癌症研究。作者手稿；PMC 2010年10月1日提供。
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美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院225431
BH3模拟物ABT-737通过不平衡Bim和Bak增强TRAIL介导的人胰腺癌细胞凋亡信号
明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院迈尔斯和雪莉·菲特曼消化疾病中心和肿瘤科
- 补充资料
补充图1。
GUID:99A030EB-EF10-4EFA-A25E-397CACFBF1B9
补充图2。
GUID:FC52AC94-779F-45A6-9E45-1AE25EF72AB5
摘要
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）已被证明可诱导线粒体凋亡信号，而线粒体凋亡信号可被前生存期Bcl-2蛋白负调控。ABT-737是一种小分子BH3模拟物，结合并拮抗Bcl-2/Bcl-xL（左）但不是Mcl-1。我们发现ABT-737可以协同增强TRAIL介导的人类胰腺癌细胞系的细胞毒性。ABT-737通过DNA片段化、caspase-8和Bid的激活以及caspase-3和poly（ADP-核糖）聚合酶的裂解，增强TRAIL诱导的凋亡。ABT-737增强了TRAIL诱导的Bax构象变化。ABT-737破坏了Bak与Bcl-x的相互作用L（左）在两种细胞系中。此外，ABT-737将促凋亡BH3-only蛋白Bim从Bcl-x的隔离中解离L（左）或Bcl-2。与shRNA对照细胞相比，Bim小发夹RNA（shRNA）可以减弱caspase-3的裂解，并降低TRAIL和ABT-737的细胞毒作用。最后，Mcl-1 shRNA增强了ABT-737对caspase-3的切割并增强了其细胞毒作用。总之，ABT-737通过解封Bim和Bak并增强TRAIL诱导的Bax构象变化来增强TRAIL引起的细胞杀伤。这些发现表明了一种新的策略，可以增强外源性和内源性凋亡途径之间的相互作用，从而提高胰腺癌的治疗效果。
引言
胰腺癌是一种固有的耐药肿瘤，对细胞毒性化疗药物的反应很差。因此，迫切需要新的治疗策略和组合方案来提高治疗效果。死亡受体配体肿瘤坏死因子（TNF）相关凋亡诱导配体（TRAIL）是TNF家族的成员，由于其能够诱导多种肿瘤细胞类型的凋亡，而对正常细胞的影响微乎其微，因此是一种很有前景的抗癌剂(1). TRAIL参与外源性凋亡途径，包括caspase-8裂解、死亡受体结合、死亡诱导信号复合物的形成以及效应caspase-3和caspase-7的后续激活(2). 大多数人类癌症细胞被称为II型，因为它们在死亡受体刺激后需要线粒体扩增步骤（内在途径）来诱导凋亡(2,三). 这些凋亡途径之间的串扰是由胱天蛋白酶-8诱导的Bid切割介导的(4–6). 截短Bid是一种促凋亡的BH3-only蛋白，可转位到线粒体，激活Bax并刺激凋亡蛋白（即细胞色素）的释放c（c）、Smac和HtrA2；参考文献。7,8). 鉴于这种情况，增强肿瘤细胞杀伤的策略可能需要选择性靶向外源性和内源性凋亡途径。Bcl-2和Bcl-xL（左）已证明在人类癌细胞中对TRAIL产生耐药性(9–12). 因此，禁用抗凋亡Bcl-2蛋白可能会大大增强TRAIL介导的凋亡。在这方面，BH3模拟物和小分子Bcl-2拮抗剂ABT-737以高亲和力结合到Bcl-2，Bcl-x上的疏水沟槽L（左）和Bcl-w，并阻止其与Bax结合，从而改变平衡，有利于促凋亡分子(13). ABT-737已被证明可降低某些化疗药物的凋亡阈值，并在小鼠模型中显示出显著的临床前抗淋巴瘤活性(13). 然而，ABT-737以低亲和力与Mcl-1结合，Mcl-1敲除的细胞显示ABT-737-诱导的细胞死亡增强(14). 迄今为止，ABT-737增强TRAIL介导的细胞死亡的能力尚未见报道。
直到最近，Bid才是已知的外源性和内源性凋亡途径之间的唯一联系。然而，最近的数据表明，TRAIL可以通过破坏Mcl-1:Bim复合物诱导Mcl-1降解(15). 在本研究中，我们测定了ABT-737增强TRAIL介导的人胰腺癌细胞凋亡的能力。我们发现ABT-737通过释放Bcl-2或Bcl-x隔离的Bim，可以显著增加TRAIL介导的线粒体凋亡信号L（左）通过解开Bak和Bcl-xL（左）此外，ABT-737增强TRAIL介导的Bax构象变化。这些发现强调了Bim和Bak在TRAIL细胞死亡反应中的重要性，并证明靶向外源性和内源性凋亡途径可以提高治疗效果。
材料和方法
细胞培养、药物和试剂
本研究使用人胰腺癌细胞系BxPC-3和PANC-1以及人胚胎肾细胞系293T。BxPC-3和PANC-1细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素、10 mmol/L HEPES和1%丙酮酸钠的RPMI 1640（Invitrogen）中培养。293T细胞保存在高糖DMEM（Sigma）加10%FBS中。为了生产慢病毒，293T电池培养在含有2%FBS的高糖DMTEM（System Biosciences）中。重组人TRAIL（Val114-甘氨酸281)从R&D Systems处获得，使用新鲜的或经校准的，并在−80°C下储存不到一个月。ABT-737从雅培制药公司获得，并溶解在二甲基亚砜中以产生20 mmol/L储备溶液，该储备溶液经校准并储存在−20°C下。
细胞活力测定
使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲基氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2在有或无药物治疗的情况下测定细胞活力H（H）-按照制造商的方案（Promega）进行四氮唑（MTS）还原试验。简单地说，将8000个细胞置于50μL培养基中，接种到96 well板中，并在37°C下培养过夜。第二天，将研究药物混合在50μL培养基中，并添加到每个孔中。将平板培养预定时间段，然后向每个孔中添加20μL MTS/甲磺酸吩嗪溶液。然后在37°C下在含有5%CO的增湿大气中培养平板2持续1至4小时。使用Versamax微孔板读取器（Molecular Devices）测量并记录492nm处的吸光度。每种情况下，该分析一式三份，并计算SD。
DNA片段分析
大约104将细胞接种到24孔板中，并使其附着过夜。然后用药物处理细胞指定的时间，并在500×克然后根据制造商手册，使用细胞死亡检测ELISA plus试剂盒（罗氏应用科学公司）对DNA片段进行分析。在405 nm处测量吸光度（参考波长490 nm）。样品一式两份，并显示平均值。
免疫沉淀
通过刮擦收集小鼠处理的细胞或药物处理的细胞，然后在冷PBS中清洗。离心后，在细胞裂解缓冲液[10 mmol/L HEPES（pH7.4）、20 mmol/L-钼酸、150 mmol/L-KCl、0.1%NP40、5 mmol/L-MgCl中通过超声溶解细胞颗粒2]使用蛋白酶抑制剂。或者，通过在CHAPS缓冲液[5 mmol/L MgCl中培养来溶解细胞颗粒2，137 mmol/L KCl，1 mmol/L-EDTA，1 mmol/L EGTA，1%CHAPS，10 mmol/L-HEPES，pH 7.5]在冰中放置30分钟。将细胞裂解液再次以14000 rpm离心10 min。通过去污剂相容性（DC）蛋白质测定法（Bio-Rad）测量上清液的蛋白质浓度，并将蛋白质浓度标准化为5 mg/mL。通过与蛋白A-Sepharose或蛋白G-Sepharoze结合来预清洗裂解液（GE Healthcare）然后与抗体蛋白A或抗体蛋白G复合物孵育，该复合物是通过将抗体与蛋白A或蛋白G珠在0.5 mL PBS中孵育而成，室温下在4°C下孵育2 h过夜。用1mL原始裂解缓冲液或不含蛋白酶抑制剂的CHAPS缓冲液洗涤未结合蛋白三次。通过在70μL LDS样品缓冲液（Invitrogen）中煮沸样品，洗脱珠子上的结合蛋白。然后，将30μL洗脱蛋白用于一个Western blot。
蛋白质印迹
按照上述程序在裂解缓冲液中制备蛋白质样品，使用DC蛋白质分析试剂（Bio-Rad）进行归一化，在LDS样品缓冲液（Invitrogen）中煮沸，并加载到10%SDS-PAGE凝胶上，以电泳转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Bio-Rad）上分离蛋白质。在含有0.1%吐温20的PBS中用0.2%I-Block（应用生物系统）封闭膜，并在4°C下与含有0.2%I-Block和0.1%吐温20的PBS中的一级抗体孵育过夜。然后在含有0.2%I-Block和0.1%Tween 20与碱性磷酸酶结合的PBS中用二级抗体培养膜，然后用CDP-Star底物（应用生物系统）培养膜。
Bax构象变化
处理后，PANC-1细胞在CHAPS缓冲液[5 mmol/L MgCl中孵育溶解2，137 mmol/L KCl，1 mmol/L.EDTA，1 mmol/L EGTA，1%CHAPS，10 mmol/L.HEPES，pH 7.5]在蛋白酶抑制剂存在下在冰中保持30分钟。如前所述，将细胞裂解物与结合Bax抗体6A7（Sigma）的蛋白G珠培养过夜(16). 蛋白G珠用裂解缓冲液洗涤三次，结合蛋白用含有2-巯基乙醇的LDS样品缓冲液（Invitrogen）洗脱。然后用兔抗Bax抗体（细胞信号）进行蛋白质印迹。
慢病毒小发夹RNA敲除Bim和Mcl-1
Bim和Mcl-1的靶序列由梅奥诊所分子生物学核心设施选择和合成。Mcl-1的靶向序列为GATTGTGACTCTCATTTCT(17). Bim的靶向序列为GACCGAAGGTAGACAATTGC(18). 退火后，模板形成双链DNA，两侧由生态RI和巴姆HI位点连接到慢病毒小发夹RNA（shRNA）克隆和表达载体pSIH-H1（System Biosciences）中，并用生态RI和巴姆你好。DNA测序证实了在预期位置的插入。为了生产假病毒，将2μg无内毒素慢载体表达构建物与慢载体包装质粒混合物（System Biosciences）混合，并在含有Plus试剂（Invitrogen）的血清OPTI-MEM培养基中稀释。在室温下培养15分钟后，将含有血清还原介质的脂质体试剂滴入上述DNA/Plus复合物中，再培养15分钟。将DNA/脂质体/Plus复合物转染到慢病毒产生细胞系293T的血清还原介质中，在5%CO中过夜237°C培养箱。第二天，用含有2%热活化FBS的新鲜DMEM更换培养基，并继续在37°C的培养箱中培养。在转染后48小时，收集、澄清上清液，并通过Millex-HV 0.45-μm PVDF过滤器（Millipore）过滤。然后通过添加10%（最终浓度）PEG-8000（Sigma）浓缩上清液，在4°C下培养过夜不少于12 h，并在1500×克在4°C下保持10分钟。为了将慢载体表达构建体（包装在假型病毒颗粒中）转导到靶细胞中，将含有8μg/mL聚布伦烯（Sigma）的培养基中的适量病毒生长直接添加到靶细胞中，并在37°C下孵育过夜。然后在转导72小时后测试目标基因敲除。
组合指数计算
如前所述，使用Calcusyn软件（Biosoft）分析ABT-737和TRAIL的联合作用(19).
统计分析
所示值代表三次试验的平均值±SD。学生确定了实验变量之间差异的统计显著性t吨测试。
结果
ABT-737增强TRAIL介导的细胞凋亡
抗凋亡Bcl-2蛋白已被证明能够抵抗TRAIL诱导的凋亡(三,9,11,12). 我们确定了靶向Bcl-2/Bcl-x的小分子BH3模拟物ABT-737是否L（左）但Mcl-1不能使PANC-1和BxPC-3胰腺癌细胞对TRAIL敏感。通过细胞活性和DNA片段分析，发现PANC-1细胞与BxPC-3细胞相比，对TRAIL（0、5、10和15 ng/mL）具有相对抗性(P（P）< 0.05;). Bcl-2家族成员的表达分析表明，PANC-1细胞的Mcl-1和Bcl-x水平较低L（左）与BxPC-3细胞相比，Bcl-2的表达和检测不到(). ABT-737单药治疗降低了两种细胞系的细胞活力()并引起DNA片段化所示的轻微凋亡(). 研究发现，ABT-737和TRAIL联合用药显著降低了两种细胞系的细胞存活率，并且在更大程度上比单独使用两种药物都要低(P（P）< 0.05;). 此外，ABT-737和TRAIL联合使用显著增加了两种细胞系的凋亡(P（P）< 0.05;). 具体而言，我们用一系列浓度的ABT-737处理PANC-1细胞，以剂量依赖的方式增强TRAIL介导的凋亡(). 为了确定该药物组合的细胞毒性作用是协同作用还是相加作用，我们使用中值效应法进行了分析。通过MTS分析以固定比率分析不同浓度的ABT-737和TRAIL对细胞活力的影响，并按照Chou和Talalay方法计算组合指数值(20). 如等压线图所示，组合指数值<1，表明协同作用().
TRAIL介导的胰腺癌细胞系的细胞毒性和DNA片段化。A类，将细胞在37°C下以指示剂量与TRAIL孵育48 h，然后添加MTS试剂并孵育3 h。在492 nm处测量吸光度。柱，重复实验的平均值；酒吧，SD。B类，在37°C下用增加浓度的TRAIL处理细胞4 h。然后按照材料和方法中的概述进行DNA片段分析。柱，平均值；酒吧，SD。C类全细胞裂解物中BH3-only蛋白Bim和抗凋亡Bcl-2蛋白表达的免疫印迹分析。β-管蛋白被用作蛋白质负荷的对照。
ABT-737增强TRAIL诱导的凋亡，并发挥协同凋亡作用。A类在PANC-1细胞中，与单独给药相比，ABT-737和TRAIL联合给药48小时可显著降低细胞活力。柱，三次试验的平均值；酒吧，SD。B类在PANC-1细胞中，与单独使用两种药物相比，联合使用一系列剂量的ABT-737（μmol/L）和TRAIL（ng/mL）4h产生的DNA断裂程度显著增加。柱，平均值；酒吧，标准差。C类用不同浓度的ABT-737（2.5–20μmol/L）和TRAIL（1.25–10 ng/mL）以固定的剂量比处理PANC-1细胞，通过MTS分析和组合指数测定细胞活力(CI公司)按照材料和方法进行计算。组合指数<1表示协同作用。D类在BxPC-3细胞中，与单独使用两种药物相比，联合使用ABT-737和TRAIL 48小时后，细胞活力下降更大。柱，三次试验的平均值；酒吧然后对ABT-737和TRAIL联合用药4小时后的BxPC-3细胞进行DNA片段分析。与单独使用两种药物相比，联合用药产生的DNA片段程度明显更大。柱，平均值；酒吧，SD。
ABT-737增强TRAIL介导的细胞凋亡和Bax构象变化
与单独使用两种药物相比，联合使用ABT-737和TRAIL的PANC-1细胞显著增强了caspase-8、Bid、caspase-3和poly（ADP-核糖）聚合酶的激活(). 与单独使用TRAIL相比，ABT-737和TRAIL增加了caspase-8和Bid的激活，这与caspase-3介导的反馈放大环相一致(21). 这些发现表明ABT-737可以增强TRAIL介导的凋亡信号。我们观察到TRAIL处理的PANC-1细胞中Mcl-1表达增加，这是通过激活核因子κB实现的(22). ABT-737还增加了Mcl-1的表达(). 在相对低剂量的TRAIL（0-20 ng/ml）下观察到TRAIL介导的细胞毒性和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活，并且在使用相同TRAIL制剂的PANC-1细胞系中也报告了类似的作用(23,24). 然后我们研究了ABT-737、TRAIL及其组合对Bax构象变化的影响。在死亡刺激后，Bax发生构象变化并转移到线粒体外膜以调节渗透性，这是细胞死亡的关键决定因素(25). Bax（或Bak）的激活与构象变化有关，这种构象变化可以通过仅识别活性蛋白构象的抗体检测到(16). 我们发现ABT-737可以增强TRAIL诱导的PANC-1细胞Bax构象变化(). TRAIL单独诱导了适度的Bax构象变化，而ABT-737单药则没有。
ABT-737增强TRAIL介导的凋亡信号和Bax构象变化。A类在PANC-1细胞中，ABT-737（20μmol/L）增强TRAIL（10 ng/mL）诱导的caspase-8和Bid的裂解以及caspase-3和聚ADP-核糖聚合酶的下游激活(PARP项目). 用指示的药物处理细胞48小时，并用全细胞裂解物进行免疫印迹分析。β-微管蛋白作为蛋白质负载的对照。B类用ABT-737（20μmol/L）、TRAIL（10 ng/mL）或它们的组合处理PANC-1细胞2 h，然后用抗Bax 6A7抗体进行免疫沉淀，以检测Bax蛋白的构象变化。
ABT-737用Bcl-x取代BimL（左）/Bcl-2型
我们研究了ABT-737增强TRAIL诱导的细胞死亡的机制。Bim是一种仅BH3的蛋白质，已被证明与所有抗凋亡Bcl-2蛋白结合，因此是一种有效的促凋亡分子(26). 确定ABT-737治疗对Bim和Bcl-x相互作用的影响L（左），我们免疫沉淀Bcl-xL（左）然后探测Bim。Bim与Bcl-x分离L（左）与对照细胞相比，ABT-737处理的PANC-1细胞(). 在BxPC-3细胞中，ABT-737取代了Bim与Bcl-2的复合物，但未能破坏其与Bcl-x的结合L（左）或Mcl-1(). 我们的免疫沉淀数据与大多数Bim与Mcl-1偶联的观察结果一致(; 裁判。27). 为了进一步证明Bim在ABT-737增强TRAIL诱导的细胞凋亡中的重要性，我们使用慢病毒传递的shRNA生成了Bim敲除的PANC-1细胞。Bim的敲除被发现可以显著减弱TRAIL及其与ABT-736联合诱导的细胞活力降低(P（P）< 0.05;). 此外，Bim敲除减弱了ABT-737和TRAIL处理诱导的caspase-8、caspase-9和caspase-3的激活(). 总之，我们的数据显示ABT-737从Bcl-x解约了BimL（左）或Bcl-2，表明ABT-737能使游离Bim激活Bax发挥促凋亡作用。Bim的释放似乎独立于我们细胞中的Mcl-1，这表明其从Bcl-x的释放L（左）或Bcl-2确实足以增强TRAIL介导的凋亡。
ABT-737通过Bcl-x替代促凋亡BimL（左）或Bcl-2。Bim-shRNA可以减弱ABT-737和TRAIL联合诱导的凋亡信号和细胞毒效应。A、 用ABT-737（20μmol/L）或载体（DMSO）处理PANC-1细胞24 h，并进行免疫沉淀。全细胞裂解物(WCL公司)，流经(英尺)从珠子中提取蛋白质(IP（IP）)通过SDS-PAGE分离，然后探测Bim(顶部)或Bcl-xL（左）(底部).B类用ABT-737（10μmol/L）或载体（DMSO）处理BxPC-3细胞24 h，并对Bim蛋白进行免疫沉淀。用SDS-PAGE分离全细胞裂解液、从珠子中流出的蛋白和从珠子洗脱的蛋白，并探测Mcl-1、Bcl-2或Bcl-xL（左）蛋白质。C类，用慢病毒shRNA将PANC-1细胞转导至Bim或对照shRNA，然后暴露于TRAIL、ABT-737或其组合中48 h。通过MTS分析细胞活力，并记录吸光度（492 nm）。柱，三次试验的平均值；酒吧，SD。D类与对照shRNA处理的PANC-1细胞相比，Bim敲除可减弱ABT-737（20μmol/L）和TRAIL（10 ng/mL）共给药48小时所触发的caspase-8、caspase-9和caspase-3的激活。使用全细胞裂解物并通过免疫印迹进行分析。
ABT-737可以破坏Bak和Bcl-x的相互作用L（左）
最近的研究表明，从Bcl-2/Bcl-x中分离Bak的重要性L（左）确定ABT-737的致命性(14). 因此，我们确定了ABT-737对Bak和Bcl-x之间相互作用的影响L（左）.通过免疫沉淀法检测Bak和Bcl-xL（左）在PANC-1中()和BxPC-3()我们发现ABT-737可以破坏Bak与Bcl-x的结合L（左）在两种细胞系中。位于线粒体外膜的Bak的解绑可以使线粒体渗透，从而导致细胞凋亡。
ABT-737从Bcl-x解约BakL（左）.A类，用ABT-737（20μmol/L）或载体（DMSO）处理PANC-1细胞24小时，并对Bak蛋白进行免疫沉淀。用SDS-PAGE分离全细胞裂解液、从珠子中流出的蛋白质和从珠子洗脱的蛋白质，然后探测Bak(顶部)或Bcl-xL（左）(底部).B类，用ABT-737（10μmol/L）或载体（DMSO）处理BxPC-3细胞24小时，如上所述对Bak蛋白进行免疫沉淀，并检测Mcl-1、Bak或Bcl-xL（左）蛋白质。
Mcl-1敲除使胰腺癌细胞对ABT-737敏感
ABT-737对Mcl-1的亲和力较低，在过度表达Mcl-1细胞中可能只产生适度的细胞毒性作用(14). 鉴于BxPC-3和PANC-1细胞系显示内源性Mcl-1表达()，我们确定Mcl-1敲除是否能使PANC-1细胞对ABT-737诱导的caspase-3活化和细胞毒性敏感。慢病毒shRNA可在PANC-1细胞中敲除Mcl-1。ABT-737（20μmol/L）处理显示，与非靶向shRNA转导PANC-1的细胞相比，Mcl-1敲除的细胞中caspase-3裂解显著增加(). 此外，与未转导细胞相比，Mcl-1 shRNA增强了ABT-737诱导的细胞活性降低(). 这些数据证实了Mcl-1在抗ABT-737诱导的细胞死亡中的重要作用及其在胰腺癌细胞系中的相关性。
Mcl-1敲除使PANC-1细胞对caspase-3裂解敏感，并增强ABT-737的细胞毒作用。A类将转染Mcl-1 shRNA或对照shRNA的细胞暴露于ABT-737（20μmol/L）48h，通过免疫印迹分析caspase-3的活化。还显示了Mcl-1的击倒效率。使用全细胞裂解物和β-微管蛋白作为蛋白质负荷的对照。B类，测定ABT-737（0–20μmol/L；48 h）处理对细胞活力的影响，并在Mcl-1 shRNA转导的细胞和对照shRNA转染的细胞之间进行比较。
ABT-737增强吉西他滨诱导的细胞毒性
我们确定ABT-737是否能增强核苷类似物吉西他滨的细胞毒性作用。吉西他滨是一种用于治疗人类胰腺癌的传统细胞毒性药物。研究表明，ABT-737能显著增强吉西他滨诱导的PANC-1和BxPC-3细胞系细胞活力的降低(P（P）< 0.05; 看见补充数字). 在与TRAIL联合使用的相同剂量的ABT-737中观察到了这种效果。
讨论
TRAIL已被证明在许多肿瘤细胞类型中触发与线粒体凋亡途径的串扰(2,28). 研究使用Bax公司-缺乏的肿瘤细胞证实了TRAIL诱导的线粒体扩增步骤的重要性(28,29). 我们(9)和其他(10–12)之前已经证明强制Bcl-2或Bcl-xL（左）表达可抑制TRAIL介导的细胞凋亡。因此，禁用抗凋亡Bcl-2蛋白可能会提高TRAIL的疗效。为了评估这种策略，我们评估了小分子BH3模拟物ABT-737，它与Bcl-2和Bcl-x上的调节位点具有高亲和力L（左），诱导Bax/Bak介导的细胞凋亡(13,14). 使用对TRAIL介导的凋亡相对敏感性不同的人胰腺癌细胞系PANC-1和BxPC-3。我们首次报道ABT-737对TRAIL介导的凋亡产生显著的敏感性，如DNA片段分析所示，在两种胰腺癌细胞系中。ABT-737和TRAIL之间的相互作用显示为协同作用。这种作用的机制基础包括ABT-737从其与Bcl-2和Bcl-x的相互作用中解开Bim的能力L（左）分子，从Bcl-x中解出BakL（左），并激活Bax。Bim从Bcl-x中解放出来L（左）根据每个细胞系中这些蛋白质的相对丰度，PANC-1细胞和BxPC-3细胞中的Bcl-2。Bak与Bcl-x复合物释放L（左）在两种细胞系中。Bim是一种有效的细胞凋亡诱导剂，因为Bim、Puma和截短的Bid可以中和所有生存前的Bcl-2蛋白，而Noxa和Bad只有选择性相互作用(26). Bim的功能意义在Bim-敲低的PANC-1细胞中表现出来，其中caspase-8、caspase-9和caspase-3裂解被减弱，ABT-737加TRAIL的细胞毒作用被显著抑制。因此，Bcl-2或Bcl-x对Bim的封存L（左）似乎在TRAIL抵抗中起主要作用。ABT-737没有破坏Mcl-1在两种细胞系中对Bim的隔离，表明Bim与Bcl-2或Bcl-x的解偶联L（左）尽管发现大多数Bim与Mcl-1结合，但这些蛋白质足以使细胞对TRAIL敏感(27).
我们发现ABT-737可以增强TRAIL介导的Bax构象变化。已证明释放游离Bim可以激活Bax，使胰腺癌细胞对TRAIL敏感(25). 在这方面，最近的数据表明，Bim直接作用于Bax/Bak，Bax/Back固定在线粒体外膜上，正如观察到的那样，Bim而非Puma BH3肽足以诱导Bax和Bak的齐聚和活化，从而使线粒体膜渗透(25). 此外，Bim通过Bax或Bak在来自比姆/巴克斯或比姆/贝克双基因敲除小鼠(30). 研究表明，TRAIL优先使用Bax而不是Bak来诱导线粒体凋亡事件(31). 证据表明，Bak可以通过其从Bcl-x的位移而被激活L（左）通过BH3-唯一蛋白质(32). 因此，我们研究了Bak和Bcl-x之间的相互作用L（左）并发现ABT-737可以从Bcl-x中解包BakL（左）在PANC-1和BxPC-3细胞系中，表明这种作用可能有助于ABT-737增强TRAIL诱导的细胞凋亡的能力。
研究表明ABT-737不能靶向Mcl-1，因此Mcl-1降低了对ABT-736的反应性(33). TRAIL对Mcl-1表达的影响仍存在争议。在这方面，Han等人(15)表明TRAIL可以诱导Mcl-1降解和半胱氨酸蛋白酶介导的Mcl-1:Bim复合物的破坏。相反，Ricci等人(22)发现TRAIL可通过激活核因子κB诱导Mcl-1表达。在我们实验中使用的TRAIL剂量下，Mcl-1表达上调，与数据一致，数据表明这是通过激活核因子κB实现的(22). 我们还观察到ABT-737可能上调Mcl-1水平。这可能反映了Mcl-1的稳定性，因为它与从Bcl-x取代的Bim结合L（左）或ABT-737的Bcl-2(34).
重要的是，我们发现PANC-1细胞中Mcl-1的敲除增强了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的激活并增加了ABT-737的细胞毒性。这一结果与Mcl-1抑制可使肿瘤细胞对ABT-737增敏的研究一致(33). 胰腺癌细胞中丰富的Mcl-1蛋白和Mcl-1 shRNA产生的显著致敏作用表明，通过下调Mcl-1的策略可以增加细胞毒性。在这方面，泛Bcl-2拮抗剂Obatoclax（GX15-070）已被证明抑制Mcl-1，因此可能显示出更大的疗效增强(35). BH3-类似物GX15-070通过增强Noxa介导的Bak活化与硼替佐米在套细胞淋巴瘤中协同作用(35).
我们还评估了ABT-737和吉西他滨的联合用药。在与TRAIL联合使用的类似剂量的ABT-737中，我们发现ABT-736可以显著增强吉西他滨对PANC-1和BxPC-3细胞系的细胞毒性作用。这些数据显示了我们的发现与传统细胞毒性化疗的相关性。
总之，我们表明Bcl-x的禁用L（左）ABT-737和Bcl-2导致原生物Bcl-2蛋白释放Bim和Bak以诱导细胞凋亡。ABT-737还增强了TRAIL诱导的Bax构象变化。总之，这些机制是ABT-737增强TRAIL诱导的人胰腺癌细胞凋亡的能力的基础。而Mcl-1可以降低对TRAIL的敏感性(14,33)，ABT-737治疗足以增强TRAIL介导的凋亡，尽管其与Mcl-1的亲和力较低(13). 这些发现强调了前生存期Bcl-2蛋白释放Bim和Bak的潜在促凋亡作用，以增强TRAIL介导的细胞毒性。其他TRAIL耐药细胞系的实验尚待确定是否可以推广ABT-737和TRAIL的联合反应。正如本文所报道的，我们的数据提供了令人信服的证据，证明靶向外源性和内源性凋亡途径是一种潜在有效的新型治疗策略。我们的发现可能有助于合理设计针对胰腺癌和其他恶性肿瘤的组合方案。
致谢
拨款支持：由国家癌症研究所（Grant CA 104683）提供部分支持。
我们感谢Jonelle Morales非常出色的秘书协助，感谢Scott Kaufmann博士协助计算本报告中所述的组合指数。
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