腺相关病毒制造过程中功能载体的高效血清型依赖性释放

摘要

介绍

A类非相关病毒（AAV）和基于它们的载体是包含单链DNA基因组的二十面体20-nm衣壳。病毒复制的特点是存在一个潜伏期，只有在与辅助性腺病毒或疱疹病毒（伯尔尼和帕里什，2007). 与大多数其他非隐匿病毒一样，AAV也不知道从受感染细胞中有主动的出口途径（Smith和Enquist，2002). 此外，它们不产生细胞病变作用（CPE）（Berns和Parrish，2007). 因此病毒从细胞中的释放被认为依赖于辅助病毒感染引起的CPE（Smith和Enquist，2002).

几乎所有关于AAV载体的早期研究都使用来自AAV血清型2（AAV2）的衣壳。这些研究证明了该载体平台的潜力，并为体内Leber's先天性黑蒙（Bainbridge）患者的基因治疗等。,2008; 豪斯沃思等。,2008; 马圭尔等。,2008). 基于其他天然AAV血清型的载体显示出不同的组织倾向体内在转导效率方面提高了性能，与体液和/或细胞免疫相关的问题更少（范登伯格等。,2006,2009; 卡尔塞多等。,2009).

已优化了几种大规模生产AAV的方法，以获得高滴度和高质量的载体。然而，进一步提高该过程的效率和简单性对于满足未来临床应用的需求仍然很重要。许多方案都从细胞裂解液中纯化载体颗粒，因此需要进行广泛的下游纯化。这些方法是使用基于AAV2的载体开发的。在这里，我们报告了基于非AAV2血清型的载体在短暂转染人类胚胎肾293（HEK293）细胞后被有效释放到培养基中。从上清液而不是细胞裂解液中采集的选择应大大简化AAV载体的下游处理，以用于研究和临床应用。

材料和方法

结果

我们评估了转染到AAV1、2、5、6、7、8和9以及rh32.33衣壳中AAV2反向末端重复序列（ITR）侧翼基因组的HEK293细胞培养物中的载体粒子分布。转染72小时后，分别从细胞组分中收集细胞培养液。收获时，在有或无10%胎牛血清的情况下培养细胞。用定量PCR（qPCR）检测到的抗DNA酶载体基因组拷贝来衡量载体总产量，随着载体衣壳血清型和培养条件的变化，其变化幅度高达10倍(图1). AAV2和AAV6的总颗粒产率最低，特别是在没有血清的情况下。在有无血清的情况下，AAV7、AAV8、AAV9和rh32.33的颗粒产量最高。有趣的是，AAV5只有在没有血清的情况下才能产生高产量。

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图1。

载体生产培养中依赖血清型的颗粒分布。在CaCl转染72小时后，通过定量PCR评估小规模生产培养物“细胞”和“培养基”组分中DNA抗性载体基因组的载体颗粒分布₂方法，然后在无胎牛血清或有胎牛血清的情况下培养。列表示矢量的总产量n个 = 3种制剂，并根据从培养基中检索到的载体与细胞组分的比例对色谱柱进行细分。GC，基因组拷贝。

尽管相对比例不同，但在培养基中发现了大量的所有载体血清型的完整颗粒(图1). AAV2始终在培养基中提供最少的粒子，无论是绝对数量还是与总产量的比例。在没有血清的情况下生产AAV2载体可将总颗粒产率降低61%，并将上清液中颗粒的比例从有血清的20%降低到没有血清的9%。AAV6的表现类似，但释放到上清液中的载体颗粒相对较多。在没有血清的情况下，AAV6总颗粒产率降低80%；在有血清的培养基中发现88%的颗粒，68%的颗粒没有血清。除AAV2和AAV5外，所有血清型的大多数载体颗粒都存在于上清液中。在有血清培养的AAV9比例为51%，在有或无血清的情况下，AAV8和rh32.33的比例超过85%。除AAV5外，在载体生产期间，在培养基中加入血清不会显著影响相对粒子分布。

AAV2和AAV6的产量较低，加上在无血清的情况下产量和上清液释放量降低，促使我们继续假设衣壳的肝素亲和力可能会影响其释放到上清液中。众所周知，AAV2和AAV6颗粒与肝素有亲和力，尽管这种相互作用由不同的结构决定因素和机制定义（萨默福德和萨穆斯基，1998; 哈尔伯特等。,2001). 我们使用AAV2、AAV8和AAV6的变体来进一步研究肝素亲和力对AAV生产培养物中载体产量和分布的影响(图2). 将AAV2 585RGNR的肝素结合基序消融为SGNT（AAV2HSPG-）确实导致总产量显著增加，这在很大程度上归因于颗粒释放到介质中（Vandenberghe等。,2006). 相反，在AAV8（AAV8RQNR）上添加富含精氨酸的基序（Vandenberghe等。,2006)导致产生了一种结合肝素的AAV8颗粒，该颗粒几乎完全保留在细胞部分中，并显著降低了颗粒产率。在AAV2情况下，也观察到滴度降低与颗粒的肝素亲和力相关，尽管没有在AAV8中观察到的那样明显，因为添加富含精氨酸的肝素结合基序使总产率降低了近100倍。保留在细胞中的肝素结合AAV产量也较低，这可能是由于载体释放到培养基中阻止发生细胞内饱和效应。肝素结合对颗粒释放到培养基中的影响在一定程度上得到了用野生型AAV6和突变体AAV6.1包装的载体的类似结果的支持，野生型AAV6的衣壳结合肝素，突变体AAV6.1由于VP3蛋白上的单个氨基酸变化K531E而结合肝素的效果较差（Wu等。,2006; 范登伯格等。,2009). 突变株的颗粒产量约为野生型AAV6产量的10倍，培养基中颗粒的比例显著增加，尽管没有我们看到的AAV2HSPG-(图2).

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图2。

AAV载体产量和分布对衣壳-肝素亲和力的依赖性。使用AAV2、AAV8、AAV6小规模生产培养物的“细胞”、“洗涤”和“培养基”组分中的物理载体颗粒，以及通过DNA抗性载体基因组的定量PCR变异体进行测量。将三个组分中每个组分的相对颗粒含量归一化为总产率，即所有组分中总颗粒的总和，为分析设定为100%。感染性微粒的总产量通过在三个组分中添加终点稀释滴定检测到的感染性微粒来计算。三个产品的平均值用标准偏差表示。GC，基因组拷贝。

用于基因治疗或疫苗实验和试验的载体制剂的生物活性等效性至关重要。我们进行了进一步的实验，以比较根据标准AAV制造程序从细胞裂解液中分离的AAV载体颗粒与从培养液中纯化的颗粒的生物活性。我们在研究体外和体内转导(表1和图3和​和4）。4). 除了用于在CsCl密度梯度离心之前减少培养基收获体积的切向流过滤步骤外，应用于两个培养组分的纯化过程是类似的。在所有研究中，来自上清液和颗粒的载体制剂的纯度至少为70%。

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图3。

体内通过从细胞裂解物和培养液中纯化的AAV载体进行转基因表达。（A）α₁-静脉注射C57BL/6小鼠后血清中抗胰蛋白酶（AAT）转基因产物浓度随时间的变化(n个 = 5） 带10¹¹从细胞或培养液中纯化的AAV1、AAV8和AAV9载体颗粒；（B）载体注射后35天，肝脏和心脏组织中GFP的表达。

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图4。

从细胞裂解物和培养基纯化的AAV载体的免疫原性。基于AAV8和rh32.33的HIV-1编码载体的制备堵住从细胞裂解液和培养液中提纯，以3×10的剂量肌肉注射¹⁰每只老鼠的GC。接种疫苗三周后，用流式细胞术通过MHC-I四聚体结合（Ter/CD8）评估外周血单个核细胞是否存在功能性HIV-1 p24特异性CTL⁺)CD127和CD62L的表达。效应记忆（EM）细胞被鉴定为CD8⁺泰特⁺CD127型^你好CD62L型^洛人口。

测定从两个不同来源分离的AAV的效力体外，根据物理滴度和感染滴度的qPCR测量，确定颗粒感染性（P/I）比率(表1). 进行了感染性试验体外TCID检测HeLa衍生的B50细胞系₅₀决心。对于每种血清型，从细胞裂解物和培养基中纯化的颗粒给出了可比较的P/I值，但AAV9除外，AAV9的感染性降低了2倍体外从培养基中纯化时(表1). 根据提纯前从小型生产材料中获得的先前数据，该批次AAV9在培养基中获得的产量远低于预期(图1)，可能是由于细胞载体与上清液载体纯化过程中的不同技术损失。

我们向雄性C57BL/6小鼠静脉注射了编码双顺反子表达盒的纯化颗粒，其中包括人血清蛋白α₁-抗胰蛋白酶（AAT）基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因。在治疗后的多个时间点，通过ELISA对血清中AAT蛋白水平进行定量，对注射了每种载体的所有动物（无论其来源是什么，即培养基或细胞裂解物）得出了类似的结果(图3A). 来自培养基和细胞裂解物的制剂同样有效。此外，还报道了不同血清型间转基因表达的差异（Vandenberghe等。,2009)在我们的实验中，通过两种来源的载体制备进行了复制。AAV8比AAV9更有效；AAV1的效力远低于AAV8或AAV9(图3A).

由于血清AAT水平不能指示载体转导的组织向性，特别是当载体通过静脉途径全身给药时，我们扩展了我们的实验，以评估体内基因治疗中两个重要治疗组织靶点的转导模式。用直接荧光法检测治疗小鼠的心脏和肝脏组织切片中第二个转基因GFP的表达。观察到的GFP荧光的相对水平和组织分布符合所有三种血清型的预期，并且在使用细胞裂解物和培养液制备的载体制剂后是等效的(图3B). 两种AAV8制剂都优先以小鼠肝脏为靶点，但在心肌细胞中也有中等水平的转导。根据先前的研究结果，两种AAV9制剂均显示出高水平的心脏转导（稻垣祯一等。,2006; 帕察克等。,2006; 万德莱斯等。,2007). 注射AAV1的小鼠组织中观察到有限的GFP荧光，AAV1是一种不能有效转导心脏或肝脏的血清型(图3B).

载体衣壳和转基因产物的适应性免疫反应也可能受到载体生产和纯化过程的修改的影响。我们使用基于携带HIV-1的rh32.33和AAV8的载体评估了这些参数堵住转基因，从细胞裂解物和转染培养物的培养液中纯化。基于AAV.rh32.33的载体已被证明可诱导功能性CD8⁺T细胞对编码的转基因产物的反应，而基于AAV8的载体积极抑制或阻断转基因特异性T细胞反应（J.Lin等。,2007; S.W.林等。,2007; 林等。,2009). 小鼠肌肉内接种3×10¹⁰从任一来源制备的GC产生大致相等的抗原特异性CD8峰值水平⁺T淋巴细胞（CTL），与制备方法无关(图4). 正如预期的那样，两种基于AAVrh32.33的制剂都通过产生一种效应记忆T细胞群而区别开来，而这种T细胞群在所有注射AAV8的小鼠中基本上不存在，这进一步支持了细胞裂解物和培养液制剂的功能等效性。

讨论

AAV已成为一种极具吸引力的基因转移载体。最初，AAV仅被视为治疗性基因治疗的载体，但最近，它作为体细胞转基因研究工具的应用正在取得进展。不幸的是，以所需规模生产纯化的AAV载体体内研究依赖于繁琐、技术含量高、成本高的程序，这些程序通常最好由专业核心设施的合同服务来完成。由于候选载体和/或转基因盒的多种排列必须在研究和临床前研究中进行评估，因此更简单、更通用的AAV载体生产方案将有利于科学界和基因治疗研究人员。对于需要高载体滴度的临床试验，可扩展的制造方法至关重要。

在本文报道的研究中，我们证明基于许多常用AAV血清型的载体在转染培养物的培养基中具有高滴度，并且可以通过采集和浓缩培养液简单地回收。冈田及其同事对AAV8（冈田等。,2009). 根据AAV2的经验，不需要从收获的细胞裂解液中纯化。我们进一步证明，大多数载体可以在无血清的培养液中高产，进一步简化了下游加工和制剂纯化，降低了成本，以及减少对AAV临床产品可能被人畜共患药物污染的担忧，例如与牛海绵状脑病相关的朊病毒药物。在我们的实验中，关键的生物活性，包括转导效率体外和体内从细胞裂解液和培养液中制备的载体与转基因表达引起的组织嗜性和免疫反应等效，但可能有一个例外。颗粒感染率降低体外在上清液制剂中观察到AAV9载体颗粒。这可能反映了细胞释放的AAV9颗粒的一种新的生物学特性。然而，体内我们无法检测到来自细胞和培养液的AAV9载体制剂之间的生物活性差异。

我们的研究结果有助于简化矢量制造协议，有助于AAV矢量在实验室和临床中的应用。从培养基中分离AAV载体的能力降低了必须纯化颗粒的底物的复杂性，并最大限度地减少了处理。AAV是一种非包膜细小病毒，在明显不存在CPE的情况下，在培养基中从细胞中产生载体的过程中是如何释放的，目前尚不清楚。然而，这种释放特性取决于衣壳的血清型和特定聚糖结合亲和力，而不是CaCl的功能₂转染，因为其他转染方法会产生相同的现象（Lock等。,2010). 在这里介绍的实验的基础上，我们现在开发了一种与GMP兼容的中等规模AAV矢量制造工艺，产量可达3×10¹⁴单个10升运行中的颗粒（锁定等。,2010).

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