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胃肠病学。作者手稿；PMC 2010年10月5日发布。
以最终编辑形式发布为：
胃肠病学。2010年10月；139（4）：1375–1384.e4。
2010年6月1日在线发布。 数字对象标识：10.1053/j.gastro.2010.05.074
PMCID公司：1949年5月21日
尼姆斯：NIHMS209475
PMID：20685364

NOX2在体内星状细胞激活和肝纤维化形成中起关键作用

乔伊·X.江,1 Senthil Venugopal公司,2 Nobuko Serizawa公司,1 陈香玲,1 菲奥娜·斯科特,1 李勇,1 罗杰·亚当森,三 斯里德维·德瓦拉吉,4 维杰·沙阿,5 埃里克·格什温,6 斯科特·弗里德曼,7和娜塔莉·托洛克（Natalie Jörök）1
作者信息 版权和许可证信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

背景和目标

肝细胞凋亡和肝星状细胞（HSC）激活是肝纤维化的关键事件。我们先前证明，HSC对凋亡肝细胞的吞噬作用是促纤维化的。基于这一点，以及NADPH氧化酶诱导对纤维形成至关重要的观察，我们的目的是研究吞噬细胞NADPH酶NOX2。

方法

安体内通过注射野生型（wt）或NOX2建立吞噬模型-/-含有肝细胞特异性启动子和ad-TRAIL的慢病毒-GFP小鼠。评估胆管结扎（BDL）wt和NOX2的纤维化-/-给予或不给予钆治疗的小鼠。研究了NOX2在人类肝脏样本和从纤维化肝脏分离的HSC中的表达。通过胶原蛋白报告分析评估NOX2的成纤维活性。

结果

在吞噬模型中，可以看到GFP标记的凋亡小体被吞噬，并且α-SMA和I型胶原在wt中的表达显著增加，但在NOX2中的表达不明显-/-老鼠。抑制细胞凋亡可降低促纤维化反应。二氧化氮-/-BDL后动物的纤维化明显减少。在wt BDL小鼠中灭活巨噬细胞并没有将胶原蛋白的生成降低到NOX2中观察到的水平-/-小鼠表明表达NOX2的HSC在纤维形成中很重要。NOX2在纤维化肝HSC中上调，并显示吞噬诱导的NOX2表达和活性。根据报告者分析，NOX2介导的ROS直接诱导HSC中的胶原蛋白启动子活性。

结论

肝细胞的凋亡和吞噬直接诱导HSC活化和纤维化的发生。NOX2，吞噬细胞NADPH氧化酶在这个过程和肝纤维化形成中起关键作用体内.

关键词：肝纤维化、凋亡、NADPH氧化酶

肝纤维化是各种病因慢性肝损伤的最终结果1肝细胞凋亡是这一过程的共同特征，与肝损伤的类型无关2凋亡细胞通常由专业吞噬细胞通过胞吐作用有效清除，但当吞噬系统被吞噬时，非专业吞噬细胞开始在吞噬中发挥越来越大的作用三我们最近发现肝星状细胞（HSC）在慢性肝损伤期间发挥吞噬功能4HSC是肝纤维化的核心；激活后，它们转分化为肌成纤维细胞，产生细胞外基质（ECM）成分和促纤维化细胞因子。HSC吞噬肝细胞源性凋亡小体（AB）是促纤维化的，因为它诱导胶原α1（I）和TGF-β1上调，以及NADPH氧化酶（NOX）依赖性超氧化物的产生4此外，吞噬作用和NADPH氧化酶介导的信号传导事件可诱导肌成纤维细胞存活5因此，吞噬作用和由此产生的HSC活化可能是肝纤维化的第一个始发事件，将肝细胞凋亡与HSC活化和ECM的产生联系起来。HSC表达NADPH氧化酶复合物的亚单位p22phox、p47phox，p67phox和gp91phox（NOX2），以及NOX16在吞噬细胞NOX激活过程中，细胞溶质亚单位（p47phox，p67hox）迁移到膜上，与亚单位gp91phox和p22phox结合，组装活性氧化酶。Gp91phox是速率抑制催化成分，其转录上调显示在炎症反应期间增加呼吸爆发能力7Rac GTPase也是NOX的重要调控元件8激活后，Rac-GTP转移到膜上，与p67phox相互作用。Rac1普遍表达，而Rac2仅在髓系细胞中表达9Rac1被证明在异源系统中激活NOX2，导致活性氧化物种（ROS生成）8.组成活性Rac1诱导小鼠加速肝纤维化的表达10，说明Rac1在纤维发生中的重要性。另一方面，Rac1的激活也与吞噬作用的诱导有关11多种促纤维蛋白原刺激可激活HSC中的NOX，如PDGF12，血管紧张素II13和瘦素14然而，在HSC中，不同NOX引发的激活、功能和下游信号事件的机制尚未明确阐明。

在这项研究中，我们发现肝细胞的凋亡与星状细胞的激活直接相关体内,通过HSC中NOX2（gp91phox）的激活。这是肝纤维化发生的一个重要早期事件，直接影响ROS介导的HSC胶原上调。因此，NOX2是诱导早期纤维化改变的中心酶。

材料和方法

肝组织样本

肝脏活检样本来自NCI资助的加州大学戴维斯癌症中心生物资源库。

动物研究

体内吞噬模型：wt（C56BL6）或NOX2-/-将慢病毒（LV）-GFP和肝细胞特异性α1抗胰蛋白酶（α1-AT）启动子（3×107pfu/g）（加州大学戴维斯分校泽恩博士的礼物）注入门静脉，7天后Ad-TRAIL（2×107pfu/g）（来自Gores博士的礼物，梅奥诊所），注入同一只小鼠的尾静脉。另一组小鼠经腹腔注射胰蛋白酶抑制剂Q-VD-OPH（10 mg/kg，MP Biomedicals，Solon，OH；Adeno-TRAIL注射当天和注射后第二天两次），对照组注射载体DMSO。对照组注射α1-AT-LV-GFP（3×10）7pfu/g）或Ad-TRAIL（2×107pfu/g）或Ad-GFP（2×107pfu/g，Vector Biolabs，Philadelphia PA）。注射Ad-TRAIL后3天处死动物。

对wt和NOX2进行BDL-/-小鼠，如上所述4.假手术并行进行。氯化钆（GdCl三在整个实验过程中，每隔一天腹腔注射10 mg/kg生理盐水（Sigma-Aldrich）。手术后3或6周处死小鼠。为了研究NOX2表达，从BDL或假手术Sprague-Dawley大鼠（Charles River Laboratories Inc.，Wilmington，MA）中分离出HSC，如下所述。

统计分析

所有数据至少代表三个实验，并表示为平均值±SED。使用与Dunnett检验相关的单因素方差分析（ANOVA）比较各组之间的差异。当p<0.05时，假设具有统计学意义。

有关组织学、免疫组织化学、TUNEL分析、羟基脯氨酸分析、血清生化测量、凋亡小体的制备和吞噬实验、病毒制备、siRNA实验、实时PCR、亮氨酸分析、评估胶原蛋白启动子活性的报告分析和Rac1下拉分析的详细信息，西方印迹法请看补充材料和方法.

结果

肝纤维化过程中NOX2在肝星状细胞中表达

我们用免疫组织化学和共焦显微镜研究了HCV或PBC患者肝脏标本中NOX2的表达。NOX2在α-SMA阳性HSC中表达(图1A)在HCV和PBC中。为了在肝纤维化动物模型中概括这一点，对大鼠进行BDL，分离HSC（HSC的纯度通过α-SMA染色确认）。BDL大鼠原发性HSC中NOX2 mRNA（12.7±1.2倍，*p＜0.05）和蛋白表达（4.22±0.004倍，p＜0.05，密度测定法，未显示）显著增加，而假手术动物的HSC中NOX2表达水平较低(图1B). 由于诱导活化HSC吞噬细胞NOX2表达的信号尚不清楚，我们推测凋亡小体（AB）的吞噬可能是一个触发因素。为了验证这一点，将原发性HSC暴露于AB，并通过实时PCR检测NOX2的表达。我们发现吞噬作用后，HSC中NOX2表达显著诱导（4.25±0.98倍，**p≤0.0001）(图1C). 结合我们早期的数据，吞噬作用后NOX2的上调可能转化为HSC增加I型胶原的生成。

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肝纤维化过程中HSC中NOX2的表达上调

（A） 共焦显微镜下，HCV（A，b，c，）和PBC（d，e，f）患者的肌成纤维细胞表达NOX2（绿色通道，A，d）、α-SMA（红色通道b，e）和共定位图像（c，f）。棒材=30μm。（B） 从BDL和假大鼠分离HSC，并评估NOX2 mRNA和蛋白表达。NOX2 mRNA和蛋白质（*p<0.05）均显著高于假手术动物的HSC（如折叠表达所示）。（C） 从大鼠分离HSC并暴露于AB 24小时。通过实时PCR检测NOX2的表达。AB吞噬作用诱导HSC中NOX2上调，表现为倍数增加（**p≤0.01）。误差条指示1 SED。

吞噬凋亡小体后产生的超氧化物和胶原上调是NOX2依赖性的

将NOX2 siRNA或干扰siRNA转染原代大鼠HSC，然后暴露于AB。通过荧光素分析评估超氧化物生成(图2A). 在打乱的siRNA-转染细胞中，吞噬作用诱导了超氧物的产生（1.75±0.24倍，*p<0.05），而在NOX2-siRNA-转基因细胞中这一点受到抑制。接下来，我们使用打乱或NOX2 siRNA-转染的HSC，通过实时PCR评估吞噬作用后胶原上调是否是NOX2介导的。AB暴露后，打乱siRNA-转染HSC中胶原IA1的表达上调（**p≤0.01），而NOX2-siRNA-转基因原代HSC中的胶原IA1表达显著降低（88%±4，##p≤0.0001），表明这是吞噬诱导的成纤维反应的中心酶(图2B).

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HSC中NOX2的激活通过诱导其转录激活导致超氧化物的产生和I型胶原mRNA的上调

（A）用打乱的siRNA或NOX2 siRNA处理原代大鼠HSC，并暴露于AB中。6小时后，通过荧光素分析评估超氧化物的产生。在干扰siRNA-转染的HSC中，吞噬作用诱导了超氧物的产生，并且在NOX2 siRNA转染的细胞中这一点受到抑制（NT：未转染，C：对照，未暴露于AB，*p<0.05，4个实验的平均值，条形图表示1 SED，以倍数表示）。（B）)实时PCR检测胶原IA1的表达。AB暴露后，打乱的siRNA-转染细胞中的IA1胶原表达上调（如折叠表达所示，**p≤0.01），而在NOX2-siRNA-转基因原代HSC中则显著降低（##p≤0.0001）。

（C）主要野生型或NOX2-/-HSC通过含有截短胶原蛋白启动子Col1A2 P1-Luc（-378/+58）的构建物或过氧化物反应区完整的构建物[Col1A2 P1-Luc（-2900/+88）]或空载体转染。细胞在存在或不存在还原剂GSH或过氧化氢酶的情况下暴露于AB。吞噬作用导致Col1A2 P1-Luc（-2900/+58）转染细胞中COLIA2启动子活性显著诱导。这在Col1A2 P1-Luc（-378/+58）转染的细胞中被消除，或在接触过氧化氢酶或GSH后降低。因此，在wt细胞中，胶原蛋白启动子活性是由吞噬作用后NOX2介导的过氧化物生成引起的。在NOX2中-/-细胞的荧光素酶活性在暴露于AB后显著减弱（C：对照细胞，AB：凋亡小体，cata：过氧化氢酶，GSH：谷胱甘肽*p<0.05，**p≤0.01）。

胶原启动子是由吞噬作用后NOX2依赖机制诱导的

胶原蛋白由两条α1链和一条α2链组成。COLIA1和COLIA2基因都对ROS高度敏感15.启动子包含H2O（运行）2-因此，我们研究了NOX2介导的超氧化物和过氧化物的产生是否可以直接导致胶原蛋白启动子的活性。主要野生型或NOX2-/-HSC通过含有截短启动子Col1A2 P1-Luc（-378/+58）的构建物或过氧化物敏感区完整的构建物[Col1A2 P1-Luc（-2900/+58。然后，将细胞暴露于存在或不存在还原剂GSH或过氧化氢酶的AB中。与对照细胞相比，HSC吞噬AB导致Col1A2 P1-Luc（-2900/+58）转染细胞中COLIA2启动子活性显著诱导（35.7±6.2倍，**p≤0.01）。这在Col1A2 P1-Luc（-378/+58）转染细胞中被消除（1.95±0.21倍，**p≤0.01），或在接触过氧化氢酶后降低（5.66±0.4倍，**p≤0.01）(图2C). NOX2中-/-吞噬后荧光素酶活性显著减弱（1.71±0.21倍，p<0.05）。因此，NOX2是一种候选酶，在纤维形成过程中调节超氧化物和过氧化物介导的胶原表达诱导。

HSC招募Rac1和吞噬凋亡小体需要完整的NOX2

在我们之前的研究中，我们发现AB的吞噬作用诱导Rac1激活，Rac1是非造血细胞中NOX2的重要调节元件；组成活性Rac1也增强了HSC的吞噬活性16已知CGD中性粒细胞对酶复合物的Rac募集显著减少（gp91phox突变）17因此，可能需要完整的NOX2才能在HSC中招募和激活Rac1，从而发生吞噬作用。为了测试这一点，首先，以wt和NOX2为单位的吞噬率-/-对HSC进行了研究，我们发现NOX2-/-HSC吞咽AB明显减少（#p<0.001，图3A). 为了评估吞噬活性的下降是否实际上是由于GTP-ase活性降低和/或Rac1向膜中酶复合体的募集减少所致，我们对wt和NOX2进行了Rac1下拉分析-/-HSC暴露于AB后，测试GTP-Rac1的膜组分。在NOX2中-/-HSC膜组分中活性Rac1的数量减少(图3B). 虽然抗活性Rac1的抗体标记了wt细胞中的吞噬体膜，但NOX2中没有发现吞噬体标记-/-细胞。NOX2中TAMRA-标记AB的系留-/-细胞确实发生了，但吞没没有发生或常常是不完全的。因此，Rac1的招募、激活和吞噬需要完整的NOX2。由于吞噬作用可能是肝细胞凋亡诱导的纤维化活动中的一个重要早期事件，我们接下来将测试这些活动的有效性在体外数据通过一种新的模型体内吞噬作用。

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NOX2的吞噬活性降低-/-HSC公司

（A）初级重量或NOX2-/-HSC暴露于TAMRA标记的AB，24小时后评估吞噬率。从NOX2中分离出的HSC吞噬作用显著降低-/-小鼠与wt小鼠的比较（p<0.001）。（B）从wt和NOX2的膜组分中提取活性GTP-结合的Rac1-/-与NOX2相比，AB暴露后，HSC在wt细胞的膜部分中显示出显著更多的GTP-Rac1-/-细胞。在wt HSC（箭头）中，在TAMRA标记的AB（红色）周围形成的吞噬体膜上可检测到Rac1免疫染色，而在NOX2中-/-可见HSC AB附着，但吞噬体形成受损（箭头），bar=10μm。

肝细胞凋亡与吞噬作用体内直接诱导肝星状细胞活化

在本研究中，我们诱导GFP阳性肝细胞选择性凋亡，以追踪其AB的命运。该模型基于TRAIL在正常肝细胞上不凋亡，但可诱导病毒感染肝细胞的细胞死亡的概念18-19为了追踪凋亡的肝细胞，我们使用慢病毒方法，由于肝细胞特异性启动子α1-AT的表达，GFP仅由肝细胞表达。首先向动物注射α1-AT-LV-GFP通过7天后，将Ad-TRAIL注射到相同小鼠的尾静脉。然后检测TRAIL介导的GFP阳性、病毒感染的肝细胞凋亡。作为对照，小鼠仅注射α1-AT-LV-GFP，或仅注射Ad-TRAIL或Ad-GFP。在病毒注射之前，给另一组小鼠注射胰蛋白酶抑制剂Q-VD-OPH。仅Ad-TRAIL或LV注射小鼠的肝组织没有明显损伤或炎症细胞浸润，ALT值保持正常(图4b、c). 在LV加Ad-TRAIL注射的动物中，肝脏表现出轻度至中度肝细胞损伤，伴有相关再生活性，ALT值升高，炎症细胞无明显浸润(图4d). 胰蛋白酶抑制剂处理的LV加Ad-TRAIL注射组的肝脏组织学正常(图4e)ALT显著降低（p≤0.05）。为了验证我们的模型，并证明肝细胞凋亡，对所有样本进行了TUNEL分析。在LV+Ad-TRAIL感染的肝脏中，肝细胞凋亡增加(图4d’)与Ad-TRAIL相比(图4b')，或仅LV(图4c')注射动物。在Q-VD-OPH治疗组，凋亡细胞数量减少(图4e'). 在每个实验条件下研究肝脏组织学，我们没有发现炎症细胞浸润。为了证实这一点，我们对CD11b（Mac-1）进行了免疫组化，并且在每个实验中我们发现了相似数量的CD11b阳性细胞(补充图1A). 此外，实时PCR显示每种条件下TNF-α的表达水平相当。

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体内肝细胞凋亡和吞噬模型

为了追踪凋亡肝细胞的命运，小鼠首先注射α1-AT-LV-GFP通过7天后，将Ad-TRAIL注射到相同小鼠的尾静脉。作为对照，只给小鼠注射Ad-TRAIL或Ad-GFP（图片未显示）或α1-AT-LV-GFP。为了抑制凋亡，在Ad-TRAIL注射前后分别给一组小鼠注射Q-VD-OPH、胰蛋白酶抑制剂。仅Ad-TRAIL或LV注射小鼠的肝脏未出现明显损伤或炎症细胞浸润，ALT值保持正常（图4b，c）。在LV加Ad TRAIL注射的动物中，肝脏表现出轻度至中度肝细胞损伤，ALT值升高（*p<0.05），并且没有明显的炎症细胞浸润（图4d）。在Q-VD-OPH处理的动物中，与LV加Ad-TRAIL注射的小鼠相比，肝脏显示出正常的组织学（图4e）和降低的ALT值（*p<0.05）。为了评估细胞凋亡，对所有肝脏样本进行TUNEL分析。在LV加Ad TRAIL感染的肝脏中，与仅注射Ad TRAIL（图4b’）或仅注射LV（图4c’）的动物相比，肝细胞凋亡增加（图4d’）。在Q-VD-OPH治疗的动物中，细胞凋亡减少（图4e'）。bar=50μm。

为了分析吞噬作用，采用免疫组织化学和共焦显微镜观察GFP标记的肝细胞和活化的HSC（α-SMA，红色）。注射α1-AT-LV-GFP和Ad-TRAIL的小鼠肝脏中激活的HSC数量增加(图5d，e)，而在唯一的LV中(图5c)，或仅Ad-TRAIL(图5b)注射小鼠未检测到与对照组相似的增加(图5a). 在高倍放大的α-SMA阳性HSC中，可以看到GFP标记的AB（箭头所示），表明肝细胞源性AB被吞噬(图5f). 在wt和galectin 3的不同模型中也证实了细胞凋亡和吞噬介导的纤维生成性变化-/-按照上述方法处理小鼠，在半乳糖凝集素3中发现前胶原α1（I）和转化生长因子β表达降低-/-老鼠（手稿正在准备中）。半乳糖凝集素3通过促进AB的栓系而对吞噬作用是必要的20.

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凋亡肝细胞吞噬作用体内导致纤维生成反应

免疫组织化学和共聚焦显微镜观察GFP标记的肝细胞及其AB和活化的HSC（α-SMA，红色）。（由于肝细胞特异性α1-AT启动子，GFP仅在肝细胞中表达）。注射α1-AT-LV-GFP和Ad-TRAIL的小鼠肝脏中激活的HSC（α-SMA，红色）数量增加（图5d，e），而仅注射Ad-TRALL（图5b）或仅注射LV-GFP（图5c）的小鼠与未注射对照组小鼠（图5a）具有相同数量的激活HSC，bar=50μm。在高倍放大的α-SMA阳性HSC中，可以看到GFP标记的AB，表明肝细胞源性AB被吞噬（箭头，箭头表示凋亡的肝细胞，AB，图5f），bar=20μm。

肝细胞凋亡直接诱导HSC活化体内因为在这个模型中没有使用成纤维剂或方法。这直接支持了肝细胞凋亡是促纤维化的假说。

NOX2中AB的吞噬作用降低了星状细胞的活化-/-老鼠

基于我们的在体外数据，NOX2-/-HSC，胶原的上调被减弱。要在我们的体内wt和NOX2模型-/-如上所述，给小鼠注射Ad-TRAIL或LV或LV加Ad-TRAIL，无论是否添加胰蛋白酶抑制剂。免疫组织化学显示NOX2中α-SMA阳性HSC较少-/-注射LV加Ad TRAIL后的小鼠，表明在这些动物中HSC的激活减弱（wt和NOX2的图像-/-显示用LV加Ad-TRAIL注射的具有或不具有pancaspase抑制剂，图6A). 为了证实这些数据，对注射病毒的wt和NOX2的肝脏进行实时PCR-/-使用α-SMA、胶原IA1和TGF-β1特异性引物的小鼠。在LV加Ad-TRAIL注射的wt动物中，α-SMA（31.3±6.16倍，*p<0.05）、胶原IA1（6.03±0.7倍，**p≤0.01）和TGF-β1（17.03±2.6倍，*p<0.05）的表达显著增加(图6B)，而NOX2中未检测到增加-/-动物。此外，caspase抑制剂治疗显著降低了纤维生成标记物的上调（*p<0.05）。综上所述，这些数据表明，NOX2在肝细胞凋亡后促成纤维基因的早期上调中至关重要。

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二氧化氮-/-小鼠的促纤维化活性降低

重量和NOX2-/-给小鼠注射Ad-TRAIL或LV或LV加Ad-TRAIL。免疫组织化学显示NOX2中α-SMA阳性HSC较少-/-注射LV和Ad-TRAIL后的小鼠，表明在这些动物中HSC活化较少（图6b，bar=50μm）。在接受Q-VD-OPH治疗的野生动物中，可以看到α-SMA阳性的HSC。对wt和NOX2的肝组织进行实时PCR-/-在上述实验中，小鼠使用α-SMA、胶原IA1和TGF-β1特异性引物。在wt-Ad-TRAIL加LV注射小鼠中，纤维素酶相关转录物的表达增加，而在NOX2中未检测到增加-/-动物（*p<0.05，**p<0.01）。在Q-VD-OPH治疗的体重动物中，α-SMA表达的增加显著低于载体治疗的体重小鼠（*p≤0.05），胶原蛋白IA1和TGF-β1水平也显著降低（*p＜0.05）。数据表示为折叠对照（对照小鼠，未注射）。

NOX2可降低肝纤维化-/-老鼠

为了进一步研究体内上述发现的相关性，BDL在wt和NOX2中进行-/-老鼠。我们选择BDL作为纤维瘤诱导方法，作为四氯化碳（CCl4)和硫代乙酰胺（TAA）诱导的肝损伤导致显著的氧化应激和肝细胞坏死，这可能会混淆数据。3周后处死动物，如果出现NOX2-/-手术后6周，对小鼠的肝脏标本进行苦味酸染色，以评估纤维化阶段（实验组动物在BDL后6周无法存活）。BDL对wt和NOX2的影响相似-/-肝脏，表现出相同程度的炎症（2级）和胆管增生（数据未显示），以及凋亡（TUNEL分析，数据无显示）。我们在NOX2中发现-/-与BDL后的wt动物相比，动物的纤维化阶段显著降低(图7A b、c、d). 检测血清中的ALT和胆红素值，我们发现BDL动物的ALT与胆红素均升高（*p<0.05）；（重量和NOX2-/-，ALT在NOX2中稍低-/-尽管没有统计学意义）。为了阐明HSC和Kupffer细胞在其NOX2表达方面对肝纤维化的相对贡献，给BDL小鼠注射GdCl三在整个实验过程中，抑制巨噬细胞。GdCl的纤维化分期较低三-BDL后注射wt动物与注射PBS的对照组比较(图7B a，与相比图7A，b)，与以前的数据一致21为了评估胶原蛋白表达和肝胶原蛋白含量，在所有实验条件下进行实时PCR和OH脯氨酸分析。NOX2中胶原表达（55%±6.8，**p≤0.01）和OH-脯氨酸掺入（63%±9.5，*p<0.05）显著降低-/-将小鼠与服用BDL的wt动物进行比较。在GdCl中三-与PBS注射BDL动物相比，注射BDL wt小鼠的胶原蛋白IA1的表达和OH-脯氨酸的掺入都有一定程度的降低（24%±2.3，*p<0.05，42%±5.6，*p<0.05）。然而，wt动物（白条）巨噬细胞受到抑制后，纤维生成活性的下降并没有达到NOX2中观察到的低水平-/-动物（黑条），表明表达NOX2的HSC可能在肝纤维化中起主要作用。

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NOX2可降低肝纤维化-/-老鼠

（A）重量或NOX2-/-将小鼠胆管结扎（BDL），然后在3周后处死（如果是一些NOX2-/-6周后的小鼠）。Picrosius染色评估纤维化阶段。NOX2中-/-与BDL后的wt动物相比，纤维化阶段的动物明显更低（图7A b、c、d）。二氧化氮-/-与野生动物相比，小鼠存活时间更长，纤维化更少（图7A、b、d）。体重和NOX2中的ALT和胆红素值均增加-/-BDL动物（*p<0.05）。（B）接受BDL的小鼠注射GdCl三在整个实验中，抑制巨噬细胞功能。GdCl中的纤维化减少三-BDL后注射wt动物（图7B，a）与注射PBS的对照组（图7A，b）相比，NOX2没有明显变化-/-肝脏，棒材=50μm。使用胶原蛋白IA1特异性引物和OH-脯氨酸掺入试验进行实时PCR，以评估所有样本中的胶原蛋白量。NOX2中-/-与体重为BDL的动物相比，BDL小鼠胶原IA1的表达（**p≤0.01）和OH-脯氨酸掺入显著降低（*p<0.05）。与PBS注射动物相比，抑制巨噬细胞降低了重量级BDL动物中胶原蛋白IA1的表达（*p<0.05）和OH-脯氨酸掺入（*p<0.05-/-BDL小鼠。以GdCl计三-注射小鼠的ALT值总体低于PBS注射小鼠（*p<0.05），然而，GdCl之间的值三-注入重量和NOX2-/-动物之间没有显著差异。

讨论

在这项研究中，我们已经表明1）凋亡肝细胞的吞噬作用是直接促纤维化的体内，2）促纤维化作用由NOX2和3）NOX2介导-/-动物已经减少了纤维化。凋亡细胞的吞噬作用对维持组织内环境稳定至关重要。根据目前的概念，在生理环境中吞食AB是抗炎的22然而，在病理情况下，如以肝细胞持续凋亡为特征的慢性肝病，非专业吞噬细胞如HSC开始吞噬凋亡细胞。非髓系细胞能吞噬细胞的概念并不新颖：有人认为上皮细胞23或间充质细胞24我们已经证明HSC可以吞噬凋亡的肝细胞，并通过ROS介导的胶原生成直接诱导成纤维反应。这一过程的关键是吞噬细胞NADPH氧化酶NOX2的激活。与NOX2作用相关的一个重要因素是CGD患者的肝脏疾病，NOX2组分（最常见的是gp91phox）发生突变。在这些患者中，肝脏受到反复感染、血管异常的影响，最终可能发展为非肝硬化门脉高压症25这些患者在面对慢性炎症时不会发生肝纤维化，这一事实令人感兴趣，并表明NOX2在肝纤维化形成中的重要作用。此前，Bataller等人的优雅研究表明，NADPH氧化酶的激活对血管紧张素II诱导的肝纤维化的形成确实是必要的13在这些研究中，p47phox-/-使用小鼠，一种已知的亚单位是NOX1和NOX2的组织者26NOX2缺乏会增加CCl中的肝细胞损伤（主要是坏死）4-诱导的纤维化模型，胶原表达上调，但有趣的是，纤维化减少27在该模型中，基质金属蛋白酶2（MMP2）和9在NOX2中的表达增加-/-动物被认为可以减少纤维化。CCl公司4已知可通过脂质过氧化诱导ROS介导的肝损伤（独立于NOX），并导致坏死。因此，与我们的模型相比，肝损伤的机制是不同的，ROS的产生是一个结果，而不是导致持续的细胞凋亡和HSC激活。

已知ROS在HSC激活中起关键作用15,28.H型2O（运行）2来源于肝细胞诱导的HSC胶原转录15我们已经证明，NOX衍生的ROS在HSC中诱导生存途径，有助于激活HSC的增殖5在这里，我们证明NOX2激活和过氧化物生成直接导致HSC中胶原αI启动子的诱导。NOX2激活的一个重要推论是Rac1，它是酶的一个基本亚单位，也是吞噬作用的一个积极调节器。Rac1的组成性激活导致加速肝纤维化，强调Rac1在ROS介导的肝损伤中的作用10Rac1在纤维形成过程中对淋巴细胞的吞噬作用起重要作用29在我们的研究中，我们发现NOX2中Rac1向膜的易位受损-/-HSC，与之前的报告一致30因此，NOX2吞噬体部位GTP-结合的Rac1减少-/-细胞可能转化为效率较低的吞噬。这与NOX2中胶原蛋白启动子活化的减少一起-/-HSC可能转化为纤维生成活性的显著降低。由于吞噬作用可能代表纤维形成的早期“起始”事件，因此有必要重述这一点体内在我们的模型中，TRAIL介导的肝细胞凋亡在wt小鼠中诱导α-SMA和胶原IA1和TGF-β1的产生。虽然凋亡细胞的吞噬作用是一种直接的促纤维化刺激，但我们不能排除该模型中纤维化的其他机制。细胞死亡增加也可能导致损伤相关分子模式（DAMP）介导的肝损伤和HSC激活通过toll样受体（TLR）。CpG-DNA-介导的TLR9对HSC的诱导及其随后的激活证实了这一点31.在NOX2中-/-小鼠未发现成纤维活性，证实NOX2在早期纤维化中的作用。由于Kupffer细胞表达NOX2，因此必须解决其在早期纤维化中的作用。为了抑制Kupffer细胞，我们使用了GdCl三在整个BDL实验过程中，避免巨噬细胞重新聚集。我们在GdCl中发现三-治疗3周后，wt动物的纤维化和胶原蛋白生成减少，但没有达到BDL NOX2中几乎基线水平的胶原蛋白生成-/-老鼠。这表明除了巨噬细胞外，HSC通过其NOX2的表达和活性是早期纤维生成事件的重要因素。肝脏中的其他细胞也可能导致肝纤维化通过它们的NOX2活性，这可能是未来研究的重点。我们的主要目标是研究纤维化的早期始发事件。然而，在纤维化的后期传播阶段，NOX2也可能被炎症介质或细胞因子（如血管紧张素II、瘦素或PDGF）激活，从而进一步加速ECM的生成。

总之，根据我们的在体外和体内数据显示，NOX2是肝纤维化的中心酶。当凋亡细胞的吞噬作用是主要促纤维化事件之一时，在纤维生成的起始阶段尤为重要。靶向抑制NOX2激活可能被证明是一种强有力的新策略，可以抑制多种促纤维生成途径并阻止疾病进展。

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供应数据

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确认

我们要感谢Gregory Gores博士（梅奥医学院）提供Ad-TRAIL构建，并感谢Mark Zern博士（加州大学戴维斯分校）和Antonia Follenzi博士（阿尔伯特·爱因斯坦医学院）供应慢病毒载体。

拨款支持：本研究得到了NIH DK069765、DK080715 DK083283（NJT）和ALF十月后研究奖（JXJ）的支持。

缩写

HSC公司肝星状细胞
转化生长因子-β1转化生长因子-β1
AB公司凋亡小体
ASMA公司α-平滑肌肌动蛋白
NADPH氧化酶还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶
TAMRA公司羧基四甲基罗丹明琥珀酰酯
巴西存托凭证胆管结扎术
CGD公司慢性肉芽肿性疾病

脚注

披露：无需披露

工具书类

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