介绍
膦盐具有广泛的用途,在化学、生物学和药理学中都有应用。三苯基膦很容易与醇、卤代烷和羧酸反应,产生多种化学实体,这支持了它们的广泛适用性。最初,鏻盐被用于制备磷叶立德,这是威蒂希烯烃合成方法中的一种重要成分。[1]作为生物研究的试剂,四苯基鏻的亲油阳离子特性首次用于证明线粒体膜上存在电化学电位。[2]带电分子在没有转运蛋白的帮助下通常无法穿过细胞膜,因为与去除相关水分子相关联的活化能很大。电荷在鏻离子大的亲脂表面上的分布显著降低了这种能量需求,促进了脂质膜的通过。[3]因此,由于高负膜电位,鏻盐在带电线粒体中积聚。根据这一观察,三苯基鏻离子被用作靶向部分,用于将诸如自旋陷阱、荧光染料和抗氧化剂等试剂输送到分离的线粒体以及完整细胞和整个生物体的线粒体。作为药物,某些鏻盐已证明对革兰氏阴性和阳性细菌及寄生虫具有抗菌活性T.cruzi。动物模型中的抗血糖特性以及细胞和动物系统中的抗增殖活性。[4],[5],[6],[7]作为抗癌药物,鏻盐在肿瘤的诊断和治疗方面显示出巨大的前景。由于尚不完全清楚的原因,许多实体瘤与正常肿瘤相比线粒体膜电位更负。[8]这种特性可以被利用,以允许选择性地传递到肿瘤细胞,同时保留正常细胞用于治疗和成像目的。1978年,在对合成中间体进行常规筛选后,首次报道了抗增殖活性的证据。[9]在这些筛选中,异吲哚烷基鏻盐显示出强大的抗白血病活性。最近,据报道,一些鏻盐在一些癌症细胞系和卵巢癌异种移植模型中显示出抗增殖活性,这是基于它们破坏线粒体超微结构和改变细胞脂质含量的能力。[7],[10],[11],[12]鏻盐作为诊断成像造影剂的研究[13],[14]阐明了这类化合物选择性的两个关键点:1)这些试剂能够优先在肿瘤细胞内积累,2)鏻离子本身不具有细胞毒性。
在此,我们描述了一系列含有三苯基膦部分的新型化合物,这些化合物在一组癌细胞系中表现出显著的活性。其中两种化合物在小鼠异种移植模型中进行了测试,显示出显著的体内疗效,没有明显的毒性。在基于细胞的模型中,这些化合物的进一步分子特征表明其作用机制包括线粒体定位、氧气消耗减少、超氧物生成增加和生长因子信号减弱。
结果
TP化合物在一组人类癌细胞系中具有细胞毒性
我们有一个由大约40000个化学实体组成的高度多样化的小分子库。在本研究中,预测了10000种化合物的子集生物信息学具有良好的类药物特性在体外研究。在一组不同来源的癌细胞系中,使用高通量96-well格式的基于MTT的细胞毒性试验进行初步筛选,以识别活性化合物。该筛选方法确定了先导化合物TP187和TP197,在低微摩尔范围内具有细胞毒性。集成电路50MTT分析中获得的值列于这些结果在使用HCT116 p53+/+细胞进行的集落形成试验中得到了进一步证实,HCT116的p53+/+细胞经增加浓度的TP187、197和类似物TP421处理(). 所有三种TP化合物均显示IC50在MTT中测试的大多数细胞系的低微摩尔范围内的值()以及HCT116 p53+/+集落分析()因此,在基于细胞和动物的模型中选择和进行进一步分析。
TP化合物降低细胞增殖并诱导细胞周期阻滞,与p53状态无关。(A) 铅化合物TP187、197和421的结构。(B) 使用HCT116 p53+/+细胞进行集落形成分析,在记录的浓度下用TP化合物连续处理7天。细胞被处理成三份,结果代表了三个单独的实验。用1µM TP化合物处理长达72 h的碘化丙啶染色MDA-MB-435(C)、HCT116 p53+/+(D)和HCT116 p53−/-(E)细胞系,分析DNA含量。浅灰色条表示G0/G公司1分数,深灰色条表示S相细胞,黑色条表示G相细胞2/细胞周期的M期。
表1
TP化合物在各种癌细胞系中的细胞毒性。
细胞系 | 集成电路50
|
| TP187型 | TP197型 |
MDA MB 435数据库 | 0.8 ±0.1 | 0.8±0.1 |
MDA MB 361数据库 | 12.0±0.1 | 0.8±0.1 |
MDA MB 231型 | 2.2±0.1 | 1.0±0.1 |
PC3公司 | 1.7±0.1 | 0.7±0.1 |
DU145型 | 11±0.1 | 1.2±0.1 |
英国电信474 | >20±0.1 | 0.6±0.1 |
T47D型 | 1.0±0.1 | 0.4±0.1 |
CAMA1公司 | 10±0.1 | 1.4±0.1 |
MCF7型 | 0.8±0.1 | 1.3±0.1 |
NCI美国存托凭证 | >20±0.1 | 2.0±0.1 |
HCT116 p53型+/+ | 0.4±0.1 | 0.4±0.1 |
HCT116 p53−/− | 1.3±0.1 | 1.3±0.1 |
HOP92型 | 6.0±0.1 | 1.5±0.1 |
TP化合物阻止人类肿瘤细胞系的细胞周期进展
在用1µM TP187处理24–72 h的乙醇固定碘化丙啶染色肿瘤细胞系上进行流式细胞术,以研究TP化合物对细胞周期进展和DNA含量的影响。TP187从24小时治疗开始,阻止了所有细胞系的细胞周期进展。()MDA-MB-435是一种p53突变细胞系,因TP187治疗而被阻滞在细胞周期的S期。()HCT116 p53+/+()和HCT116 p53−/−()TP187处理后,p53活性细胞系和缺陷细胞系均在细胞周期的G2/M期出现细胞周期阻滞。这些对细胞周期进展的影响持续了72小时。基于这些结果,我们认为其作用机制与p53状态无关。
TP化合物抑制体内肿瘤生长
接下来,我们在裸鼠异种移植物模型中测试了TP类似物187、197和449,以确定体内这些化合物的功效。与溶媒对照组相比,用TP化合物作为单一药物治疗MDA-MB-435异种移植物可显著抑制TP187和TP197治疗组的肿瘤生长。()从第13天开始,与对照组相比,TP187和197治疗小鼠的肿瘤体积存在显著差异。(TP187;p<0.05,TP197;p<0.05)TP187和197的抑制作用在整个治疗过程中保持不变(在第33天TP187,p=0.003和TP197;p=0.04)。在第33天结束治疗后,载体治疗的肿瘤平均肿瘤体积增加了1149%,而TP187和197治疗组的平均肿瘤体积分别增加了不到373%和573%。TP449治疗也抑制了肿瘤生长,但统计分析显示p值大于显著值。(TP449;p>0.05)。
TP化合物在无全身毒性的小鼠异种移植模型中抑制肿瘤生长、降低细胞增殖并诱导caspase 3裂解。(A) 图表显示了实验过程中各治疗组的平均肿瘤体积。每周给药五次载体对照(绿色方块)和TP187(红色三角形),每周给药三次TP197(开放紫色三角形)。每隔一天服用紫杉醇(蓝色闭合圈),为期15天。每周测量三次肿瘤体积,误差线代表SEM。(B)从载剂和TP187治疗小鼠收集的H&E染色器官组织的代表性显微照片。(C) ●●●●。对取自载瘤体和TP187处理小鼠的肿瘤切片进行免疫组织化学染色。与对照组相比,TP187治疗组小鼠的Ki67染色(上部)显著降低。与载体治疗的肿瘤相比,TP187治疗的肿瘤切片中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3裂解(中间)增加。中间面板显示肿瘤切片的H&E染色。缩微照片是三个独立实验的代表。(D) ●●●●。图表显示了每个治疗组中三只单独的小鼠的10个随机高功率场的平均Q值。Q评分是一种半定量的组织评分方法,它考虑了给定组织样本中阳性染色细胞的百分比和强度。TP187治疗的肿瘤切片的Q值显著降低(p<0.001)。显微照片和Q值是三个独立实验的结果。
TP处理的小鼠没有药物相关毒性的迹象
每天通过目视检查对小鼠进行监测,每周称重三次,以检测药物相关毒性症状。在整个33天的治疗过程中,经TP-治疗的小鼠没有表现出药物相关毒性的外观迹象,如不适、虚弱或嗜睡。TP197最初以类似剂量给药,但由于第一周内体重略有下降(<10%体重),治疗被修改为每周三次,剂量为10 mg/kg。在剂量调整后不久,TP197治疗的小鼠体重恢复增加,到实验结束时,体重与对照组相似。尽管给药剂量有所减少,但TP197仍保持其抑制肿瘤生长的功效。
除日常健康检查外,在献祭时(第33天)采集器官样本,以在细胞水平评估潜在的药物相关毒性。从所有治疗组的小鼠脑、心、肺、肝、肾、胰腺和脾脏获取组织样本。随后将这些样品固定在10%中性缓冲福尔马林中,石蜡包埋并用H&E染色以进行组织学分析。对这些组织切片的仔细检查表明,与对照小鼠相比,从TP-处理的组织样品中未发现组织学异常。对比取自对照组和TP187治疗组小鼠的肝、肾、脑和脾组织切片的典型显微照片见.
TP187减少肿瘤异种移植物中增殖细胞的数量并诱导caspase-3裂解
TP187治疗对肿瘤生长的抑制促使我们检查肿瘤切片中的组织学标记物,以验证我们的体内结果。对福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤切片进行免疫组织化学染色(IHC),这些切片是从载体和TP187处理的处理小鼠中收集的,以评估处理对细胞增殖和凋亡的影响。按照方法部分所述处理肿瘤切片,并使用Ki-67抗体和裂解caspase-3进行探测。
Ki-67是一种细胞周期相关蛋白。它只存在于活跃的循环细胞中,是鉴别组织样本中增殖细胞比例的理想标记物。Ki-67在快速分裂的细胞群中表达增加,Ki-67染色的程度和强度与许多实体瘤的预后和治疗反应相关。[15],[16]Ki67的表达在所有TP187治疗的肿瘤切片中几乎不存在。Ki-67染色减少的典型显微照片如所示,上部面板。使用组织评分的半定量方法评估Ki-67的表达表明,与载体处理的异种移植物相比,用TP187处理MDA-MB-435异种移生物,Ki-67染色显著降低(p<0.001)(). 这一结果与观察到的肿瘤生长抑制有很好的相关性体内.
接下来,我们试图确定我们的化合物是否能诱导细胞死亡体内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶是半胱氨酸特异性蛋白酶,经上游蛋白酶裂解后,在凋亡细胞死亡途径中发挥作用。Caspase 3是一种下游执行子Caspase,在细胞凋亡的内源性和外源性途径中都很常见。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的裂解是细胞凋亡过程中一个晚期且不可逆的事件,因此可作为导致细胞死亡的两种主要凋亡途径的标记。[17]与车用治疗相比,TP187治疗的肿瘤切片显示抗裂解caspase 3抗体的细胞质染色增加(,中间面板)。
我们的免疫组织化学研究显示,在TP化合物治疗后,Ki-67染色显著减少,caspase 3裂解增加。综上所述,这些结果表明了一种机制,作用于细胞增殖和死亡途径的效应器,两者共同能够抑制肿瘤生长体内.
TP化合物定位于线粒体
取得了良好的效果体内促使我们进一步研究TP介导的肿瘤抑制的分子机制,并确定TP作用的潜在靶点。为此,我们选择首先研究TP化合物的亚细胞定位,以缩小可能的靶标范围。TP化合物中常见的三苯基鏻部分具有离域电荷和亲脂特性,有利于线粒体积累。[3],[18]因此,我们利用类似物TP421的荧光特性测试了我们的化合物是否可以优先在线粒体中积累。我们使用稳态荧光光谱仪进行荧光光谱分析,以确定最佳激发和发射波长。TP421的最佳激发波长为396 nm。在450 nm和573 nm处观察到几乎相似强度的激发峰()450nm具有稍高的峰值强度。
利用TP421的荧光特性确定细胞摄取和定位。上面板,TP421的最佳激发光谱和发射光谱分别为396 nm和450 nm,这是使用稳态荧光光谱测定的。该图显示了TP421的发射光谱。中间面板,TP421摄取可通过流式细胞仪监测。直方图显示了TP421处理前后在激发355 nm和发射450 nm处测得的荧光强度。TP421处理细胞的胞浆显微镜显示亚细胞定位,提示线粒体积聚。线粒体超氧化物的产生是TP作用中一个早期且持续的事件。用5µM TP197处理MDA-MB-435细胞,并使用线粒体超氧化物产生的荧光指示剂MitoSOX Red测量不同时间点的超氧化物产生。(D) 柱状图叠加显示了早期TP治疗的效果。超氧化物的产生早在处理后10分钟(深蓝色线)就增加了,并在处理后20分钟(紫色线)、30分钟(橙色线)、60分钟(棕色线)和120分钟(绿色线)保持相似的水平。用500 nM紫杉醇(橄榄线)处理后,超氧化物水平的增加并没有超过溶媒(固体红)处理细胞中的水平。(E) 在以后的时间点,超氧化物的产量会增加。TP197处理后3 h(深蓝色线)、6 h(紫色线)、18 h(橙色线)和24 h(棕色线)测定TP-诱导的超氧化物产生。与溶媒(固体红)和紫杉醇(橄榄线)对照组相比,TP197导致超氧物生成显著增加。
基于激发/发射光谱,我们能够使用基于荧光的测定来测量TP421的摄取。用5µM TP421处理MDA-MB-435细胞,并使用355 nm紫外激光作为激发源和能够捕获450 nm范围内发射的滤光片通过流式细胞术进行分析。用5µM TP421处理的MDA-MB-435细胞的荧光强度急剧增加()与用同等体积的二甲基亚砜处理的细胞相比。添加TP421后,荧光强度立即增加,15分钟后趋于稳定状态(数据未显示),这表明TP吸收很快,可能是由于三苯基鏻部分的亲脂性和离域电荷。
接下来,我们用荧光显微镜检查了TP421的亚细胞定位。用TP421处理后,用MitoSOX红培养MDA-MB-435细胞。MitoSOX-Red是一种促线粒体探针,在510和588 nm的激发和发射波长下显示荧光。共同处理的MDA-MB-435细胞的荧光显微镜显示,使用适用于每个探针的滤镜显示出类似的染色模式,表明TP421确实定位于线粒体().
TP化合物增加线粒体超氧化物生成
通过氧化磷酸化产生能量是线粒体的主要功能。众所周知,抑制氧化磷酸化机制的成分会导致超氧化物离子的生成增加。[24],[25]因此,TP化合物的线粒体定位使我们研究了超氧物生成作为我们的化合物可能的作用机制。
为了研究TP处理对线粒体超氧化物生成的影响,我们用5µM TP197处理MDA-MB-435细胞,处理时间不同。在治疗结束时,用5µM的MitoSOX红培养细胞,并通过流式细胞仪测量与产生超氧物相对应的荧光强度变化。为了排除我们的观察结果可能是异种治疗产生非特异性活性氧的结果,我们还纳入了用紫杉醇处理的MDA-MB-435细胞。
使用这种荧光线粒体超氧化物指示剂,我们发现TP197处理导致线粒体超氧化物的产生增加。用5µM TP197处理MDA-MB-435细胞,并在10分钟到24小时的不同时间点收集。显示平均荧光强度的直方图叠加如所示在治疗后10分钟的时间点观察到超氧物生成激增,在治疗后3小时达到最大强度,在TP197治疗后24小时内保持增加(). 测量TP187和TP421处理的MDA-MB-435细胞在0.5和1、6和24小时的时间点的超氧物生成也获得了类似的结果(数据未显示)。相反,紫杉醇治疗对线粒体超氧化物的产生没有影响,因为与载体对照组相比,荧光强度没有变化。
TP化合物降低细胞耗氧速率
根据观察到的线粒体中TP化合物的优先积累和随后的超氧物生成,我们选择研究这可能对线粒体呼吸产生的影响。为此,我们使用XF 24细胞外通量分析仪实时测量了耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)。用TP187、TP197、TP421或DMEM对照处理MDA-MB-435细胞,然后依次添加寡霉素、ATP合成酶抑制剂、FCCP、解偶联剂和复合I抑制剂鱼藤酮。在7小时的短时间内测量OCR和ECAR。
TP化合物以剂量依赖的方式降低细胞耗氧量(数据未显示)。用TP187、TP197和TP421处理MDA-MB-435细胞后,耗氧率稳步下降(). TP-induced decrease in OCR is superative through through 7h time course and is unfectived by treatment with The variable metabolic inhibitors.TP-inducted decreated in OCR在整个7 h过程中持续下降,且不受各种代谢抑制剂治疗的影响。添加寡霉素后,载体处理细胞的耗氧速率下降,与TP处理细胞的消耗速率相似。同时,TP处理细胞中的OCR不受添加寡霉素的影响。FCCP使线粒体呼吸与ATP合成脱钩,导致载体处理的细胞耗氧量大幅飙升,但TP处理的细胞对FCCP处理完全没有反应。将鱼藤酮添加到载体处理的细胞中,完全消除了FCCP诱导的OCR峰值,将OCR降低到与单独TP处理相似的水平。鱼藤酮并没有降低TP处理的MDA-MB-435细胞中已经很低的OCR水平。OCR的快速持续下降表明TP化合物降低了氧化磷酸化的效率。
TP处理的MDA-MB-435细胞的耗氧量降低。使用XF 24细胞外通量分析仪测量OCR和ECAR。添加TP化合物导致OCR降低,同时ECAR增加。观察到的OCR降低不受添加ATP合成酶抑制剂、解偶联剂或复合物I抑制剂的影响。[端口A:TP化合物(5µM),端口B:寡霉素(0.005 mg/mL),端口C:FCCP(1µM。
TP187、TP197和TP421引起的OCR下降伴随着ECAR的增加。()TP187治疗使ECAR稳步增加,大约在治疗后1小时达到峰值,此后,ECAR稳步下降,但在所有相应时间点仍高于对照值。添加TP197导致ECAR快速增加,治疗后15分钟ECAR瞬时下降,立即恢复,治疗后约75分钟达到峰值,随后ECAR持续稳定下降。TP421导致ECAR急剧增加,在治疗后约25分钟达到峰值,并呈持续下降趋势。用寡霉素处理的对照细胞ECAR率增加,而用TP421处理的细胞ECAR最初下降,很快恢复到TP421治疗基线时的水平。寡霉素对TP处理细胞的ECAR率无影响。解偶联剂FCCP增加了对照细胞的ECAR。TP治疗导致ECAR短暂下降,很快恢复到仅用TP治疗时的水平。鱼藤酮使对照细胞的ECAR略有下降,但对TP处理的细胞几乎没有影响。
利用抗体芯片进行TP作用机制的蛋白质组学分析
为了进一步了解我们的化合物的作用机制,我们试图研究它们对MDA-MB-435细胞中信号蛋白的整体影响。为此,我们使用了Kinex™KAM-1.1抗体微阵列。这些抗体阵列能够检测磷酸化状态或近600个特征良好的蛋白质的总丰度的变化,这些蛋白质代表细胞总蛋白质组的一部分。具体而言,我们的样本针对378个泛特异性(测量总蛋白丰度)和273个磷酸特异性抗体进行了筛选。
用溶媒对照或TP421处理MDA-MB-435细胞24小时,然后收集、裂解并送去分析。我们选择化合物TP421,因为初步筛选显示它是用于蛋白质组学实验的MDA-MB-435细胞系中最有效的类似物。迄今为止获得的所有信息都表明,类似物具有相同的作用机制,尽管观察到适度的细胞类型特异性敏感性。因此,使用TP421获得的蛋白质组学筛选结果扩展到TP187和TP197。
在芯片结合抗体检测的近400个蛋白质组中,103个蛋白质在TP421处理后的丰度或磷酸化状态发生了显著变化。这些蛋白质识别对TP421敏感的潜在信号通路,也可能对其类似物TP187和TP197敏感。
TP421及其类似物影响参与关键细胞功能的蛋白质
TP处理后,其表达或转录后修饰发生显著变化的蛋白质以及相对于对照处理细胞的折叠变化列于,和有趣的是,许多受到显著调控的蛋白质是调节细胞增殖、粘附、细胞内生存信号、代谢和基因转录的过程或信号转导途径中的关键效应器。TP421治疗24小时后,参与细胞周期进入和/或进展的蛋白质的丰度或磷酸化显著改变:CDK1、CDK7、CDC25B、p21CDK1L、cyclin D1、cyclin-A1、cyclinE1、PAK3、RB(T821)和p73;局部粘连和细胞骨架组织:ILK1、paxillin 1、ROCK1、caldesmon、FAK(S722)、Pyk2(S579)、cofilin(total和S3)、vinculin(Y821)、LIMK 1/2(Y507/T508、Y504/T505);受体酪氨酸激酶:VEGFR2(Y1054)、IR(Y999)、c-Kit(Y936)、PDGFRa(Y742);细胞内信号激酶和效应器:PKA-Ca/b、CAMK2g、CASK/Lin2、RIP2/RICK、SIRPa1、CAMK2a(T286)、PAK 1/2/3(S144/S141/S154)、PKCβ1/2(T500)、PKC-φ(T655)、PKC-γ(T674)、PKC/δ(Y313)、RSK1/2(S363/S369)和eNOS(T495);细胞存活和凋亡:PKB(S473)和JNK(T183+Y185);细胞增殖和分化:MEK3b、MEK1(S297、T385)和MEK2(T394);转录调节因子:STAT3、STAT6、STAT2(Y690)和c-Jun(S73);能量感应、葡萄糖代谢和转录激活:丙酮酸激酶2、腺苷酸激酶2,PCK2、mTOR(S2448)、eIF4E(总量&S209)、eEF2a(S51)。此外,TP处理增加了几个关键细胞内磷酸酶的表达,包括:PP1、PP2a、PP2CδPP4/A'2、PP5C、PTP1C和PAC1,并降低了分子伴侣HspBP1、Hsp60和Grp78的表达。
表2
TP421蛋白质组学筛选总丰度因TP421处理而降低的蛋白质的结果。
蛋白质名称 | 蛋白质全名 | 折叠更改 |
热休克蛋白BP1 | Hsp70结合蛋白1 | −3.44 |
CK1e公司 | 酪蛋白激酶1ε | −3.02 |
CDK1(CDC2) | 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶1 | −2.62 |
Csk公司 | Src酪氨酸激酶的C末端 | −2.60 |
DAPK1型 | 死亡相关蛋白激酶1 | −2.52 |
细胞周期蛋白D1 | 细胞周期蛋白D1(PRAD1) | −2.24 |
中国科学院 | 细胞凋亡敏感蛋白(CSE1L) | −2.14 |
PKCa公司 | 蛋白激酶Cα | −2.10 |
抄送25B | 细胞分裂周期25B磷酸酶 | −2.04 |
热休克蛋白60 | 热休克60kDa蛋白1(伴侣蛋白,CPN60) | −1.94 |
SIRPa1号机组 | PTP1D磷酸酶(SHPS1)的信号调节蛋白底物 | −1.90 |
ALS2CR7(PFTAIRE2) | 肌萎缩性侧索硬化症2染色体区域候选基因蛋白-丝氨酸激酶7 | −1.83 |
组78 | 葡萄糖调节蛋白78 | −1.79 |
FasL公司 | 肿瘤坏死因子配体,成员6 | −1.74 |
PKA钙/硼 | cAMP依赖性蛋白激酶催化亚单位α/β | −1.72 |
凸轮2g | 钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶2γ | −1.59 |
ANKRD3公司 | 锚蛋白重复结构域蛋白激酶3(RIPK4,DIK) | −1.56 |
CASK/Lin2号机组 | 钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(Lin2同源物) | −1.54 |
HO1型 | 血红素加氧酶1 | −1.52 |
第21页CDKI1 | 细胞周期素依赖性激酶抑制剂1(MDA6) | −1.50 |
ILK1(ILK1) | 整合素相关蛋白-水氨酸激酶1 | −1.49 |
PCK2系列 | 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 | −1.46 |
CDK1(CDC2) | 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶1 | −1.45 |
细胞周期蛋白 | 细胞周期蛋白A1 | −1.42 |
抄送34 | 细胞分裂周期34(泛素结合连接酶) | −1.39 |
AK2公司 | 腺苷酸激酶2抗体 | −1.39 |
第73页 | 肿瘤抑制蛋白p73 | −1.38 |
LATS1型 | 大肿瘤抑制蛋白1激酶(WARTS) | −1.37 |
CDC2L5(CHED) | 细胞分裂周期2样蛋白丝氨酸激酶5 | −1.35 |
PAK3系列 | p21-活化丝氨酸激酶3(β) | −1.34 |
表3
TP421蛋白质组学筛选总丰度因TP421处理而增加的蛋白质的结果。
蛋白质名称 | 蛋白质全名 | 折叠更改 |
PAC1项目 | 双特异性MAP激酶蛋白磷酸酶 | 1.27 |
STAT3(状态3) | 信号转导和转录激活因子3(急性期反应因子) | 1.28 |
SPHK2项目 | 鞘氨醇激酶2 | 1.31 |
MEK3b(MAP2K3) | MAPK/ERK蛋白激酶3β亚型(MKK3β) | 1.32 |
小泡蛋白2 | 小泡蛋白2 | 1.32 |
川东北7 | 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶7 | 1.35 |
PP1/Cg | 蛋白质丝氨酸磷酸酶1-催化亚基-γ异构体 | 1.35 |
PKG1系列 | 蛋白激酶G1(cGMP依赖性蛋白激酶) | 1.38 |
帕西林 | 帕西林1 | 1.39 |
IKKg/NEMO公司 | I-κB激酶γ/NF-κ-B必需调节剂(NEMO) | 1.39 |
RIP2/RICK公司 | 受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(RIPK2) | 1.39 |
PKCq公司 | 蛋白-胺激酶Cθ | 1.43 |
泰罗3 | 酪氨酸蛋白激酶受体TYRO3 | 1.44 |
DRAK2(DRAK2) | DAP激酶相关凋亡诱导蛋白-血红素激酶2(STK17B) | 1.45 |
肌动蛋白解聚因子 | 科菲林1 | 1.47 |
NT5E公司 | Ecto-5′-核苷酸酶(CD73抗原) | 1.47 |
电子IF4E | 真核翻译起始因子4(mRNA帽结合蛋白) | 1.48 |
PP5C型 | 蛋白质丝氨酸磷酸酶5-催化亚基(PPT) | 1.50 |
周期素 | 细胞周期蛋白E1 | 1.50 |
无1 | Bcl2/腺病毒E1B 19kD-相互作用蛋白1 | 1.51 |
ICK公司 | 肠细胞蛋白激酶(MAK-related kinase,MRK) | 1.52 |
PP4/A'2 | 蛋白-碱性磷酸酶4-调节亚单位(PPX/A'2) | 1.52 |
第1部分 | 聚[ADP-核糖]聚合酶1(ADPRT) | 1.54 |
哈斯平 | 单倍体生殖细胞特异性核蛋白-碱激酶 | 1.55 |
PKM2(平方公里) | 丙酮酸激酶,同工酶M1/M2 | 1.60 |
TBK1型 | 罐结合蛋白1 | 1.62 |
IKKa公司 | NF-kappa-B蛋白丝氨酸激酶α抑制剂(CHUK) | 1.66 |
hHR23B型 | 紫外线激子修复蛋白RAD23同源物B | 1.74 |
Fyn公司 | Fyn原癌基因编码蛋白酪氨酸激酶 | 1.74 |
状态6 | 信号转导子和转录激活子6 | 1.75 |
PCTK1(PCTAIRE1) | PCTAIRE-1蛋白激酶 | 2.02 |
PP2Cd | 蛋白-碱性磷酸酶2C-催化亚基-δ亚型 | 2.05 |
PTP1C(PTP1C) | 蛋白质酪氨酸磷酸酶1C(SHP1,SHPTP1) | 2.12 |
红外 | 胰岛素受体β链 | 2.18 |
极光A(AIK) | 极光激酶A(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶6) | 2.18 |
ROKb(火箭1) | Rho相关蛋白激酶1 | 2.21 |
PP2A/钙 | 蛋白-碱性磷酸酶2A-催化亚单位α亚型 | 2.59 |
表4
TP421蛋白质组学的结果筛选了磷酸化水平因TP421处理而改变的蛋白质。
蛋白质名称 | 磷酸化位点 | 蛋白质全名 | 折叠更改 |
CaMK2a公司 | T286型 | 钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶2α | −3.02 |
Lck公司 | 191日元 | 淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶 | −2.93 |
JNK公司 | T183+Y185 | Jun N末端蛋白激酶(应激激活蛋白激酶(SAPK))1/2/3 | −2.90 |
六月 | 第73页 | Jun原癌基因编码的AP1转录因子 | −2.68 |
MEK1(MAP2K1) | 297美元 | MAPK/ERK蛋白激酶1(MKK1) | −2.61 |
PKA钙/硼 | T197型 | cAMP依赖性蛋白激酶催化亚单位α/β | −2.11 |
VEGFR2(KDR) | 1054日元 | 血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶2(Flk1) | −1.96 |
组蛋白H3 | 表11 | 组蛋白H3.3 | −1.96 |
RSK1/2型 | S363/S369型 | 核糖体S6蛋白激酶1/2 | −1.93 |
红外(INSR) | 999年 | 胰岛素受体 | −1.92 |
组蛋白H3 | S28码 | 组蛋白H3.3 | −1.85 |
PAK1/2/3段 | 第144页/第141页/第154页 | p21活化蛋白-水氨酸激酶1/2/3 | −1.84 |
PKCb1/2 | T500型 | 蛋白激酶Cβ1/2 | −1.83 |
六月 | 第73页 | Jun原癌基因编码的AP1转录因子 | −1.83 |
PKBa(Akt1) | 第473页 | 蛋白激酶Bα | −1.81 |
文丘林 | Y821号 | 文丘林 | −1.77 |
套件 | Y936年 | 试剂盒/钢因子受体酪氨酸激酶 | −1.70 |
MEK2(MAP2K2) | T394电话 | MAPK/ERK蛋白激酶2(MKK2)(人) | −1.65 |
PKCh公司 | T655型 | 蛋白-胺激酶C eta | −1.61 |
电子表格2a | 第51页 | 真核翻译起始因子2α | −1.56 |
MEK1(MAP2K1) | T385型 | MAPK/ERK蛋白激酶1(MKK1) | −1.55 |
限制1/2 | Y507+T508/Y504+T505 | LIM结构域激酶1/2 | −1.52 |
电子号码 | T495型 | 一氧化氮合酶,内皮 | −1.49 |
FAK(传真) | 第722页 | 焦黏附蛋白酪氨酸激酶 | −1.44 |
加利福尼亚州 | S789系列 | 加利福尼亚州 | −1.42 |
MEK1(MAP2K1) | 297美元 | MAPK/ERK蛋白激酶1(MKK1) | −1.35 |
mTOR(法新社) | 2448美元 | 雷帕霉素的哺乳动物靶点(FRAP) | 1.25 |
STAT2(状态2) | Y690型 | 信号转导子和转录激活子2 | 1.27 |
电子IF4E | 2009年2月 | 真核翻译起始因子4(信使核糖核酸帽结合蛋白) | 1.27 |
陶(Tau) | 578美元 | 微管相关蛋白tau | 1.31 |
PKCg公司 | T674型 | 蛋白激酶Cγ | 1.35 |
PDGFRa公司 | Y742型 | 血小板衍生生长因子受体激酶α | 1.52 |
科菲林1 | 第3章 | 科菲林1 | 1.58 |
派克2 | 579日元 | 蛋白质酪氨酸激酶2 | 1.58 |
陶(Tau) | S738系列 | 微管相关蛋白tau | 1.75 |
PKCd公司 | Y313年 | 蛋白丝氨酸激酶Cδ | 2.05 |
陶(Tau) | 330英镑 | 微管相关蛋白tau | 2.26 |
卢比 | T821电话 | 视网膜母细胞瘤相关蛋白1 | 3.22 |
利用灵巧路径分析对TP作用机制进行统计分析
使用Ingenuity软件包(Ingenuiity Systems Inc.)对识别受影响蛋白质的数据进行进一步分析,以说明蛋白质相互作用网络,该网络是通过连接显示TP421治疗显著变化的蛋白质并将其与生物背景相关联而生成的。通过这种方式,可以仔细检查实验数据,了解与我们的化合物的作用机制相关的关系、机制、功能和途径。
另一个全球功能分析功能显示了关键的生物过程和途径,以可视化TP421治疗引起的肿瘤生物学潜在有趣的变化。此外,该软件还用于按显著性顺序对各种途径进行统计排序().
根据信号通路排列的蛋白质组数据的巧妙软件分析报告,按统计显著性排序。此处显示了总排名路径的子集。
在该软件排名的70多条通路中,排名靠前的是肝细胞生长因子信号通路(). 该途径很可能是TP421治疗的靶点,也可能是其类似物TP187和TP197。将我们的化合物添加到细胞后,此途径中的几个关键激酶和信号分子要么显著上调(见红色),要么下调(见绿色)。这种途径特别有趣,因为它向几个关键的下游效应器发出信号,这些下游效应器介导细胞存活、死亡、粘附和运动,以及细胞周期的进展,所有这些都对癌细胞增殖至关重要。对于该途径中受影响的一些蛋白质,总丰度发生了变化,而对于其他蛋白质,在TP421处理后,特定的磷酸化位点要么被日益磷酸化,要么被去磷酸化。对于后一种蛋白质,磷酸化对其功能的影响在.
排名靠前的HGF信号通路。在我们的微阵列结果中,绿色分子表达下调,而红色分子表达上调。磷酸化水平受TP421处理影响的蛋白质用*表示。
表5
TP421治疗影响肝细胞生长因子信号通路蛋白质的磷酸化位点。
蛋白质名称 | 磷酸化位点 | 对蛋白质功能的影响*
| 治疗后的褶皱变化 |
阿克特 | 第473页 | 激活磷酸化 | −1.81 |
FAK(传真) | S722型 | 未知 | −1.44 |
JNK公司 | T183+Y185 | 激活磷酸化 | −2.90 |
c-6月 | 第73页 | 激活磷酸化 | −2.68 |
MEK1型 | S297+T385型 | 诱导与ERK1/2的相互作用并调节酶活性 | −2.61 |
甲乙酮2 | 第394页 | 未知 | −1.65 |
PAK1/PAK2/PAK3 | S144/S141/S154 | 可能影响激酶活性 | −1.84 |
PKCβ1/2 | T500型 | 未知 | −1.83 |
蛋白激酶C亚性D型抗体 | Y313年 | 促进PKCδ的凋亡作用 | 2.05 |
蛋白激酶C亚型G抗体 | T674型 | 未知 | 1.35 |
PKC eta公司 | T655型 | 可能在介导PKC-eta信号事件中发挥作用 | −1.61 |
新型活性TP类似物的发现
基于TP187、TP197和TP421的活性,设计并筛选了另外700个含有三苯基鏻部分的结构类似物,以检测其在结肠癌细胞系HCT116 p53+/+中的细胞毒性。选择在10µM下显示50%以上细胞毒性的化合物,在五种癌细胞系(MDA-MB-435、MCF-7、PC3、HCT116 p53+/+和HCT 116 p53-/-)中进行进一步测试。具有IC的化合物50MTT分析中≤5µM的值显示在结果报告于随后通过菌落形成试验测试这些化合物的细胞毒性。除少数化合物外,在两次试验中获得的结果之间观察到良好的相关性。()这些结果表明,仅存在TP部分不足以产生细胞毒性。尽管筛选出了TP187、TP197和TP421的一些紧密类似物,但由于类似物之间的活性水平相似,我们无法确定类似物之间连贯的结构-活性关系。
TP 187、TP 197和TP 421的结构类似物。
表6
集成电路50一组癌细胞系中TP 187、TP 197和TP 421的结构类似物。
序号。 | 化合物 | 分子量(G) | 集成电路50(µM) |
| | | MCF-7型 | MDA-MB435型 | PC3公司 | HCT116 p53型+/+ | HCT116 p53型-/- |
| | | MTT公司 | CFA公司 | MTT公司 | CFA公司 | MTT公司 | CFA公司 | MTT公司 | CFA公司 | MTT公司 | CFA公司 |
1 | 电话:783 | 477.34 | 2.8 | 2.2 | 1.6 | 3.8 | 2.8 | 三 | 2 | 1.4 | 2.7 | 1.8 |
2 | TP 831号机组 | 495.33 | 2.8 | 3.5 | 3.4 | 4.1 | 三 | 1.1 | 2.8 | 1.6 | 2.7 | 3.8 |
三 | TP 738型 | 492.36 | 3.2 | 2.8 | 3.8 | 2.2 | 2.8 | 1 | 2.8 | 2.8 | 3.2 | 3.1 |
4 | TP 791型 | 500.63 | 4 | 三 | 4 | 2.9 | 3.8 | 三 | 3.5 | 5 | 5.8 | >10 |
5 | TP 734型 | 528.69 | 4.2 | 2.4 | 4.2 | 10 | 3.4 | 4 | 5 | >10 | 6 | >10 |
6 | TP 728型 | 503.01 | 3.8 | 1.1 | 3.4 | 2.8 | 3.7 | 3.1 | 3.1 | 2.9 | 3.1 | 2.3 |
7 | TP 794电话 | 565.08 | 三 | 2.4 | 2.8 | 3.5 | 三 | 3.1 | 2.8 | 3.2 | 2.6 | 三 |
8 | TP 752型 | 489.98 | 5 | 3.2 | 8.4 | >10 | 5 | 4 | 4 | 6 | 5 | 5 |
9 | TP 749型 | 565.08 | 2.6 | >10 | 2.5 | >10 | 2.2 | 8.5 | 3.1 | >10 | 3.1 | 4 |
10 | TP 759 | 592.64 | 3.1 | 0.8 | 3.8 | 4 | 三 | 2.9 | 1.8 | 三 | 3.1 | 2.8 |
11 | TP 790型 | 390.46 | 0.8 | 3.2 | 0.78 | 4.1 | 三 | 3.2 | 2.8 | 6 | 3.2 | 三 |
12 | TP 744型 | 432.54 | 0.65 | 0.3 | 2.5 | 2 | 三 | 3.4 | 1.5 | 3.1 | 1.8 | 3.9 |
13 | 电话:726 | 494.61 | 0.5 | 0.15 | 0.6 | 2.1 | 0.5 | 3.2 | 0.4 | 2.4 | 0.58 | 2.8 |
14 | TP 824电话 | 510.67 | 0.3 | 0.38 | 0.6 | 1.5 | 0.42 | 0.22 | 0.3 | 0.6 | 0.4 | 0.48 |
15 | TP 760型 | 492.59 | 0.5 | 0.28 | 0.98 | 0.18 | 三 | 0.31 | 0.31 | 0.6 | 0.42 | 0.78 |
16 | TP 737型 | 501 | 0.5 | 0.31 | 1 | 1.1 | 0.58 | 0.6 | 1.8 | 3.2 | 2.5 | 三 |
17 | TP 736型 | 535.44 | 5 | 2.8 | 5 | 4 | 4 | 3.4 | 3.8 | 三 | 4 | 三 |
18 | TP 822电话 | 572.70 | 1 | 2.8 | 1.5 | 6 | 2.8 | 2 | 3.5 | 2.8 | 2.9 | 3.2 |
19 | TP 772型 | 420.46 | 0.65 | 0.7 | 5 | 3.2 | 1.6 | 0.6 | 0.9 | 2.8 | 3.1 | 三 |
20 | TP 731型 | 483.42 | 0.45 | 0.2 | 0.5 | 0.35 | 0.4 | 0.28 | 0.25 | 0.28 | 0.35 | 0.32 |
21 | 电话:768 | 435.48 | 0.45 | 1.1 | 0.5 | 3.2 | 三 | 0.8 | 0.99 | 3.1 | 2.1 | 3.8 |
22 | TP 781型 | 544.69 | 3.2 | 2.2 | 4 | 3.1 | 5 | 2.4 | 1.8 | 4 | 3.5 | 3.8 |
23 | TP 821电话 | 427.50 | 0.55 | 1.1 | 1.8 | 7 | 3.8 | 1.8 | 2.4 | 3.1 | 3.8 | 2.2 |
24 | TP 769型 | 479.53 | 0.7 | 0.8 | 0.5 | 0.45 | 1 | 0.39 | 0.4 | 2.8 | 1.9 | 2.2 |
25 | TP 801型 | 525.98 | 3.2 | 2.4 | 6 | 4.1 | 4 | 2.8 | 2.8 | 三 | 2.8 | 三 |
26 | TP 765型 | 750.85 | 2.4 | 1.1 | >10 | 三 | 4.1 | 2.8 | 2 | 三 | 4 | 3.8 |
27 | TP 826电话 | 506.59 | 0.58 | 0.9 | 0.6 | 4 | 0.8 | 0.25 | 0.56 | 2 | 1.2 | 1.8 |
28 | TP 764型 | 318.37 | 7 | 6 | 6 | >10 | 8 | >10 | 9 | >10 | >10 | >10 |
29 | TP 825电话 | 335.42 | 1.2 | 4.5 | 4 | 5.1 | 5 | 2.2 | 3.5 | 3.1 | 3.9 | 三 |
30 | TP 740型 | 399.53 | 2 | 0.9 | 2.1 | 2 | 1.2 | 0.7 | 0.72 | 2.6 | 2.8 | 三 |
31 | TP 785型 | 445.30 | 2.7 | 2.2 | 3.4 | 3.8 | 2.8 | 3.5 | 2.8 | 2.8 | 三 | 2.3 |
32 | 电话:835 | 577.67 | 三 | 三 | 3.6 | 三 | 2 | 0.7 | 2.5 | 1.2 | 2.2 | 3.2 |
33 | TP 812电话 | 412.89 | 3.1 | 1.5 | 3.2 | 3.5 | 3.1 | >10 | 2.8 | 2.9 | 3.8 | 3.7 |
讨论
肿瘤微环境的特征是氧和营养成分的改变,部分原因是肿瘤血管系统的不足。肿瘤血管床曲折、紊乱,在肿瘤生长过程中产生缺氧、营养不良的区域。要在这些次优条件下生存,肿瘤细胞需要调用适应性策略来规避营养缺乏和缺氧。能量代谢途径的改变以及对缺氧和营养剥夺的适应性反应正在成为细胞转化的标志。[19]20年中期第个世纪,Warburg假设,即使有足够的氧合,癌细胞也依赖糖酵解代谢作为一种适应性机制,以补偿线粒体呼吸链水平的功能障碍。[20]最近的知识表明,在某些肿瘤类型中,结果与此相反,这表明Warburg效应可能并不适用于所有癌症。肿瘤细胞灌注不足严重限制了葡萄糖的供应,使糖酵解在能量上不可持续。缺氧肿瘤组织中测得的氧气水平高于呼吸功能障碍的发生水平,从而排除了缺氧是线粒体功能障碍的原因。[21]通过检查每个代谢途径对细胞增殖的贡献,发现氧化磷酸化提供了许多肿瘤类型产生的大部分ATP,尤其是在缺乏葡萄糖的情况下。此外,基于细胞的研究表明,在无糖培养基中长时间培养后,癌细胞的氧化磷酸化能力和氧亲和力增加,需要功能性线粒体来激活生存机制,例如在缺乏葡萄糖的条件下,未折叠蛋白反应(UPR)途径。[22],[23]所有这些都不是在非转化细胞系中观察到的。肿瘤表现出额外的代谢变化,包括从头开始的脂质和核苷酸生物合成以及谷氨酰胺依赖性的再修复。这些改变允许在不利条件下生长,产生糖基化反应底物,并为生物合成反应提供前体[24],[25]通常,TCA循环中间产物被视为生物合成反应的前体。来自TCA循环的柠檬酸盐被用作脂肪酸合成的前体。草酸酯和α-酮戊二酸提供蛋白质和核苷酸合成所需的非必需氨基酸。为了补偿,癌细胞具有更高的谷氨酰胺摄取量,通过谷氨酰胺水解来补充TCA循环中间体。[26]综上所述,这些证据表明,靶向线粒体呼吸能力的药物应该在保护正常细胞的同时对肿瘤生长产生深远影响。
在此,我们鉴定了一系列新型三苯基膦基化合物,这些化合物具有强大的抗肿瘤活性。我们对TP类似物187、197和421的初步筛选表明,在不同来源和细胞遗传学属性的一组癌细胞系中,TP类似物具有细胞毒性,在亚摩尔浓度下抑制集落形成,细胞周期阻滞与p53活性无关。TP类似物187和197以临床可达到的剂量显著抑制小鼠异种移植物中MDA-MB-435肿瘤的生长和增殖。日常健康监测和尸检组织学检查未发现任何可检测到的全身毒性或药物相关组织损伤。总之,这些结果证明了TP化合物在治疗多种癌症类型方面的潜在临床用途。
使用荧光模拟物TP421,我们能够确认快速摄取和线粒体定位,这与含有三苯基膦部分的化合物的预期情况相同。TP诱导细胞凋亡的早期事件包括耗氧速率降低、超氧化物生成增加以及糖酵解能力短暂增加。TP处理MDA-MB-435细胞导致耗氧量立即持续下降,但不受ATP合成酶抑制、线粒体呼吸解偶联和复合物I功能阻断的影响。观察到的OCR下降伴随着超氧物生成的暂时增加,从治疗后10分钟开始,持续到24小时,细胞外酸化速率的暂时增加表明糖酵解。这些早期事件很可能对TP的作用机制做出重大贡献(如果不是全部)。
据我们所知,这是第一篇在蛋白质组水平评估细胞对三苯基鏻化合物的反应的论文,从而提供了关于逆行线粒体对蛋白质组反应的见解。TP类似物延迟作用的机制可能与24小时治疗后与癌细胞生物学相关的信号转导级联中观察到的显著变化有关。()在对TP421的反应中,MDA-MB-435细胞显示出控制细胞对生长因子、细胞因子、激素的反应以及最终影响细胞周期蛋白D1和E表达的细胞外基质粘附的关键信号转导子显著下调,视网膜母细胞瘤蛋白磷酸化和c-jun转录因子的磷酸化。除上述途径外,还发现参与或相关细胞周期进程调节、蛋白质折叠和伴侣、细胞内钙信号、有丝分裂信号和细胞粘附的蛋白质的表达或激活状态显著降低。TP处理还显著增加了大量蛋白丝氨酸磷酸酶、NFkB活化剂、PKC亚型和转录调节因子STAT家族成员的丰度和活化状态。由于其调节细胞命运的能力,蛋白质丰度和功能的这些变化也可能是TP作用的后期机制的贡献者。
拟议的行动机制。TP化合物减少线粒体耗氧量,增加超氧物,导致活性氧物种的形成,从而导致与癌细胞生长和增殖有关的信号通路减弱。使用IPA平台,在涉及由生长因子、细胞因子、细胞粘附和激素介导的癌细胞存活的信号通路的背景下,对表现出显著上调或下调表达或磷酸化(用*表示)的蛋白质进行检测。TP-治疗影响了MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)、JNK(c-jun N末端激酶)、PI3K/Akt/mTOR(磷酸化木霉素-3-激酶/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶点)和CAMK(钙-钙调蛋白激酶)中的关键信号分子导致cyclin D1表达抑制和c-jun磷酸化的途径,以及Rb磷酸化的增加。
虽然这里报告的数据并没有阐明早期和晚期反应之间的确切关系以及每种反应对TP反应结果的贡献程度,但可以根据时间事件的可能相互作用来预测一般作用机制。
线粒体中因抑制耗氧量而产生的超氧化物可以转化为过氧化氢、羟自由基或在一氧化氮、过氧亚硝酸盐存在下。[27],[28],[29],[30]这些活性氧衍生物可以扩散或运输出线粒体,进入细胞溶质和核室。活性氧可以与细胞质和细胞核中半胱氨酸和蛋白质蛋氨酸残基的巯基反应,引起胞内或胞外二硫键。二硫键修饰蛋白质结构,这可以直接影响蛋白质活性、蛋白质/蛋白质关联和亚细胞定位的彻底改变。在细胞核中,活性氧还可以通过改变转录因子的氧化还原状态来抑制转录因子,而高浓度的活性氧已被证明会诱导DNA氧化损伤。[31],[32]
细胞对活性氧生成的反应取决于细胞氧化还原缓冲电位以及活性氧生成程度和持续时间。突然、强烈的ROS过量产生可能会压倒细胞的抗氧化反应,对细胞蛋白质、脂质和DNA造成不可逆的氧化损伤,导致氧化应激并最终导致细胞坏死。另一方面,较低水平的ROS生成会产生较温和的氧化失衡,通过氧化还原介导的信号转导调节,导致程序性反应,如细胞增殖、衰老和凋亡。[32],[33]
基于这一知识,TP化合物通过选择性抑制肿瘤细胞耗氧量和线粒体中随后的超氧物生成,可能有助于维持低水平的ROS生成。活性氧的持续水平最终导致细胞氧化还原状态的不平衡,从而导致参与细胞周期调节、生长因子信号传递和DNA转录的蛋白质功能的调节,从而产生Kinexus数据中观察到的全球蛋白质表达谱。这些分子效应器的功能失调会影响癌细胞生存、增殖和与细胞外环境相互作用的关键途径,从而导致细胞凋亡的诱导。
TP作用机制的全面阐明超出了本报告的范围,但通过这些分析,我们证明TP类似物影响与癌细胞生存、生长、细胞周期进展、细胞粘附、运动和凋亡相关的多种途径,其中许多途径已证明对细胞内氧化还原状态敏感。综上所述,我们对TP化合物的研究结果表明了一种独特的作用机制,包括抑制氧气消耗,导致自由基生成持续增加,从而改变氧化还原敏感的细胞信号通路,抑制生长因子介导的信号,促进细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡。
材料和方法
细胞培养
MDA-MB-435乳腺癌、MCF7乳腺癌和PC3前列腺癌细胞系购自美国类型细胞培养(弗吉尼亚州马纳萨斯)。HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-细胞由Bert Vogelstein博士(马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯医疗机构)提供。细胞系保存在含有10%热灭活胎牛血清的适当培养基(MDA-MB-435、MCF7和PC3的DMEM,HCT116细胞系的RPMI)中,并在37°C、5%CO2的湿润环境中补充2 mM L-谷胺。对于继代培养和实验,用1x PBS清洗细胞,用0.025%胰蛋白酶-EDTA(Cellgro,Mediatech,Mannassas,VA)分离,收集在生长培养基中并离心。所有实验均在指数生长期的亚汇合细胞培养基中进行。为了用于组织培养实验,在无菌二甲基亚砜(DMSO)(EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)中以10 mM浓度制备化合物,并在不使用时储存在−20°C。
细胞毒性测试
如前所述,通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)检测评估细胞毒性。[34]将细胞接种在96周的组织培养处理过的培养皿中,并让其粘附过夜。随后将细胞连续暴露于药物72小时。将MTT溶液添加到每个孔中,得到0.3 mg/mL MTT的最终浓度。细胞在37°C下与MTT孵育3-4小时。去除上清液后,添加二甲基亚砜,并在570 nm处读取吸光度。所有试验一式三份。IC50然后根据对数药物浓度与细胞杀伤百分比的关系图确定每种药物的浓度。
集落形成分析
如前所述进行集落形成分析[35]进一步评估药物毒性。为此,将细胞接种在96孔组织培养皿中,密度为每孔200个细胞,放置在生长培养基中,并让其粘附过夜。随后用不同浓度的化合物处理细胞24小时。处理后,用1x PBS清洗单层细胞,并在生长培养基中培养7至10天,以便有足够的时间在对照孔中形成菌落。为了观察菌落形成的程度,将细胞固定在含有1%戊二醛的2%结晶紫溶液中并染色。用蒸馏水多次洗涤去除多余污渍,然后晾干。使用VersaDoc成像平台上运行的Quantity One软件对染色板进行成像。(BioRAD)。在2%十二烷基硫酸钠溶液中溶解并在摇杆上摇晃2小时后,通过测量570 nm处的光密度进行定量。
细胞周期分析
细胞以1×10的密度接种在100 mm的组织培养皿中6细胞/平板置于生长培养基中,并允许过夜粘附。第二天用IC处理细胞80将TP化合物或DMSO单独浓度作为载体对照,持续24–72小时。处理完成后,用胰蛋白酶分离细胞,并通过离心法收集培养基和细胞。在−20°C的乙醇中固定过夜之前,将细胞清洗并重新悬浮在1x PBS中。固定细胞用10µg/mL RNase A(密苏里州圣路易斯市西格玛-奥尔德里奇)处理,并在50µg/mL碘化丙啶溶液(密苏里州圣路易斯市西格玛-奥尔德里奇)中染色。使用BD LSR II(BD Biosciences,San Jose,CA)和488 nM Sapphire™氩离子激光和PE发射检测器,通过流式细胞仪测定DNA含量。
异种移植研究
1.5×106将MDA-MB435细胞皮下植入6周龄雌性nu/nu小鼠(马萨诸塞州威尔明顿Charles River Laboratories)的后侧面。当肿瘤体积达到100 mm时三,小鼠被分为六个治疗组中的一个,每组由四到八只小鼠组成。通过腹腔注射5%二甲基亚砜/95%花生油(v/v)的50µL悬浮液进行治疗。第1组(n=8)接受DMSO/花生油的载体对照。第2组(n=4)每隔一天接受10 mg/kg体重的紫杉醇,共七个剂量。第3组(n=8)接受10 mg/kg体重的TP187,每周5次。第4组(n=8)每隔一天服用10 mg/kg体重的TP197。第5组(n=8)每周5次接受10 mg/kg体重的TP449。每周测量三次肿瘤体积和重量。使用卡尺测量肿瘤。肿瘤体积的计算公式如下:V=d2×D/2,其中D=宽度或较小尺寸,D=长度或较大尺寸。使用Microsoft Excel绘制并分析收集的数据,以确定平均肿瘤体积和重量、SEM值和p值。每天进行健康检查。小鼠表现出毒性或肿瘤负担过重(>2.0 cm三)用一氧化碳牺牲2在进行组织学分析之前,进行气体、尸检,采集肿瘤样本和器官,并将其固定在10%中性缓冲福尔马林中。实验完成后,处死剩余的小鼠,尸检后,采集、固定和处理器官进行组织学分析。该动物研究由南加州大学动物护理和使用委员会根据第10766号和11458号方案批准。动物护理和操作符合USC机构指南,该指南符合《实验动物护理和使用指南》。
纸巾处理
手术切除的组织或器官在1x PBS中清洗,以去除血液和体液,然后用10%中性缓冲福尔马林固定。将样品固定24–48小时,然后将器官储存在1x PBS中,直至准备进行分析。固定样品放置在盒式磁带中,并使用Microm STP 120旋转组织处理器进行组织学分析(Richard Allen Scientific,Kalamazoo,MI)。加工完成后,将组织/器官嵌入含有热石蜡的模具中,并在Microm EC 350-2冷冻冷却托盘上凝固。石蜡块在冰上冷却,并使用Microm HM 310切片机切割4微米切片(Microm International GmBH,Walldorf,Germany)。石蜡嵌入部分漂浮在Thermo Scientific Tissue Flotation浴中,浴中充满加热至44°C的水,然后安装在预先清洁的正电荷玻璃载玻片上(Richard Allen Scientistic,Kalamazoo,MI)。将载玻片竖直放置,并留出足够的时间风干。
苏木精伊红染色
H&E染色使用Thermo Scientific Shandon Varistain Gemini自动染色器(Richard Allen Scientistic,Kalamazoo,MI)进行。双子座染色器的程序如下。幻灯片在加热块中脱蜡20分钟。然后,该程序继续在Clear-Rite 3的3次更换中培养幻灯片3分钟,然后在每次更换FLEX100的2次更换中培育幻灯片1分钟。然后将载玻片在FLEX 95中孵育一分钟,然后进行流水冲洗。在水步骤之后,用苏木精7211(Richard Allen Scientific,Kalamazoo,MI)对载玻片染色两分钟、三十秒,然后进行一分钟的流水冲洗。接下来,将载玻片与澄清器2(Richard Allen Scientific,Kalamazoo,MI)孵育1分钟以去除背景苏木精染色。澄清剂2处理后,先用自来水冲洗一分钟,然后用发蓝试剂培养一分钟(Richard Allen Scientific,Kalamazoo,MI)。涂蓝试剂后,将载玻片在自来水中清洗一分钟,然后在FLEX 95中培养30秒。然后用Eosin Y(Richard Allen Scientific,Kalamazoo,MI)对载玻片进行染色。Eosin Y染色后,在100%FLEX中连续三次一分钟洗涤,最后连续三次改变Clear-rite 3(Richard Allen Scientific,Kalamazoo,MI)。然后将载玻片从Gemini染色器中取出,并使用1-2滴安装介质(Richard Allen Scientific,)进行盖玻片,并风干数小时。用光学显微镜检查标本。使用配备有10个目镜和5、20、40和100个物镜的Ziess公理镜光学显微镜对幻灯片进行可视化。使用Moticam 2300显微镜照相机(Motic位于北美,列支敦士登,加拿大)获得了显微照片。
福尔马林固定石蜡包埋组织切片的免疫过氧化物酶染色
将四微米厚的组织切片安装在预先清洁的带正电荷的玻璃载玻片上。使用三次二甲苯更换,每次5分钟,将组织切片脱蜡。对切片进行水化处理,首先用两次100%乙醇洗涤,每次10分钟,然后用两次95%乙醇洗涤,每个洗涤10分钟,随后浸入双蒸馏水中(ddH2O) 一分钟。在pH 6.0的10 mM柠檬酸钠中煮沸载玻片10分钟,进行抗原回收。根据制造商的方案,使用UltraVision ONE检测系统(加利福尼亚州弗里蒙特的Thermo Scientific)进行免疫组织化学染色。MDM2(克隆SMP14)是从Invitrogen Biosource(加利福尼亚州卡尔斯巴德)获得的。p53抗体(克隆DO-1)从圣克鲁斯抗体(加州圣克鲁斯)中获得,并以1∶500的稀释度使用。Ki67抗体(克隆SP6)从Thermo Scientific(Fremont,CA)获得,并以1∶400的稀释度使用。抗叶半胱氨酸蛋白酶3抗体购自Cell Signaling(Danvers,MA),并以1∶400的稀释度使用。兔和小鼠的IgG同型对照品从Santa Cruz抗体中购买,并在所有染色程序中以1∶400和1∶500的稀释液作为阴性对照。免疫标记切片用苏木精7211(Richard Allen Scientific,Kalamazoo,MI)复染10秒,并在ddH中漂洗2O三到四次以去除多余的污渍。然后用95%和100%的FLEX酒精(Richard Allen Scientific,Kalamazoo,MI)对组织切片进行两次10秒钟的洗涤脱水,然后对Clear-rite 3进行三次5秒钟的更换。吸干多余的透明剂,并使用单簧管安装介质(密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich)和玻璃盖玻片安装载玻片。显微镜检查前,将载玻片风干过夜。
核免疫组织化学染色定量的Q评分法
Q-score是一种使用公式Q=P x I的半定量组织评分方法,其中P等于阳性染色细胞的百分比,I等于每个阳性细胞染色的强度。I或强度为1到3之间的值,表示低、中或高染色强度。为了对对照组和TP187治疗组肿瘤切片中Ki-67的表达进行评分,对每个治疗组的三个肿瘤切片进行检查。对于每一个,至少拍摄10个随机场,并计算每个单独场的P和I值。以这种方式计算每个处理的平均Q值和相应的SEM。
统计分析
采用Student t检验对肿瘤体积和Microsoft Excel中免疫组织化学染色的Q评分进行统计分析,假设方差不相等。通过该方法获得的P值小于0.05被认为是显著的。
TP421摄取的流式细胞术分析
利用TP421的荧光特性研究TP化合物的细胞摄取。PC3前列腺癌细胞系以5.0×10的密度接种5细胞/培养皿置于33 mm组织培养处理的培养皿中,并在2 mL培养基中粘附过夜。第二天,通过胰蛋白酶消化收集细胞,洗涤并重悬于500µL 1x PBS中。在加入10µM TP421或DMSO之前和之后的三分钟,作为载体对照,用BD-LSR-II流式细胞仪的355nM紫外固体激光器激发425-475nM的发射波长,记录荧光随时间的变化。
荧光光谱学
对TP化合物和MitoSOX进行荧光光谱分析,以使用Fluorolog 3稳态荧光光谱仪(Horiba Scientific,Edison,NJ)确定最佳激发和发射波长。使用溶解在二甲基亚砜(DMSO)中的5–10µM化合物(EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)再悬浮在2 mL ddH中进行光谱分析2O.校正读数以去除对应于DMSO和ddH的背景荧光2O。
活性氧形成的流式细胞术分析
在与5µM MitoSOX红色线粒体超氧化物指示剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)在37°C下孵育10分钟之前,用2µM TP化合物处理MDA-MB-435癌细胞不同的时间段。将细胞进行胰蛋白酶化,用Hank’s平衡盐溶液(HBSS)洗涤三次,以去除残留的MitoSOX,然后再在750µL 1x PBS中重新悬浮。在562–588 nM的发射波长范围内,记录与超氧自由基氧化MitoSOX Red对应的荧光强度,以响应BD LSR II流式细胞仪的488 nM Sapphire™氩离子激光的激发。
生物能学研究
使用XF 24细胞外通量分析仪(马萨诸塞州比勒里卡Seahorse Bioscience)进行生物能学研究。在含有24对荧光生物传感器(耦合到光纤波导)和24孔XF24细胞培养微孔板的一次性传感器盒中进行检测。
为了制备生物传感器盒,通过在XF24生物传感器盒的每个孔中添加1 mL XF24校准液(Seahorse Bioscience,Billerica,MA)使生物传感器水合。然后在37°C的温度下,在没有外部CO的情况下,将药筒培养过夜2来源。同时,将MDA-MB-435细胞以每孔120000个细胞的密度接种在XF 24细胞微孔板20个孔中的每一个100µL培养基中,留下A1、B4、C3和D6对照孔空白。在向每个孔中添加150µL培养基之前,让细胞粘附4小时。随后在37°C的温度下,在5%CO的存在下培养板过夜2.
生物能量学测量开始时,将分析培养基加热至37°C,并将pH值调整至7.4。从XF24细胞微孔板中取出培养基,并用1mL分析培养基冲洗微孔。接下来,将600µL的测定培养基添加到每个孔中,并将XF24细胞微孔板在37°C下孵育1小时,不含CO2补充。储备化合物的稀释液在分析介质中制备。将60µL试剂添加到生物传感器盒的注入口,并保持在37°C,无CO2补充。在37°C下进行校准和分析测量。生成的数据反映了七个小时治疗期间的测量结果。
生物能学分析培养基
通过将DMEM碱(8.3 g/L,Sigma,St.Louis,MO)溶解在500 mL蒸馏水中来制备生物能量学分析培养基。将1.85 g氯化钠(西格玛,圣路易斯,密苏里州)分别溶解在500 mL蒸馏水中。然后将氯化钠溶液和DMEM碱溶液合并,用10 mL 100 x GlutaMax-1(Gibco)和10 mL 100 mM丙酮酸钠(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)替换20 mL该合并溶液。然后将培养基加热至37°C。使用5 M氢氧化钠(西格玛,密苏里州圣路易斯)将培养基的pH值调整为7.4。最后,通过过滤对培养基进行消毒,并将其储存在4°C下以备将来使用,在此期间,在试验当天再次将培养基的温度和pH值分别调节至37°C和7.4。
Kinexus抗体芯片
用1µM TP421处理MDA-MB-435细胞24小时。处理完成后,将细胞在冰镇PBS中清洗,以去除残留培养基,然后在200µL的裂解缓冲液中进行裂解(20 mM MOPS,pH 7.0,2 mM EGTA,5 mM EDTA,30 mM氟化钠,60 mMβ-磷酸甘油,pH 7.2,20 mM焦磷酸钠,1 mM原钒酸钠,1 M M苯甲基磺酰基氟化物,3 mM苯甲脒,5µM胃蛋白酶抑素A,10µM亮氨酸肽,1%Triton X-100,1 mM-二硫苏糖醇)并收集。将细胞裂解物在冰上超声处理四次,每次10秒,脉冲之间暂停15秒,以使细胞破裂并剪切DNA。超声处理后,通过在4°C下在90000×g下离心30分钟来清除匀浆。将上清液转移到干净的微型离心管中,并使用BCA蛋白质分析法测量蛋白质浓度。将最终体积为250µL的全细胞裂解物提交给Kinexus,使用Kinex™KAM-1.1抗体微阵列(Kinexus Bioinformatics Corp)进行628抗体微阵列分析。
创意路径分析
使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件分析Kinexus™抗体微阵列结果,确定受TP421治疗影响的潜在细胞内信号通路或分子。显著上调或下调的泛特异性或磷蛋白及其Swiss-Prot登录号和比率变化以Excel电子表格文件的形式上传至IPA服务器。通过核心分析分析TP421介导的信号通路。