BAG3直接与Rap1、PDZGEF2的鸟嘌呤核苷酸交换因子结合，调节细胞粘附

摘要

介绍

BAG3蛋白在其N末端附近包含一个WW结构域、一个富含脯氨酸的区域（多个PXXP基序）和一个BAG结构域。WW结构域代表一个蛋白质相互作用模块，该模块结合携带富含脯氨酸基序的蛋白质，序列为PPXY[1,2]. 一些WW结构域以磷酸化依赖的方式识别其肽配体。这些结构域已在与质膜受体复合物或膜下细胞骨架成分相互作用的几种信号转导蛋白中确定（综述于[2,三]. BAG3还包含序列PXXP的几个SH3-配体基序[4]表明BAG3可以结合特定的含SH3的蛋白质，使BAG3在信号转导途径中发挥作用。BAG3与迁移细胞前沿的肌动蛋白相关，并控制细胞运动[5]. 在许多人类肿瘤细胞系中，尤其是在腺癌中，BAG3蛋白高度表达。通过基因敲除降低BAG3水平抑制上皮癌细胞系（ALVA31）的侵袭和转移活性体内表明BAG3可能参与癌症的侵袭或转移表型[5].

在细胞运动过程中，肌动蛋白细胞骨架在空间和时间上受到严格调控。粘附是由附着在细胞外基质上的整合素家族蛋白介导的。整合素通过内化、内吞、运输和胞吐快速回收，而粘附分子则内化到细胞中并运输到前沿，以便在粘附中重复使用。最近的研究表明，氯氰菊酯介导的整合素内吞作用在细胞前沿起主导作用，极化细胞随着前沿再循环/内吞作用的增强而运动。因此，肌动蛋白细胞骨架、内吞和粘附分子的严格控制的信号机制协同调节细胞运动（综述于[6,7,8]).

迄今为止，许多小GTPase蛋白被报道参与细胞运动。最近，克隆并表征了含有鸟嘌呤核苷酸交换因子的PDZ结构域PDZGEF1（也称为RA-GEF1、nRapGEP和CNrasGEF）和PDZGEF2[9]. PDZGEF1和PDZGEF2蛋白具有相似的生化活性，并激活Rap1和Rap2小GTPase[9]. PDZGEF1中的RA域与Rap1相互作用，但不与Ras相互作用[10]而其PY域绑定Nedd4的WW域[11]. PDZGEF2增加整合素介导的细胞粘附，并在粘附连接成熟中发挥作用[12,13].

在这里，我们发现共伴侣BAG3直接与PDZGEF2相互作用，以调节整合素介导的细胞粘附。

材料与方法

结果

作为BAG3相互作用伙伴的PDZGEF2的克隆

为了鉴定与BAG3相互作用的蛋白质，我们对2×10的人Jurkat T细胞cDNA文库进行了酵母双杂交筛选⁶克隆，使用全长BAG3蛋白作为诱饵。在进行了几项测试以确认这些相互作用的特异性后，我们发现了几个候选的BAG3-结合蛋白：i）PDZGEF2，一种含有PDZ结构域的鸟嘌呤核苷酸交换因子，据报道激活Ras家族成员Rap1[9]，ii）带有未标记SH3或富含praline蛋白序列的cDNA克隆，以及iii）Hsc70的重叠克隆。克隆了三个不同的片段，作为PDZGEF2（RapGEF6）的重叠克隆，包含氨基酸1326–1609（克隆A7）、1444–1609图1A.

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图1

PDZGEF2与BAG3相互作用分析

（A） PDZGEF2域的示意结构。cNMP结合同源性、REM、PDZ、RA、GEF、PPXY域用开框表示。通过两个杂交筛选获得的八个BAG3结合cDNA克隆对应的区域由位于右上角的三条线表示。（B） 内源性BAG3和PDZGEF2在细胞内相互作用。用AR100（多克隆抗BAG3抗体）对内源性BAG3进行免疫沉淀，然后用抗PDZGEF2抗体进行免疫印迹。（C） 使用编码BAG3、BAG3缺失突变体（ΔWW、ΔPXXP、ΔBAG）、CD40胞浆结构域（阴性对照）的GST融合蛋白进行体外结合试验³⁵S-L-蛋氨酸标记PDZGEF2A7。作为控制，输入量相等在体外将翻译后的PDZGEF2A7（IVT）直接加载到凝胶上。（D） 使用Myc-tagged PDZGEF2A7和Flag-taged BAG3（FL，ΔWW，△PXXP，ΔBAG）进行免疫沉淀分析。Flag抗体沉淀免疫复合物，然后用myc检测PDZGEF2的western blot（上图）。细胞裂解物直接用于免疫印迹，然后用Myc抗体（中间面板）和BAG3构建物的Flag进行检测。（E） PDZGEF2中两个PPXY基序的缺失表明PPDY与BAG3有特定的相互作用。在PDZGEF2（A7片段）的C末端片段中进行Myc标记的PPGY缺失（ΔPPGY）、PPDY缺失（△PPDY）或两者（Δ2PY）或对照，然后在293细胞中使用BAG3联合转染进行免疫沉淀分析。用Flag抗体制备免疫复合物，用Myc抗体进行免疫印迹（上图）。

BAG3-结合蛋白PDZGEF2是PDZGEF1的密切同源物，在N端具有相似的肽序列，但在BAG3相互作用的位点C端具有有限的相似性。序列最长的PDZGEF2（A7）克隆与PDZGEF1的同源性仅为39%，相似性仅为52%。相比之下，N末端结构域具有72%-85%的同源性和82-93%的相似性，这表明与BAG3具有功能相似性，但结合亲和力不同。在同源区域中，PDZGEF1和PDZGEF2包含（从N端到C端）一个环核苷酸单磷酸（cNMP）结合同源域、Ras-exchange域（REM）、PDZ域、Ras/Rap关联（RA）域、假定的GDP/GTP交换因子（GEF）域、PY域（PPXY基序，也称为WW域相互作用基序），和C-末端PDZ配体基序（S/TXV）基序[9]. Northern blot分析检测到PDZGEF1的最高表达水平定位于大脑、心脏、胎盘、骨骼肌、肾脏和胰腺组织[9]. 相反，PDZGEF2在组织中的表达更为广泛。

在我们的屏幕上，所有BAG3相互作用的克隆都带有C末端PPXY基序。对于在体外结合试验中，A7和F11克隆被亚克隆并用于进一步分析。最短的相互作用克隆只有103个核苷酸，没有用于后续分析。

BAG3的WW结构域对调节细胞运动和粘附至关重要

在缺乏血清的条件下进行的瞬时运动试验中，我们观察到，在Cos7细胞中BAG3的过度表达增加了细胞粘附和细胞运动[5].图2A显示了用pEGFP BAG3ΔWW、pEGFP-野生型BAG3或pEGFP-pEGFP质粒转染的Cos7细胞的运动性比较。使用transwell系统进行细胞运动分析。BAG3 WW结构域的缺失导致细胞运动性的显著降低。由于我们的cDNA克隆数据和相互作用分析表明，WW结构域与PDZGEF2（RapGEF6）相互作用，Rap1被称为整合素介导的细胞粘附的阳性调节器[13,16]，我们使用纤维连接蛋白涂层板进行粘附测试。图2B显示BAG3ΔWW显著降低纤维连接蛋白涂层板上的粘附活性，表明BAG3的WW结构域对整合素介导的细胞粘附很重要。图2C表明pEGFP-BAG3和pEGFPBAG3ΔWW在本试验中稳定表达。

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图2

BAG3的WW结构域对细胞运动和粘附至关重要

（A） BAG3ΔWW缺失转染的细胞会损害整合素介导的粘附。用BAG3野生型（BAG3）、WW结构域缺失（ΔWW）和pEGFP空载体转染Cos7细胞，然后进行粘附试验（*p<0.01，平均值±SD，n=6）。（B） 在具有BAG3ΔWW的Cos7细胞中发现细胞运动受损（*p<0.01，平均值±SD，n=6）。（C） 将BAG3野生型（pEGFP-BAG3）和pEGFP-BAG3ΔWW转染293T细胞。GFP抗体免疫印迹显示稳定表达。

PDZGEF2诱导Rap1活化并增加整合素介导的粘附

利用从HEK293T细胞中提取的总RNA，通过RT-PCR克隆了PDZGEF2的全长cDNA。已知小GTP结合蛋白Rap1是PDZGEF2的下游靶点。为了检测PDZGEF2对Rap1的激活，我们比较了对照组Cos7和过度表达PDZGEF2的细胞中Rap1活性。制备细胞裂解物，然后通过吸附到固定化GST-RalGDS融合蛋白中回收GTP-结合形式的Rap1。对于阳性和阴性对照，我们分别使用与非水解GTP（GTPγS）和GDP孵育的裂解物。与对照Cos7细胞相比，PDZGEF2过度表达细胞的裂解液中回收了更多活性Rap1(图3A). 相反，GTPγS处理的裂解物在对照细胞和PDZGEF2过度表达细胞中显示出可比较的Rap1总水平（未显示）。这一结果表明PDZGEF2调节Rap1活性。由于Rap1被报道为整合素介导的粘附的阳性调节物，我们比较了PDZGEF2过度表达细胞与纤维连接蛋白涂层（整合素依赖性配体）塑料板的粘附率。在短期粘附试验（20分钟）中，与对照转染的Cos7细胞相比，PDZGEF2过表达的Cos8细胞粘附在纤维连接蛋白涂层板上的数量更多(图3B). 接下来，我们使用transwell分析来确定PDZGEF2是否增加细胞活力。由于PDZGEF2与BAG3的WW结构域相互作用，并且表达BAG3ΔWW的细胞运动性降低，我们在跨阱分析中检测PDZGEF2过度表达是否会增加细胞运动性。如所示图3CPDZGEF2和对照转染的Cos7细胞在细胞运动方面没有差异。

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图3

PDZGEF2激活Rap1并调节细胞粘附

（A） 使用GST-RalGDS下拉（1）在PDZGEF2转染的COS7细胞中检测到Rap1激活^标准面板）。Rap1总表达量（2^第二次面板）。Myc抗体检测到MycPDZGEF2的过度表达（3^第个面板）。抗PDZGEF2抗体F11检测对照转染细胞中的内源性PDZGEF2以及过度表达的myc PDZGEF（4^第个面板）。作为加载控制（5^第个面板）。（B） PDZGEF2转染的Cos 7细胞增加了纤维连接蛋白涂层板的粘附力。数据表示电镀后20分钟，粘附细胞数量相对于对照转染细胞的百分比变化（*p<0.01，平均值±SD，n=6）。（C） 细胞运动试验。用编码pcDNA3-mycPDZGEF2的质粒或空白对照pcDNA3质粒转染Cos7细胞，然后进行血清饥饿和转染试验（8μm孔径）4小时。数据表示平均值±SD（n=6）。

PDZGEF2基因敲除后，BAG3在Cos7细胞中失去细胞粘附活性

我们检测了PDZGEF2功能的抑制是否影响BAG3在细胞粘附中的功能。我们使用两种不同的低聚物shGEF2#1和shGEF2#2生成PDZGEF2 shRNA表达载体，如材料和方法部分所述。用含有PDZGEF2 shRNA的逆转录病毒感染Cos7细胞，并用含嘌呤霉素的培养基（1μg/ml）筛选稳定株。western blot证实PDZGEF2蛋白的表达，表明shGEF2#2比shGEF2#1更有效地抑制PDZGEF2的表达，分别达到约80%和约50%的抑制效果。使用shGEF2#2转染剂，pcDNA3myc袋子3瞬时转染全长质粒（pcDNA3BAG3）和对照质粒（pcDNA3）(图4A)然后在纤维连接蛋白涂层板上进行粘附测试。如所示图4B，BAG3过度表达不会增加PDZGEF2敲除细胞中的细胞粘附，表明PDZGEF2相互作用足以实现BAG3控制的粘附活性。用myc抗体进行免疫印迹也证实了外源性过度表达myc标记的bag3（未显示）。

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图4

PDZGEF2基因敲除细胞中BAG3失去细胞粘附活性

（A） PDZGEF2敲除细胞（shGEF2）或对照逆转录病毒感染细胞通过pcDNA3-myc-bag3构建物（pcDNA3bag3）或单独pcDNA3载体过度表达，然后通过抗PDZGEF2抗体（上面板）和抗bag3抗体（中面板）进行免疫检测。Tubulin用作加载控制（下面板）。（B） 用BAG3全长表达载体转染PDZGEF2基因敲除或对照感染细胞，然后用结晶紫进行粘附试验。数据代表平均值±SE（n=6，*p<0.01）。

讨论

在本报告中，我们证明BAG3与Rap1、PDZGEF2的鸟嘌呤交换因子直接相互作用。BAG3 WW域与PDZGEF2的PPXY基序相互作用，这是WW域相互作用的已知基序。PDZGEF2中有两个PPXY序列。任一PPXY序列的缺失突变表明，只有第二个PPXY基序（PPDY）对BAG3相互作用至关重要。制作BAG3 WW结构域缺失突变体并用于细胞运动或粘附检测。这表明WW结构域在调节运动和粘附中的重要性。PPXY基序也在PDZGEF1中发现，PDZGEF2与PDZGEF同源。虽然PDZGEF2和PDZGEF1的C末端区域只有很低的相似性，但PDZGEF和PDZGEF2有两个PPXY基序（PPGY和PPDY），这表明PDZGEF1也可能与BAG3相互作用。PDZGEF1的PPXY结构域与E3泛素连接酶Nedd4的WW结构域结合，其靶向泛素蛋白酶体降解[17]. PDZGEF1的PPGY和PPDY基序都与Nedd4泛素连接酶相互作用，但BAG3可能只与PPDY基序相互作用。研究Nedd4泛素连接酶与PDZGEF2的相互作用，以及BAG3是否可以与Nedd4竞争相互作用，将是很有意义的。BAG3 WW结构域也与腺病毒戊糖基蛋白相互作用。腺病毒戊糖基是负责病毒内化的病毒衣壳蛋白，BAG3与该蛋白的直接相互作用增加了核迁移，表明BAG3可能通过以下途径参与腺病毒的生命周期[18].

PDZGEF1和PDZGEF2都具有C末端S/TXV基序，即PDZ配体基序。据报道，两种PDZ蛋白（S-CAM和MAGI-1）通过该基序与PDZGEF1结合[19,20]. 为了更好地理解BAG3在调节PDZGEF2活性中的功能，我们很有兴趣在BAG3复合物中发现PDZGEF2是否与PDZ配体基序合作。

之前我们发现BAG3过度表达增加，shRNA-介导的BAG3蛋白减少减少了纤维结合蛋白涂层板上的细胞粘附。在本报告中，我们的结果表明BAG3是PDZGEF2的调节器，这种相互作用可能与Rap1的激活有关。由于PDZGEF2增加细胞粘附，但不增加细胞运动，因此有必要进一步研究BAG3调节细胞运动的分子机制。BAG3与PLCγ相互作用，PXXP结构域缺失改变FAK磷酸化[21,22]. 多个SH3蛋白可能将BAG3与细胞运动过程联系起来。进一步分析与BAG3的PXXP基序相互作用的生理相关蛋白可能揭示SH3蛋白在BAG3介导的细胞运动调节中的重要性。

PDZGEF2的一个密切同源物PDZGEF1在功能上类似于调节Rap1和Rap2上的GDP/GTP交换[9]，是已知的调节细胞骨架组装和细胞迁移的小GTPase（在[23])。GEF活动需要PDZGEF1的RA域，该域允许与Rap1而非Ras进行交互，PDZGEF1-Rap1交互通过正反馈刺激Rap1功能[10]. PDZGEF2的RA结构域与M-Ras相互作用，后者激活PDZGEF2并将其转移到质膜[24]. 高等最初克隆了一个C末端截短的亚型作为全长PDZGEF2，并显示该亚型激活了Rap1[24]，不应与BAG3相互作用。虽然我们通过RT-PCR仅获得了一个cDNA片段，但在基因组数据库中发现了六种潜在的PDZGEF2选择性剪接形式，导致不同的C末端序列。Isoforms#1（GenBank ID:{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_001164386”，“术语id”：“1677501686”}}NM_001164386)和#2（NM_016340.5）含有PPXY基序，但其他亚型缺乏C末端肽，包括PPXY基序。因此，我们预计亚型#3（NM_001164387.1）、#4（NM_01164388.1）、#5（NM_011164389.1）和#6（NM_001164390.1）在功能上独立于BAG3关联，或可以作为BAG3/PDZGEF2复合物的主要负抑制剂。根据剪接变异体的序列数据，PDZGEF2的shRNA敲除对亚型6无效。异构体#2和#5在GEF域中有8个氨基酸缺失，尽管这是否影响其GEF活性尚不清楚。我们的抗体检测到一个分子量约为180kDa的主带。全长构建体的过度表达产生相同的分子量带。因此，我们预计亚型#1（1609氨基酸）转录物是我们系统中的主要产物，但检查不同细胞类型或组织中每个亚型的表达模式非常重要，尤其是PPXY基序是否存在。

最近，PDZGEF2被发现是与Afadin相互作用的结合黏附分子a（JAM-a）的伴侣蛋白。PDZGEF2通过与JAM-A的相互作用调节细胞与整合素药物细胞的粘附-ECM调节[25]. 据报道，Rap1信号被E-cadherin内化激活，并增加整合蛋白介导的细胞-ECM粘附，表明Rap1对细胞间粘附到细胞-ECM黏附的信号进行调节。粘附结合的成熟也受PDZGEF2调节[12]. 这一证据表明PDZGEF2调节细胞间和细胞-ECM粘附。PDZGEF2的生理激活物尚不清楚，但我们的研究可能有助于揭示BAG3在PDZGEF2调节细胞粘附和运动的生理功能中的作用。

结论

BAG3的WW结构域与PDZGEF2（RapGEF6）的PPDY基序相互作用。在PDZGEF2敲除细胞中，BAG3 WW结构域的缺失导致细胞运动性和粘附性显著降低，而BAG3过度表达并不会增加细胞粘附性。这些结果表明，PDZGEF2是BAG3调节细胞粘附的关键伙伴。

致谢

使用了非标准缩写

脚注

参考文献