达弱且延迟，但迅速出现c-erb基因-B2信使RNA。相反，对PH的典型反应是TGF的强烈表达α和凝血酶原12小时，但没有出现c-erb-B2信使RNA。

TGF基本上没有增加α是一种有效的肝细胞有丝分裂原，在BDO后48小时内可检测到DNA合成最大，而TGFαPH值后显著增加(图8). 标高升高c-erb-B2是一个与胆管癌相关的癌基因，²⁷在BDO后48至96小时内表达清晰，但仅在PH后72小时出现(图9).c-raf、，与PH后肝细胞增殖相关的原癌基因，²⁶还有胆管癌，²⁷BDO后48至96小时显著增加，而PH后轻微检测到(图9). 有趣的是，肝细胞特异性凝血酶原基因的表达在PH后DNA合成和有丝分裂增加期间增强，而在BDO后没有增强(图10). TGF公司-βPH和BDO后1信使RNA表达相似(图11)与之前报道的PH相似。⁶

在单独的窗口中打开

图8

PH和BDO后不同时间大鼠肝脏RNA的Northern blot分析，并与TGF探针杂交α或亲环素（每个时间点3只大鼠）。

在单独的窗口中打开

图9

PH或BDO后不同时间大鼠肝脏RNA的Northern blot分析，并与探针杂交c-raf公司或c-erb-B2、。

在单独的窗口中打开

图10

在PH和BDO后不同时间对大鼠肝脏RNA进行Northern blot分析，并与凝血酶原探针杂交。

在单独的窗口中打开

图11

PH和BDO后不同时间大鼠肝脏RNA的Northern印迹分析，并与转化生长因子探针杂交-β1

区域性胆道梗阻

标准组织病理学

第4组大鼠阻塞的肝叶在第7天出现与第3组完全阻塞的肝相似的早期变化，包括炎症细胞的出现(表2). 自由引流的左叶有正常数量的炎性细胞，但有显著的增殖和新导管的形成。

表2

大鼠局部胆管结扎术后7天，假手术和引流与非引流肝叶的炎症细胞浸润门脉

	假鼠肺	胆汁淤积性肺叶	非胆汁淤积性肺叶
中性白细胞	0.17 ± 0.03	3.98 ± 2.5*	0.28 ± 0.1
巨噬细胞	7.2 ± 3.0	22.7 ± 6.8*	8.9 ± 3.5
淋巴细胞	0.6 ± 0.4	1.4 ± 0.8	0.9 ± 0.5

在单独的窗口中打开

注：。值M±SD是0.02 mm范围内观察到的炎性细胞数²门户区域的。

^*与假叶和非阻塞性叶显著不同，P（P）< .05.

DNA合成

在48小时时，也就是前面描述的全部双侧阻塞实验中出现最大增殖反应的时间，阻塞的肺叶与自由引流的肺叶相比，DNA合成显著且几乎同样升高(图12). 这两个部位的DNA反应量都不到总胆道梗阻引起的反应量的一半。

在单独的窗口中打开

图12

区域性胆道树梗阻大鼠结扎和非结扎肝叶的DNA合成（平均值±SD）（实验棒组10只大鼠，对照组5只）*P（P）<0.005与对照组。

BrdU公司

在第3组的总胆道梗阻实验中，主要的增殖反应是导管细胞的增殖反应。无论是阻塞的肺叶还是自由引流的肺叶都是如此(图13). 有趣的是，肝细胞增殖增加仅发生在阻塞的肺叶。在排水的肺叶中，肝细胞的增殖可以忽略不计，尽管明显多于混杂操作的对照组(图13).

在单独的窗口中打开

图13

区域性胆管结扎48小时后结扎大鼠肝叶。增殖胆管上皮细胞和肝细胞中的BrdU掺入*P（P）<0.05 vs.假手术大鼠肝细胞。**P（P）<.01 VS.未结扎叶中的肝细胞。（含有BrdU抗体和苏木精的lmunostain；原始放大倍数×400。）

添加免疫抑制

环孢菌素和FK506的术前和术后治疗对结果没有显著影响（数据未显示）。

讨论

近二十年来，关于越来越多的肝脏生长因子的文献积累迅速。^6——8,30然而，这些信息还没有被综合成一个普遍接受的肝脏再生的解释。由于肝细胞、胆管细胞和NPC的增殖动力学顺序不同，³¹一个合理的暗示是，它们是可变的交叉监管。NPC一直是这种角色的特别有吸引力的候选人。^32——36

胆道梗阻模型有助于肝脏导管细胞成分的增殖研究。这些细胞约占总肝质量的30%。以前的研究已经确定了导管阻塞的形态学后果，包括明显的导管增生、适度的肝细胞增殖反应和炎性细胞浸润。^{1——5,23,24}这些发现在结扎共同导管后的大鼠肝脏和选择性阻塞的肝叶中得到证实。导管细胞和肝细胞增殖反应不是同时发生的，但它们在时间上密切相关。这些与70%肝部分切除术后的变化进行比较。

在PH条件下，导管细胞和肝细胞均积极参与再生，肝细胞反应峰值出现在24小时，导管细胞仅稍落后。根据DNA合成的定义，BDO或区域BDO的全球增殖反应与PH相似，只是其峰值在2天而不是1天，恢复到基线的速度较慢。然而，PH和BDO模型之间的差异不仅仅是暂时的。细胞标记研究表明，胆道梗阻后DNA合成增加的大部分发生在导管细胞中，肝细胞的贡献很小。BDO模型中所需的刺激是障碍物持续一天以上。阻断24小时或更短时间在死亡2天时没有显著影响。

有人提出假设来解释人类和动物中增生性导管细胞对胆道梗阻的反应。排除存在多潜能（卵形）干细胞的可能性，³⁷这些可分为两大类。在这些通用替代方案中，Slott等人⁴提示增生的肝细胞能够侵入梗阻胆管的基底膜，在上皮细胞中定居，并在那里分化为胆管细胞的表型特征。我们的实验没有支持这个概念。相反，完全阻塞的肝脏的主要增殖反应是导管细胞，肝细胞是相对较小的参与者。区域性胆道梗阻实验中的观察结果对异位肝细胞假说的破坏性更大。图中，表面上健康的自由引流叶中的导管细胞增殖与结扎导管的叶中的细胞增殖程度相同。在引流叶和胆汁淤积叶中，静息的肝细胞反应（阻塞叶中稍大）可能是对导管结扎所致单侧损伤的部分梗阻的反应。这种对部分梗阻的反应仅为整个胆道系统被阻塞时所引起反应的一半左右，而对实质的损害相对较小。

在另一个解释胆道梗阻后导管增生的一般假设中，Buyssens³³提出了脂氧合酶途径NPC副产物的促进或调节作用，³⁴对多形核白细胞具有趋化作用并激活其^30,31以及多种细胞因子。这种机制的组织病理学基础是明显的，因为在阻塞的肝组织中存在显著的白细胞炎症反应，似乎包括多个NPC谱系，无论是整个器官还是仅部分器官。然而，在部分梗阻实验中，自由引流叶中的导管细胞增殖旺盛，没有明显的炎症反应，这表明NPC的局部存在不是刺激导管细胞增生的直接旁分泌需要，同时也不排除来自对侧白细胞的细胞因子通过体液传播的影响。这些具有免疫功能的NPC在导管结扎后事件中的作用仍有待确定。尽管T细胞导向药物环孢素和FK 506都能增强肝切除术相关的增殖^9——11还有Eck的瘘管，^11-13这些免疫抑制剂不影响局部胆道梗阻后再生的结果。如果干细胞真的存在，³⁷它可以被这种范式所适应。

无论是否与免疫成分有关，区域性胆道梗阻实验表明，肝脏的一部分与另一部分之间存在智能交流。以前在辅助性肝移植模型中已经注意到这一点³⁸在“双肝”制剂中，一个肝片段具有生理优势，例如富含肝营养因子的内脏静脉血。³⁹在这种情况下，“不利”肝脏或碎片的增殖增加，但从长远来看，与有利肝组织的代偿性增生和肥大相比，这是轻微的。^40——42共存肝脏或肝碎片之间的协同调节导致受损肝碎片最终萎缩，健康肝碎片再生，并维持原有的总肝块，这也是众所周知的动物肺叶导管结扎数周或数月后的结果^28,43和人类。^44——46

在区域性导管结扎实验中，肝脏碎片之间的串扰具有明显的特异性。在这里，对肝脏一部分导管细胞的急性原发性损伤被及时察觉，并通过受影响肝脏和未受影响肝脏的导管细胞增生作出反应。这种结果可能反映出一种来自刺激物的独特体液传递信号，例如但不限于导管内静水压增加，^三——5炎症细胞在其中起中介作用。另外，也不能排除除细胞因子外，还有其他独立且高度特异的生长因子控制导管细胞再生的可能性。

所研究的四种生长因子信使RNA表达的分离是引人注目的，并且与生理终点相关。TGF的完全缺失α在对BDO的整体DNA反应基本上与PH值为70%的动物相同，但具有不同的时间和细胞靶向特征的动物中，表达显著。早期表达c-erb-B2仅与BDO相关，因为该癌基因与梗阻性胆管癌相关。²⁷在其他导管特异性疾病的活检标本中对该癌基因进行系统研究是值得的。此外，重要的是确定BDO引起的更完整的基因激活范围，如PH后所示，BDO可能被证明是多重的。⁴⁷

致谢

缩写

工具书类