肌萎缩侧索硬化相关蛋白TDP-43和FUS/TLS在共同调节HDAC6 mRNA的常见生化复合物中的功能^*

蛋白质分析

如所述制备HEK 293T、NSC-34和HeLa细胞提取物(19). 将含有～1 mg蛋白质的提取物与1μg抗体在4°C下免疫沉淀16 h，并轻轻倒置混合，然后添加蛋白质A-Sepharose 1 h。收集小球并用裂解缓冲液洗涤四次，用TDP-43（ProteinTech，17892-1（C端）和10782-2（N端））、FUS/TLS（Abcam，ab23439（兔子））抗体通过SDS-PAGE和免疫印迹分析免疫沉淀蛋白；和Santa Cruz，sc-47711（鼠标）），以及PABP2（Abcam，ab81224）。通过将FUS/TLS基因（开放生物系统，MHS1011–59311）插入pGEX-5X-2，生成表达GST-FUS/TLS的质粒载体。HA-TDP-43表达质粒如前所述(19). GST融合蛋白与谷胱甘肽-脑葡萄糖4B珠（GE Healthcare）在4°C下孵育1小时。根据制造商的说明进行GST融合蛋白的结合、洗涤和洗脱。对于GST下拉实验，用编码HA-TDP-43表达质粒的质粒DNA转染HEK 293T细胞。转染后24小时，用裂解缓冲液提取细胞颗粒，并用GST或GST-FUS/TLS融合蛋白（20μg）孵育每个澄清提取物500μg，该融合蛋白已预先结合到谷胱甘肽-脑葡萄糖4B颗粒。在4°C下倒置混合4h后，用裂解缓冲液洗涤珠子五次，并在1×SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸，然后进行SDS-PAGE/免疫印迹分析。用于凝胶过滤分析，从10⁷通过0.4μm过滤器过滤HeLa、小鼠胚胎成纤维细胞和NSC-34细胞，并使用快速蛋白液相色谱法（LLC-501 Plus；GE Healthcare）通过Superose 6柱分离。收集1毫升柱馏分，使用10%SDS-PAGE分离，并使用α-TDP-43、α-FUS/TLS、α-PABP2、α-RNA PolII和α-MCM3抗体进行免疫印迹分析。ProtTech Inc.使用质谱仪分析TDP-43相互作用蛋白，威斯康星大学生物技术中心使用Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL质谱仪分析了TDP-43亚复合物的完整蛋白质剖面。

定量RT-PCR和RNA免疫沉淀（RIP）

根据制造商的方案，使用RNeasy试剂盒（Qiagen）制备总RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）通过逆转录从1μg总RNA生成cDNA。2%的合成cDNA反应在MyiQ实时PCR（Bio-Rad）中与FastStart DNA大师SYBR Green I（罗氏应用科学）发生反应。基因特异性引物为：HDAC6 mRNA的5′-TTAGGCCTCCTGGACATCAC-3′（HDAC6-F1）、5′-GCGGTGATGGAAATAGA-3′（HDAC 6-R1）、5’-CGACGTAAACTCCTC-3′（HDAC6-F2）和5′-ATCAGACTCTCTCTCT-3′（hdAC 6-R2）。对于RIP，HEK 293T细胞在冰镇PBS中洗涤和收获，并在低渗温和溶解缓冲液（10 m）中溶解米Tris-HCl，pH 7.5，10米米氯化钠，2米米EDTA、0.5%Triton X-100、RNasin和蛋白酶抑制剂）。将细胞在冰上培养10分钟，并添加氯化钠至150 m米在冰上孵育5分钟后，将细胞以14000rpm离心15分钟。将细胞裂解物与α-TDP-43、α-FUS/TLS、α-兔IgG和α-小鼠IgG抗体在4°C下免疫沉淀过夜。RIP部分用洗涤缓冲液（50 m）洗涤五次米Tris-HCl，pH 7.5，150米米氯化钠和0.05%Triton X-100）。用SDS洗脱缓冲液（50 m）洗脱RNA米三氯化氢，pH 7.0，10 m米EDTA和1.3%SDS），并根据制造商的说明使用三唑（Invitrogen）进行纯化。用定量RT-PCR分析RIP中分离的RNA。结果表示为与正常兔IgG对照相比，靶沉淀的相对富集倍数。HDAC6引物5′-ACGGTCCTCTTCACCTTCTCT-3′（3′-UTR-F）和5′-CTTTCTGGGCTGTAGTGG-3′（3’-UTR-R）用于定量PCR。

TDP-43富含甘氨酸和RRM2域有助于FUS/TLS结合

构建了一组HA标记的TDP-43 C端和N端缺失突变体，以确定在GST-FUS/TLS下拉分析中需要哪些结构域与FUS/TTLS结合(图2A类). TDP-43的C端114个氨基酸的缺失对GST-FUS/TLS结合没有影响，而C端157个氨基酸（包括整个富含Gly的结构域）的缺失消融了与GST-FUS/TLS的结合在体外(图2B类). 关于N末端TDP-43缺失突变体，我们发现TDP-43NΔ2缺乏氨基酸1–169，但保留RRM2和富含Gly的结构域，与GST-FUS/TLS保持关联(图2C). 另一方面，缺乏RRM2的TDP-43NΔ3突变体未能与GST-FUS/TLS相互作用在体外(图2C). 这些结果表明，C末端富含Gly和RRM2结构域对与FUS/TLS的相互作用很重要。

在单独的窗口中打开

图2。

TDP-43富含Gly和RRM2结构域有助于FUS/TLS结合。 A类，GST-FUS/TLS下拉分析中使用的TDP-43缺失突变体的棒状图。B类，使用TDP-43的C末端缺失突变体进行GST-FUS/TLS下拉分析。HA-标记的野生型TDP-43或TDP-43缺失突变体在HEK 293T细胞中表达，并将细胞裂解液与与谷胱甘肽-Sepharose 4B珠结合的GST或GST-FUS/TLS蛋白孵育。结合蛋白用SDS-PAGE分离，并用α-GST和α-HA抗体进行免疫印迹分析。C，FUS/TLS与N末端TDP-43截断突变体的相互作用。所示TDP-43 N末端截断突变体在HEK 293T细胞中表达，并在GST下拉分析中测试与GST-FUS/TLS的相互作用。这些发现表明，TDP-43的170–414个氨基酸区域足以与GST-FUS/TLS结合体外试验。血管内皮细胞，矢量；重量，野生型。

我们还比较了HA标记野生型TDP-43和四个ALS相关TDP-43突变体（D169G、A315T、M337V和R361S）的FUS/TLS结合谱。在相互免疫共沉淀实验中，野生型和突变型TDP-43蛋白与FUS/TLS的相互作用程度相似(图3,A类和B类)和GST-FUS/TLS下拉测定(图3C)表明ALS突变不会显著改变TDP-43-FUS/TLS相互作用。

在单独的窗口中打开

图3。

野生型和ALS相关TDP-43突变体与FUS/TLS的相互作用相似。 A类共免疫沉淀法。用HA标记的野生型TDP-43或ALS相关的TDP-43突变体转染HeLa细胞。用α-HA免疫沉淀野生型和突变型HA-TDP-43蛋白。用α-HA和α-FUS/TLS抗体进行免疫印迹分析IP组分。B类互惠免疫沉淀法。用编码HA标记的野生型TDP-43或ALS相关TDP-43突变体的质粒转染HeLa细胞，并用α-FUS/TLS抗体免疫沉淀细胞提取物。用α-HA和α-FUS/TLS抗体进行免疫印迹分析IP组分。C，GST-FUS/TLS拉下ALS-相关TDP-43突变体。在BL 21细胞中诱导GST和GST-FUS/TLS，并使用谷胱甘肽-脑葡萄糖4B珠纯化。HA标记的野生型TDP-43或TDP-43的ALS相关突变体在HEK 293T细胞中表达，相应的细胞提取物与GST或GST-FUS/TLS孵育。亲和纯化蛋白用10%SDS-PAGE分离，并用α-GST和α-HA抗体进行Western blotting分析。血管内皮细胞，向量。

凝胶过滤显示两种TDP-43复合物

基于联合免疫沉淀研究结果，我们希望确定PABP2和FUS/TLS是否在一个共同的复合物中与TDP-43相互作用。在HeLa细胞提取物的凝胶过滤色谱中，TDP-43表现出非均相迁移模式；然而，观察到TDP-43的两个主要洗脱峰(图4A类). TDP-43免疫反应的第一个峰值，表示为TDP-43-Large（TDP-43L），在柱空腔容积后立即观察到，以500-kDa MCM（微小染色体维持）复合体为参考，估计其大小为～1–3 MDa。还观察到第二个TDP-43洗脱峰，估计大小为～300–400 kDa，并指定为TDP-43-Small（TDP-43S）。

在单独的窗口中打开

图4。

TDP-43和FUS/TLS复合物的凝胶过滤分析。 A类对HeLa全细胞提取物中的TDP-43、FUS/TLS、PABP2、RNA PolII和MCM3进行凝胶过滤分析。使用Superose 6对HeLa提取物进行分级，并用所示抗体进行免疫印迹。显示了TDP-43L和TDP-43S复合体的大致位置。B类，TDP-43L复合物依赖于RNA。HeLa提取物用RNase A或载体处理，通过凝胶过滤进行解析，并用α-TDP-43、α-PABP2和α-RNA PolII抗体进行分析。

FUS/TLS在HeLa细胞中的凝胶过滤曲线比TDP-43更均匀，几乎所有FUS/TTLS都在几个与TDP-43S广泛重叠的部分中洗脱(图4A类). 另一方面，PABP2与TDP-43L而非TDP-43S共分馏，表明其与TDP-43的相互作用发生在更大的复合物中。最后，我们发现RNA PolII在TDP-43L和TDP-43S之间洗脱，表明它没有与TDP-43或FUS/TLS形成稳定的复合物。这些发现表明，TDP-43存在于HeLa细胞中的两种复合物中：一种是含有PABP2的大型TDP-43L复合物，另一种是与FUS/TLS广泛重叠的较小TDP-43S复合物。

TDP-43L的大尺寸及其与PABP的共分馏表明它可能代表RNP颗粒。为了验证这一观点，我们比较了RNase处理的TDP-43的凝胶过滤特性与未经处理的细胞。核糖核酸酶处理强烈右移了TDP-43和PABP2洗脱曲线，使得TDP-43的整个细胞池几乎都存在于对应于TDP-43S的部分中(图4B类). 相反，RNase处理后，RNA PolII洗脱图谱没有改变(图4B类). 这一发现表明TDP-43L是一种稳定的RNP复合体，而TDP-43S不是。

为了进一步证实TDP-43L是一种RNP，我们用α-TDP-43抗体免疫沉淀合并的TDP-43L组分，并使用质谱法进行蛋白质分析。许多核糖体蛋白、RNA-结合蛋白和翻译因子被鉴定为TDP-43L复合物中的TDP-43相互作用蛋白(补充表S1). 这些结果强烈支持TDP-43L复合物本质上是RNP的观点。最后，为了测试ALS-相关TDP-43突变体的复合物形成特性，我们比较了HA标记野生型TDP-43和四个ALS-关联TDP-43变异体（D169G、A315T、M337V和R361S）的凝胶过滤特性。野生型和突变型TDP-43蛋白的柱洗脱图谱没有明显差异，这表明突变型TDP43蛋白的复合物形成潜力基本上是完整的(补充图S3).

TDP-43L复合物中不包括TDP-43片段

在细胞培养和退化的ALS脊髓运动神经元中，TDP-43被切割成25和35-kDa的C末端片段(4,33,34). 据推测，这些聚集蛋白导向的TDP-43裂解片段是TDP-43依赖性神经病理学的重要决定因素(34). 为了确定TDP-43片段的复合形成特性，我们使用更长的放射自显影曝光时间进行了额外的凝胶过滤操作，以可视化稀少的TDP-43物种。该分析表明，35-kDa TDP-43免疫反应双链，命名为p35^TDP-43型，与TDP-43S共洗脱，但不与TDP-43 L共洗脱(图5A类). 为了验证这一发现，并确定TDP-43免疫反应片段是否对应于TDP-43的N端或C端区域，用针对TDP-43 C端154个氨基酸产生的抗体对HeLa凝胶过滤部分进行免疫印迹。这些抗体也能识别p35^TDP-43型与FUS/TLS共分馏的双组分(补充图S4). 此外，用TDP-43 siRNA转染HeLa细胞或HEK 293T细胞可消除35-kDa免疫反应带。这一发现强烈表明它是一种真诚地TDP-43片段(补充图S5).

在单独的窗口中打开

图5。

35-kDa TDP-43片段被排除在TDP-43L复合物之外。 A类TDP-43和p35的免疫沉淀^TDP-43型来自混合凝胶过滤部分。用IgG或α-TDP-43抗体免疫沉淀TDP-43L（组分2-4）和TDP-43S（组分10-12），并用α-TDP-4抗体免疫印迹。B类、FUS/TLS联合免疫沉淀与全长TDP-43和p35^TDP-43型凝胶过滤部分10–12（TDP-43S）用α-FUS/TLS和α-小鼠IgG抗体进行免疫沉淀，免疫沉淀部分用α-TDP-43和α-FUS/TLS抗体进行免疫印迹分析。

为了确定使用HeLa细胞提取物所得结果的普遍性，我们检测了小鼠胚胎成纤维细胞和NSC-34细胞中TDP-43和FUS/TLS的凝胶过滤谱，这些细胞来源于小鼠运动神经元与神经母细胞瘤细胞的融合。在两种细胞系中p35^TDP-43型碎片被发现与TDP-43S复合物共分馏，并被排除在TDP-43L复合物之外(补充图S6). 虽然小鼠胚胎成纤维细胞和NSC-34细胞的结果大体上重现了HeLa细胞的结果，但我们观察到在高分子量复合物中FUS/TLS的比例更大(补充图S6). 后一发现表明FUS/TLS复合物中可能存在细胞类型依赖性差异；然而，在所有测试的细胞系中，TDP-43片段始终被排除在TDP-43L RNP复合物之外。

为了更明确地显示第35页^TDP-43型与TDP-43S而非TDP-43L共同分馏，我们合并了含有TDP-43L的HeLa凝胶过滤馏分(2,–4)或TDP-43S(10,–12)并用α-TDP-43抗体进行联合免疫沉淀实验。全长TDP-43和p35^TDP-43型用含有TDP-43S的组分中的α-TDP-43抗体进行免疫沉淀，而只有全长TDP-43从含TDP-43L的组分进行免疫沉淀(图5A类). 这一发现与p35的概念一致^TDP-43型基本上不包括在TDP-43L复合物中。

为了确定内源性生成的TDP-43片段是否保留与FUS/TLS相关的能力，我们用α-FUS/TLS抗体免疫沉淀合并的TDP-43S片段，并检测TDP-43和p35的存在^TDP-43型我们发现全长TDP-43和p35^TDP-43型在含有TDP-43S的组分的α-FUS/TLS IP中检测到(图5B类). 这些发现表明，内源性TDP-43和FUS/TLS在TDP-43S复合物的背景下相互作用，并且内源性表达片段保留与FUS/TTLS结合的能力。

细胞溶胶和核TDP-43复合物的分析

TDP-43和FUS/TLS主要是核蛋白；然而，细胞溶质定位模式也有报道。因此，我们试图确定TDP-43L、TDP-43S和FUS/TLS复合物是否在核或细胞溶质中富集。凝胶过滤显示出一个普遍趋势，即HeLa核组分在含TDP-43S的络合物中富集，而TDP-43L络合物在胞浆中富集(图6,B类和C). 第35页^TDP-43型用TDP-43S洗脱细胞溶质和核部分。有趣的是，大多数FUS/TLS与核TDP-43S复合物共分馏；然而，在与TDP-43L重叠的高分子量细胞溶质复合物中也观察到FUS/TLS(图6,B类和C). 这些发现表明，TDP-43S和TDP-43L复合物分别位于细胞核和细胞质之间。

在单独的窗口中打开

图6。

TDP-43S复合物在细胞核中富集。 A类，全长TDP-43，p35的凝胶过滤分析^TDP-43型和来自HeLa全细胞提取物的FUS/TLS。使用Superose 6对HeLa提取物进行分级，并用α-TDP-43和α-FUS/TLS抗体进行免疫印迹。显示了TDP-43L和TDP-43S复合体的大致位置。B类，TDP-43，p35的凝胶过滤分析^TDP-43型和来自HeLa细胞胞质部分的FUS/TLS。C，TDP-43凝胶过滤分析，p35^TDP-43型和来自HeLa细胞核组分的FUS/TLS。