跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
基因细胞。2010年5月；15(5): 501–512.
数字对象标识：10.1111/j.1365-2443.2010.01397.x号
预防性维修识别码：项目经理2948423
PMID：20384787

联合表达不同转基因基因在神经元和胶质细胞中的同时表达子宫内电穿孔Tol2（公差2）转座子介导的基因转移系统

吉田良子,1,† 山口义夫,1,2,† 野村惠子,1 川上光一,三 高桥义子,4和三浦正之1,2,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

子宫内电穿孔技术通过在胚胎发生过程中将质粒DNA导入神经祖细胞，被广泛用于研究神经元的发育和功能。这是一种将质粒DNA导入神经前体的有效且方便的方法，适用于操纵CNS细胞中的基因表达。然而，这项技术的适用性相对局限于神经元研究，因为在胚胎发生期间引入神经祖细胞的质粒DNA被细胞增殖稀释，并且在出生前后生成的胶质细胞中不能稳定地保持。为了克服这个限制，我们应用了Tol2（公差2）转座子系统将转基因整合到宿主细胞基因组中，以子宫内电穿孔。通过该系统，我们确认转基因在胚胎神经前体细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的后代中有效地保持。利用胶质细胞启动子GFAP和S100β，在胶质细胞中获得了靶向和稳定的转基因表达，使不同的转基因在神经元和胶质细胞中同时表达。导致神经元迁移缺陷的转基因的胶质靶向表达是在没有缺陷的情况下实现的。因此，使用收费2转座子系统与子宫内电穿孔是研究神经胶质细胞与神经元相互作用的有力方法体内.

介绍

过去十年积累的证据表明，胶质细胞不仅支持神经元存活，而且对神经网络的形成、操作和适应也有重要贡献(Wang&Bordey 2008). 虽然胶质细胞经常被研究在体外,体内需要进行调查以阐明其生理作用。目前，病毒转导和转基因方法被用于操纵胶质细胞中的基因表达体内(Levison&Goldman 1993年;烧伤等。2009). 然而，在出生后阶段引入感兴趣基因所需的手术会导致局部组织损伤，并通过小胶质细胞和星形胶质细胞诱导免疫反应，这使得在正常、非炎症条件下研究转基因变得复杂。尽管转基因方法是研究基因功能的强大而可靠的策略，但其经济成本限制了其应用。因此，需要一种更方便、侵入性更小的方法来通过操纵基因表达来加速神经胶质功能的研究体内.

子宫内电穿孔被广泛用于将转基因引入神经前体，以研究神经元的发育和功能(Fukuchi-Shimogori&Grove 2001年;Saito&Nakatsuji 2001年;Tabata&Nakajima 2001年). 与出生后阶段进行的手术病毒转移相比，这是一种方便且侵入性小的方法，类似于在ovo中电穿孔(村松等。1997;舟桥等。1999). 通常子宫内电穿孔法是将传统的表达质粒载体注射到胚胎脑的心室中，并使用电脉冲将DNA转移到心室附近的VZ（心室区）/SVZ（室下区）细胞中。在小鼠中使用这种方法的最佳发育阶段大约是胚胎期（E）10.5-16.5。虽然这种方法对研究神经元是有效的，但由于质粒在每次分裂时都被稀释，因此不适合将转基因保存在高度增殖的神经前体细胞及其后代神经胶质细胞中(Miller&Gauthier 2007年).

这个Tol2（公差2）转座子，来自medaka青鳉已被用于将转基因整合到鱼类、两栖动物、鸡和苍蝇的基因组中，以及在培养中整合到哺乳动物细胞中(川崎等。2000;川崎和野田佳彦2004;哈姆雷特等。2006;塔纳比等。2006;佐藤等。2007;瓦塔纳贝等。2007;浦崎等。2008). 在Tol2（公差2）转座子介导的基因转移系统（以下简称Tol2（公差2）系统）收费2转座酶（T2TP）介导转基因盒的整合Tol2顺式-进入宿主基因组的序列。我们报告使用了Tol2（公差2）带有的系统在ovo中鸡胚电穿孔及转基因在增殖细胞中的稳定表达(佐藤等。2007). 这些发现促使我们将Tol2（公差2）带有的系统子宫内电穿孔以改变小鼠大脑中神经胶质细胞中的基因表达。我们在这里报告了转座子介导的基因转移系统与子宫内电穿孔使转基因在（i）发育过程中的有丝分裂神经前体细胞（放射状胶质细胞）和（ii）出生后的大胶质细胞（包括皮质星形胶质细胞和少突胶质细胞）中稳定高效地表达。此外，该方法允许在这些细胞类型中用不同的标记物和/或基因表达的改变来标记神经元和胶质细胞，使用细胞类型特异性启动子来驱动不同的转基因。

结果

a的表达式Tol2（公差2）-侧翼基因在引入Tol2（公差2）转座子酶

神经前体细胞（放射状胶质细胞）的表达

我们首先研究了转基因是否克隆到Tol2（公差2）在脑发育过程中，在电穿孔神经前体细胞的后代中有效地维持了载体。为此，我们引入了一个含有CAGGS-EGFP的表达盒质粒，其两侧是Tol2顺式-带有或不带有质粒的序列（pT2K-CAGGS-EGFP）Tol2（公差2）转座酶（pCAGGS-T2TP）通过子宫内电穿孔并在E16.5检测脑中EGFP的表达。pCAGGS-DsRed1，包含不含Tol2顺式-序列，与其他质粒一起引入，作为电穿孔效率的标记(图1A). 当pCAGGS-T2TP不包括在内时，几乎只在皮质板中观察到表达EGFP和DsRed1的细胞(图1B). 相反，当pCAGGS-T2TP被包括在内时，EGFP表达更广泛：它在皮质板（CP）、中间区（IZ）、SVZ和VZ中表达(图1C). VZ中的一些EGFP阳性细胞具有延伸至心室区边缘的放射状胶质样突起(图1D，箭头)并且对神经前体标志物nestin呈阳性(图1E). 此外，这些前体中的一些位于有丝分裂发生的顶端，并且对有丝分裂标志物磷酸化H istone H3（PH3）呈阳性(图1F). 无论电穿孔效率如何，T2TP转导的VZ/SVZ中EGFP荧光强度都远高于未引入T2TP的相同区域(图1G). T2TP的作用不依赖于哪些荧光蛋白被Tol2顺式-序列（未显示数据）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为gtc0015-0501-f1.jpg

的持久表达式Tol2（公差2）-神经发育过程中增殖细胞的侧翼EGFP。（A） 导入小鼠胚胎背外侧端脑的质粒示意图。（B–D）冠状振动体切片显示大脑皮层在E11.5被电穿孔，并在E16.5被固定。（B） 没有转座酶。（C，D）带有转座酶。VZ的高放大视图如（D）所示。放射状胶质样突起用箭头表示。第4天（E16.5）观察到在E12.5导入的EGFP的表达，其中一些标记为放射状胶质细胞标记物（nestin，E）或有丝分裂标记物（PH3，F）阳性。右下面板中显示了XY、XZ和YZ的视图。（G） 电穿孔相对效率与保留时间的关系Tol2（公差2）-侧翼EGFP带或不带T2TP。电穿孔的相对效率表示为阴极保护中DsRed1的相对强度，以及Tol2（公差2）-侧翼EGFP通过评估SVZ/VZ中EGFP的相对强度进行评估。（H，I）保留Tol2（公差2）-晚期神经元的侧翼EGFP。（H–H′′）大脑皮层冠状冷冻切片在E12.5用T2TP电穿孔并固定在P8。软脑膜表面由白色虚线表示。（一） 表达Tol2（公差2）-侧翼EGFP和/或TagRFP。用HOECHST 33342（B–D，H）对细胞核进行复染。比例尺，250μm in（B，C，H，H′）和25μm in.（D–F）。

接下来，我们检查了Tol2（公差2）-侧翼转基因由电穿孔放射状胶质细胞的后代遗传。我们执行了子宫内在E12.5用pT2K-CAGGS-EGFP、pCAGGS-T2TP和对照质粒pCAX2-TagRFP电穿孔，并分析了表达EGFP和TagRFP的神经元在出生后第8天（P）的分布，此时径向神经元迁移基本完成。我们预计EGFP的表达会与TagRFP在皮层内层的表达重叠，但在外层的表达会比TagRFP延伸得更远，因为大脑皮层外层的神经元比内层的神经元出生得晚(高桥等。1999). 事实上，在第VI层到第II/III层上层发现了表达EGFP的神经元，而那些表达TagRFP的神经元主要局限于第VI层至第IV层(图1H，I). 这些结果表明Tol2（公差2）转座子酶稳定整合Tol2（公差2）-将转基因侧翼插入增殖神经祖细胞的基因组。

围生期胶质细胞的表达

随着神经前体细胞在出生前后从产生神经元转变为产生胶质细胞，我们接下来利用我们的系统检测了胶质细胞是否可以继承导入电穿孔神经前体电池的转基因。pT2K-CAGGS-EGFP通过子宫内在E14.5有或没有pCAGGS-T2TP的情况下进行电穿孔，并在神经胶质形态分化明显的阶段检测EGFP的表达（P16-17）。如前所示，当T2TP不表达时，EGFP仅在主要位于第II-IV层的锥体神经元中发现，后者出生于E14.5之后(图2A，左侧面板) (郎之万等。2007). 当T2TP与pT2K-CAGGS-EGFP共同导入时，EGFP不仅在皮质板的锥体神经元中表达，而且在形态和分布与神经元不同的细胞中也表达(图2A，右侧面板和B、C). 这些非神经元EGFP阳性细胞从SVZ到大脑皮层边缘区被观察到(图2A右侧箭头). 大多数表现出两种类型星形胶质细胞的特征：纤维状星形胶质细胞，主要位于I层和白质中，具有根状形态(图2B)和原生质星形胶质细胞，它们分布在整个皮层，呈浓密状(图2C) (Kimelberg 2004年).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为gtc0015-0501-f2.jpg

Tol2（公差2）-侧翼转基因由出生后产生的胶质细胞遗传。（A） 非神经元细胞的出现Tol2（公差2）-侧翼EGFP（右箭头）。电穿孔背侧端脑，在E14.5处引入pT2K-CAGGS-EGFP，无（左）或（右）pCAGGS-T2TP。在第16-17页对大脑进行分析。（B，C）高倍放大EGFP阳性细胞，非神经元形态，边缘区（B）显示纤维状星形胶质细胞，皮质板（C）显示原生质星形胶质细胞。（D–G）针对细胞类型特异性标记物对振动切片进行免疫染色。图2-4显示了1中插图的放大倍数较高的视图。EGFP表达细胞对GFAP（D）、S100（E）或Olig2（G）呈阳性，对神经元标记物NeuN（F）呈阴性。EGFP和细胞类型标记的合并图像如2所示。比例尺，250μm（A、D1、E1、F1、G1）和25μm（B、C、D2-4、E2-4、F2-4、G2-4）。软脑膜表面由白色虚线表示。

我们还通过GFAP免疫组织化学染色证实了这些EGFP阳性细胞的星形胶质细胞特性(图2D)对于S100(图2E). 这两种细胞类型都没有用抗NeuN的抗体标记，NeuN是一种神经元标记物(图2F). 一些非神经元EGFP阳性细胞对Olig2也呈阳性(图2G)表明转基因与神经祖细胞的稳定整合也导致了星形胶质细胞和少突胶质细胞系中的转基因表达(Levison&Goldman 1993年;小野等。2008).

胶质细胞中EGFP的表达几乎完全依赖于T2TP共电穿孔(图3A). 为了验证电穿孔细胞在出生后增殖，我们在发生强烈的胶质生成（P4）的阶段进行了BrdU标记，并观察了EGFP阳性细胞的有丝分裂(图3B). 因此，结合子宫内电穿孔Tol2（公差2）该系统能够在神经发生完成后出生的胶质细胞中表达转基因(图3C).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为gtc0015-0501-f3.jpg

这个收费2该系统通过有丝分裂细胞在出生后表达转基因。（A） 电穿孔相对效率与P16-17标记胶质细胞数量之间的关系。（B） 后有丝分裂细胞在P5保留转基因子宫内E14.5电穿孔。一些EGFP阳性细胞（绿色）对BrdU（品红色）也呈阳性。图中显示了插图的放大倍数较高的视图。比例尺，50μm（左侧面板）和10μm（右侧三个面板）。软脑膜表面由白色虚线表示。（C） 的示意图Tol2（公差2）转座子系统与子宫内电穿孔法。（1） 在没有转座酶的情况下，导入前体细胞的质粒在细胞增殖后被稀释，转基因的表达仅限于出生的细胞，并在电穿孔后很快成为有丝分裂后的细胞。（2） 使用Tol2（公差2）转座子，一种由Tol2顺式-序列整合到祖细胞的基因组DNA中，并由其后代（包括神经元和胶质细胞）继承。

使用细胞型特异性启动子的胶质靶向基因表达

虽然我们的方法允许使用广泛活性的CAG启动子和Tol2（公差2）系统中，从神经发生阶段到出生后，转基因的持续和强烈表达可能会影响神经元的发育，进而导致神经胶质的异常发育。为了剖析胶质细胞发育和生理功能的分子机制，需要以胶质细胞为靶点操纵各种基因。因此，我们使用了两种细胞类型特异性启动子，即小鼠GFAP的启动子(三浦等。1990)和S100β(万岁等。2003)主要在胶质细胞中表达，主要在星形胶质细胞中。

子宫内质粒编码的电穿孔Tol2（公差2）-由小鼠GFAP启动子（pT2K-GFAP-EGFP）和pCAGGS-T2TP在E14.5处驱动的侧翼EGFP进入新皮质的外侧VZ，导致在星形胶质细胞分布于整个皮质的阶段（P10-12），EGFP的表达仅限于星形胶质细胞(图4A). 在这些实验中，神经元被标记为TagRFP，由pCAX2-TagRFP质粒编码，该质粒在电穿孔过程中被共同引入，并且不在其两侧Tol2顺式-序列。几乎所有EGFP阳性细胞（92%）也表达内源性GFAP蛋白(图4B). 同样，S100β启动子驱动的EGFP（pT2K-S100β-EGFP）与pCAGGS-T2TP在E14.5共同电穿孔，导致分布在P10-12皮层的星形胶质细胞中EGFP表达(图4C). 大约84%的EGFP阳性细胞显示S100蛋白的共定位免疫反应性(图4D). 在两个实验中，EGFP的表达模式都是通过计数每层（I-VI层，白质：WM和SVZ）的细胞数量来评估的。表达pT2K-GFAP-EGFP的细胞倾向于定位于I层、WM层和SVZ层，而表达pT2K-S100β-EGFP细胞则分布于整个皮层(图4E). 总之，我们的数据表明，使用细胞类型特异性启动子实现了外源基因的胶质靶向表达。此外，对GFP的免疫染色显示出少突胶质细胞的典型形态，表明Tol2（公差2）转座酶通过以下途径将转基因导入星形胶质细胞和少突胶质细胞系子宫内电穿孔(图4F另请参见图2G) (泽林等。2004). 此外，这些实验证明两种不同的转基因可以同时独立地在星形胶质细胞和相邻神经元中表达(图4G).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为gtc0015-0501-f4.jpg

小鼠GFAP启动子和S100β启动子驱动转基因在胶质细胞中的靶向表达。（A–G）Astrocyte靶向EGFP的表达由小鼠GFAP启动子或S100β启动子驱动。E14.5端脑通过电穿孔引入pT2K-GFAP-EGFP（A，B）或pT2K-S100β-EGFP、pCAX2-TagRFP和pCAGGS-T2TP，并在P10-12进行分析。TagRFP在锥体神经元（A，C）中表达。（A2–7）（GFAP）或（C2–4）（S100）（白色箭头）显示了每个启动子和细胞类型标记的带有EGFP的双标记细胞的高倍视图。软脑膜表面由白色虚线表示。（B，D）EGFP阳性细胞中GFAP或S100阳性细胞的百分比。（B:124个细胞/4个大脑，D:632个细胞/5个大脑）（E）pT2K-GFAP-EGFP-或pT2K-S100β-EGFP阳性细胞在整个皮层的分布。垂直线表示每层中EGFP阳性细胞与大脑中总EGFP阳细胞的比率。每条线表示一个单独的大脑（GFAP；n个=4，S100β；n个=5). （F） 具有典型少突胶质细胞形态的细胞。（G） 分别用pT2K-S100β-EGFP和pCAX2-TagRFP对星形胶质细胞和神经元进行双重差异标记。比例尺，250μm（A，C，左），50μm（B，右六个面板，F），100μm（C，右三个面板）和25μm（G）。

接下来，我们检查了这些胶质细胞靶向启动子是否具有Tol2（公差2）该系统可以在不影响神经元发育的情况下表达转基因。众所周知，放射状胶质细胞在神经发生的后期开始表达GFAP，我们在电穿孔后4天的E18.5检测了pT2K-GFAP-或pT2K-S100β-EGFP的表达。通过抗GFP抗体免疫染色，在巢蛋白阳性的放射状胶质细胞中检测到pT2K-GFAP-EGFP和pT2K-S100β-EGFP的表达(图5A、B)尽管EGFP表达水平太低，无法在无染色的情况下进行可视化（数据未显示）。先前的研究表明，在CAG启动子下显性阴性或组成性活性形式Rac1（Rac1CA）的瞬时表达干扰了神经元的径向迁移(川内等。2003;科诺等。2005). 我们证实，当我们使用我们的系统在CAG启动子的控制下表达Rac1CA时，即使在神经元迁移完成后1周的P16，皮质板中也只有少数表达外源基因的神经元；大多数留在SVZ中，与瞬态表达式得到的结果一致(图5C) (科诺等。2005). 相反，当我们在小鼠GFAP或S100β启动子的控制下表达Rac1CA时，表达共电穿孔pCAX2-TagRFP的神经元通常位于神经元迁移几乎完成阶段的第II-IV层（P10）(图5D、E). 在整个皮层中也观察到表达Rac1CA的星形胶质细胞。然而，与对照组相比，标记的星形胶质细胞数量减少了(图5D–G)表明Rac1CA的表达可能影响早期胶质生成或存活。这些结果表明，使用胶质细胞靶向启动子Tol2（公差2）转座子系统有助于在不影响神经元发育的情况下研究神经胶质发育和生理相关基因的功能。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为gtc0015-0501-f5.jpg

在小鼠GFAP或S100β启动子控制下，组成活性Rac1（Rac1CA）的靶向表达不影响神经元迁移。（A，B）E18.5抗GFP免疫染色检测pT2K-GFAP-或pT2K-S100β-EGFP的表达。一些表达EGFP的细胞对放射状胶质细胞标记nestin呈阳性（箭头所示）。（C–G）表达pT2K-CAG-EGFP-Rac1CA（C）、pT2K-GFAP-EGFP-Rac1CA（D）、pT2K-S100β-EGFP-Rac1CA。通过抗GFP免疫染色（D–G）观察胶质靶向表达。在P16（C）或P10（D–G）检测E14.5处电穿孔的外侧新皮质。比例尺，50μm（A、B）、250μm（C，左侧面板，D–G）和100μm（C，最右侧的三个面板）。软脑膜表面或心室和SVZ之间的边界分别由白色或青色虚线表示。

讨论

子宫内电穿孔技术于2001年首次报道，现已广泛应用于发育生物学和神经科学领域(Fukuchi-Shimogori&Grove 2001年;Saito&Nakatsuji 2001年;Tabata&Nakajima 2001年). 然而，迄今为止，它的应用仅限于神经元。使用高浓度质粒可以在增殖的放射状胶质细胞中维持和表达转基因数天，因此对研究神经发生很有用。关于胶质生成，据报道子宫内使用较高质粒浓度或在后期进行电穿孔可导致胶质细胞转基因表达(Tabata&Nakajima 2001年;洛特科等。2009). 然而，这些策略并不总是能以可重复的方式在有丝分裂细胞中导致稳定的遗传，因此，它们不适合在出生后阶段进行神经胶质研究。事实上，还没有关于使用传统子宫内用于出生后神经胶质研究的电穿孔。此外，围生期/产后电穿孔或病毒转染可能导致组织损伤和炎症(布福等。2008;Silver&Steindler 2009年). 相反，结合子宫内电穿孔Tol2（公差2）-介导的基因转移系统允许在免疫系统不成熟时引入转基因，并且发育组织的可塑性提供了扰动。这对于研究胶质细胞是一个很大的优势，胶质细胞对出生后发育和生理环境中的环境变化都很敏感。这种“转基因预加载”子宫内已被逆转录病毒感染(沃尔什和塞普科1988;Noctor公司等。2001;Stott&Kirik 2006年). 逆转录病毒技术通过可视化发育过程中的单个细胞，对谱系追踪分析非常有用，尽管它需要耗时的逆转录病毒包装过程和严格控制病毒滴度。相比之下Tol2（公差2）该系统是一种将传统质粒表达载体和多种质粒表达载体整合到宿主细胞基因组中实现稳定表达的便捷方法。这些特征将有助于研究各种基因在胶质细胞中的作用。

先前的研究表明，神经元特异性Tα1启动子和放射状胶质细胞特异性nestin启动子可用于标记发育过程中的神经元亚型子宫内电穿孔(Tabata&Nakajima 2001年;女孩等。2006;王等。2007). 类似地，我们在这里展示了astrocyte靶向表达可以通过以下方式实现子宫内使用小鼠GFAP和S100β启动子结合Tol2（公差2）系统。虽然在E18.5处的放射状胶质细胞中观察到这两个启动子的表达，但我们可以在胶质细胞启动子的控制下特异性表达EGFP-Rac1CA，而不会干扰神经元的迁移。尽管需要进一步研究来确定星形胶质细胞和神经元之间的迁移机制是否不同，或者Rac1CA的过度表达是否对胶质生成和/或星形胶质细胞具有细胞毒性，但我们的结果强烈表明Tol2（公差2）-介导的基因转移系统在不影响神经元的情况下，对于研究神经胶质发育和生理相关基因的分子/细胞功能非常有用。

表达EGFP的星形胶质细胞的数量取决于电穿孔效率和T2TP质粒的数量，如图3A这表明可以通过改变注入心室的质粒的体积或浓度，在一定程度上调节标记效率。然而，这种实验操作固有的特点是，很难精确控制标记细胞的数量。至多，在S100β启动子的驱动下，每150μm P10脑片中可以成功且可重复地诱导400多个细胞表达EGFP（数据未显示）。这种转基因表达水平应足以检测单个胶质细胞的行为或检测报告基因的生物学过程体内在这方面，该系统应适合研究胶质细胞与神经元的相互作用体内，因为不同的转基因可以在神经元和胶质细胞中以互斥的方式表达，这极大地促进了这类研究(图4G). 同样，它将允许对胶质细胞的发育、胶质细胞与血管的相互作用以及胶质细胞对环境挑战的反应进行各种研究。这些用途可以通过将RNAi实验添加到库中来扩展，因为Tol2（公差2）该系统与RNAi的使用兼容，至少在鸡胚中是这样(瓦塔纳贝等。2007). 最近利用微阵列或蛋白质组学分析进行的详尽研究已经确定了许多以细胞类型特异性方式表达的基因。为了筛选胶质细胞中重要作用的候选基因，使用Tol2（公差2）-介导基因转移系统体内将允许操纵基因表达，减少感染或触发免疫反应的风险。因此，该方法可用于基因分析方法，如通过胶质细胞mRNA标记的TRAP系统体内(多伊尔等。2008;海曼等。2008).

总之收费2-介导的基因转移系统与子宫内除了病毒转染和转基因策略外，电穿孔是神经胶质研究的一个强有力的新选择。它将允许分析星形细胞发育和功能的许多方面，并方便有效地剖析负责基因的贡献。

实验程序

载体质粒

以前曾报道过pT2K-CAGGS-EGFP、pT2K-BI-EGFP和pCAGGS-T2TP的结构(佐藤等。2007). 为了制备pT2K-GFAP-EGFP，用生态RI取出包含TRE序列的磁带。该位点被钝化，并且含有小鼠GFAP启动子的钝化DNA片段，由pGF1L制备(三浦等。1990)带有Hin公司插入dIII。为了制备pT2K-S100β-EGFP，如前所述，通过PCR扩增了包含S100β启动子区域的4.8-kb小鼠基因组DNA序列(万岁等。2003). PCR产物插入Nde公司我-生态pT2K-BI-EGFP的RI位点。pT2K-GFAP-EGFP-Rac1CA和pT2K-S100β-EGFP-Rac1CA是基于pT2K-GFAP-EGFP，用Nco公司一、 或pT2K-S100β-EGFP，用生态RI，直截了当，消化了克拉I.用pEGFP-Rac1V12的DNA片段连接载体(安田等。2004)，PCR扩增（引物：5′；CATGCCATGGTGAGAGGAGGCGAGG，3′；CCATCGATTACAGCAGCGC），用克拉I.为了制作pT2K-CAG-EGFP-Rac1CA，用Xba公司我&生态用pEGFP-Rac1V12的DNA片段结扎RVNhe公司我&血红蛋白I.pCAX2-TagRFP由pCAX2制成，其中包含CAG启动子（上游巨细胞病毒增强子和鸡β-actin启动子序列）。pCAX2用生态RI和不是并与pTagRFP-N（#FP142；Evrogen）的DNA片段连接，该片段是通过用生态RI和不是一、。

动物、电穿孔和组织加工

对于子宫内电穿孔，我们在指定的妊娠日使用定时妊娠ICR雌性。用每克体重70μg的戊巴比妥钠麻醉小鼠。手术和操作按照描述进行(Tabata&Nakajima 2001年)修改如下。质粒浓度：0.5至3μg/μL，电极：分别用于E11.5、E12.5或E14.5的CUY650P3或CUY650P5（Nepa Gene），电子脉冲：分别为33 V、四倍、30或50 ms，间隔970或950 ms，用于E11.5，E12.5或EI4.5。子宫被轻轻替换，切口被关闭，正常发育得以继续。在E16.5和P17之间的时间点，通过颈椎脱位或2-4%PFA灌注固定法杀死小鼠，并切除大脑。将每个大脑浸泡在4%PFA中60–120分钟，嵌入2%低熔点琼脂（NuSieve®3:1琼脂；Lonza）中，并在震动器（VT1200S；徕卡）上切成150–180μm冠状切片。为了分析E16.5或18.5处放射状胶质细胞中转基因的表达或P8处神经元的分布，并评估BrdU的掺入情况，将固定的大脑沉入25%蔗糖中，然后将其嵌入O.C.T.化合物（樱花）中并冷冻在液氮中。在低温恒温器（CM3050S；徕卡）上切割冰冻冠状切片（20–30μm）(表1).

表1

引入的质粒浓度子宫内电穿孔（μg/μL）

E11.5处的CAG-EGFPE12.5处的CAG-EGFPE14.5处的CAG-EGFP出生日期标签GFAP/S100β-EGFPCAG-EGFP-Rac1CAGFAP/S100β-EGFP-Rac1CA
pT2K-CAGGS-EGFP公司0.60.633
pT2K-GFAP/S100β-EGFP1.5
pT2K-CAG-EGFP-Rac1CA2
pT2K-GFAP/S100β-EGFP-Rac1CA1.5
pCAGGS-T2TP公司1.51.50–2.01111
pCAX2-标签RFP0或1.50.5–1.010.5–0.75
pCAGGS-Ds红色1.51.5
电穿孔→固定E11.5→E16.5E12.5→E16.5或P8E14.5→第16–17页E14.5→P5（BrdU注入物P4）E14.5→E18.5或P10–P12E14.5→P16E14.5→P10

免疫组织化学

初级抗体是多克隆兔抗tRFP Ab（AB232，1:1000稀释；Evrogen）、小鼠单克隆抗GFP Ab（#111814 460001，1:500或1:1000；罗氏）、兔多克隆抗GFP Ab（#598，1/1000；MBL）、兔多克隆抗PH3（06-570，1:500；Upstate）、小鼠单克隆抗巢蛋白（Rat401；爱荷华大学杂交瘤发展研究银行；1:50），小鼠单克隆抗GFAP（G3893，1:1000；Sigma），小鼠单克隆抗NeuN（MAB377，1:1000；Chemicon），兔血清抗Olig2（武林氏馈赠；1:1000），兔多克隆抗S100抗体（Z0311，1:500；Dako），大鼠单克隆抗BrdU抗体（ab6326，1:500，Abcam）和大鼠单克隆抗GFP抗体（#04404-26，1:1000；Nacalai-tesque）。将振动仪或冷冻器上切割的切片浸泡在PBST（PBS中0.1%Triton-X）中的封闭缓冲液（20%免疫块；DS Pharma Biomedical Co.，Ltd.）中30–60分钟，并在4°C下与PBST中的初级抗体孵育过夜（或最多几天）。在PBST中多次清洗后，将切片与荧光标记的二级抗体（Jackson Immunoresearch Lab）在4°C下孵育过夜。所有切片均用TOTO-3碘化物（T3604，1:3000；Invitrogen）或HOECHST33342（2μ米)标记细胞核。使用TCS SP5共焦显微镜（徕卡）采集图像。

定量分析

E16.5动物电穿孔的相对效率(图1G)通过冷冻切片上CP中DsRed1的相对强度进行估算。使用LAS AF软件（Leica）在共焦z叠加图像上的最大强度投影上测量荧光强度。通过测量相同切片上SVZ/VZ中EGFP的强度来确定T2TP对转基因保留的影响。根据形态学标准定义CP和SVZ/VZ。

在死后的动物身上(图3A)，电穿孔的相对效率（I）是通过振动脑片CP中EGFP的强度来估计的。每个切片的荧光强度由图像J根据其在配备摄像头的荧光立体显微镜（徕卡）上拍摄的照片进行测量。对于每个大脑，在一个切片中计算标记的胶质细胞的数量；使用CP中EGFP强度最高的切片。在共焦显微镜上观察切片，具有浓密形态（与神经元形态明显不同）的细胞被视为胶质细胞。由于共聚焦显微镜扫描的切片厚度和用于计数胶质细胞的面积在样本之间不同，我们通过将其除以体积（V）[切片厚度（μm）×面积]来标准化胶质细胞数（G）。为了表示（G）和（I）之间的关系，将（G）绘制为（I×V），即（G/V）与（I）。

为了分析GFAP或S100β启动子驱动的EGFP表达模式，在所有切片上用共焦显微镜对EGFP阳性细胞拍照并计数。这些数字按其位置分为大脑皮层、SVZ、WM和从第VI层到第I层。整个大脑中的表达模式以每个个体的总截面为单位，并绘制在图表中。

BrdU标签

新生小鼠子宫内在E14.5处电穿孔，在P4处注射100μg/g体重的BrdU，28小时后杀死。如前所述，从每个大脑制备冰冻切片，并在室温（rt）下用兔多克隆抗GFP抗体（1:1000）孵育3小时，然后在rt下用二级抗体孵育1小时。切片在rt下再次用4%PFA固定20分钟，在PBS中洗涤两次，在37°C下用2 N HCl孵育15分钟，在PBS中清洗两次，在4°C下用封闭缓冲液孵育30分钟，然后在4℃下用大鼠单克隆抗BrdU抗体孵育过夜。在PBST中清洗三次后，在rt时与二级抗体孵育1小时，然后装裱。

致谢

我们感谢K.Nakajima、K.Kubo和T.Shimogori对表演的指导子宫内电穿孔，H.Takebayashi检测Oligo2抗体，S.Narumiya检测Rac1V12质粒。我们也感谢三浦实验室的所有成员进行了有益的讨论。这项工作得到了日本教育、科学、体育、文化和技术部（给M.M.和Y.Y.）的资助，以及Astellas代谢紊乱基金会（给M.M）、Naito基金会（到M.M.）、细胞科学研究基金（到M.M）和RIKEN生物架构师研究基金（给M.）的资助。K.N.是日本科学促进会的研究员。

工具书类

  • Buffo A、Rite I、Tripathi P、Lepier A、Colak D、Horn AP、Mori T、Gotz M。反应性胶质瘤的起源和后代：受损大脑中多能干细胞的来源。程序。美国国家科学院。科学。美国。2008年；105:3581–3586. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Burns KA，Murphy B，Danzer SC，Kuan CY。发育和损伤后皮质胶质生成：Nestin-CreER小鼠的基因命运图谱研究。格利亚。2009;57：1115–1129。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Doyle JP、Dougherty JD、Heiman M、Schmidt EF、Stevens TR、Ma G、Bupp S、Shrestha P、Shah RD、Doughty ML、Gong S、Greengard P、Heintz N。翻译剖面法在CNS细胞类型比较分析中的应用。单元格。2008年；135:749–762. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Fukuchi-Shimogori T，Grove EA公司。分泌信号分子FGF8的新皮质模式。科学。2001年；294:1071–1074.[公共医学][谷歌学者]
  • Funahashi J、Okafuji T、Ohuchi H、Noji S、Tanaka H、Nakamura H。Pax-5在调节中后脑组织者活动中的作用。发展增长差异。1999;41:59–72.[公共医学][谷歌学者]
  • Gal J、Morozov Y、Ayoub A、Chatterjee M、Rakic P、Haydar T。小鼠新皮质增生区神经前体的分子和形态异质性。《神经科学杂志》。2006;26:1045–1056. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hamlet MR、Yergeau DA、Kuliyev E、Takeda M、Taira M、Kawakami K、Mead PE。Tol2转座子介导的热带爪蟾转基因。起源。2006;44:438–445.[公共医学][谷歌学者]
  • Heiman M、Schaefer A、Gong S、Peterson JD、Day M、Ramsey KE、Suarez-Farinas M、Schwarz C、Stephan DA、Surmeier DJ、Greengard P、Heintz N.一种用于CNS细胞类型分子表征的翻译分析方法。单元格。2008年；135:738–748. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kawakami K，Noda T.Tol2元素在小鼠胚胎干细胞中的转位，Tol2是一种取自日本水母鱼美洲稻的类Ac元素。遗传学。2004;166:895–899. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kawakami K，Shima A，Kawakamin N.鉴定Tol2元件的功能转座酶，这是一种来自日本水母鱼的类Ac元件，及其在斑马鱼生殖系中的转座。程序。美国国家科学院。科学。美国。2000;97:11403–11408. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 川口T、Chihama K、Nabeshima Y、Hoshino M.The体内STEF/Tiam1、Rac1和JNK在皮层神经元迁移中的作用。EMBO J。2003;22:4190–4201. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kimelberg H.星形胶质细胞身份问题。神经化学。国际。2004;45:191–202.[公共医学][谷歌学者]
  • Konno D，Yoshimura S，Hori K，Maruoka H，Sobue K。磷脂酰肌醇3-激酶/rac1和cdc42途径参与皮层神经元的径向迁移。生物学杂志。化学。2005年；280:5082–5088.[公共医学][谷歌学者]
  • Langevin L、Mattar P、Scardigli R、RoussignéM、Logan C、Blader P、Schuurmans C.验证子宫内电穿孔用于快速分析小鼠端脑中的基因调控元件。开发动态。2007;236:1273–1286.[公共医学][谷歌学者]
  • Levison S，Goldman J.少突胶质细胞和星形胶质细胞均由出生后大鼠前脑脑室下区的祖细胞发育而来。神经元。1993;10:201–212.[公共医学][谷歌学者]
  • LoTurco J、Manent JB、Sidiqi F子宫内发育中大脑皮层的电穿孔研究。塞雷布。科尔特斯。2009;19（补充1）：i120–i125。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Miller F，Gauthier A.时间决定一切：在发育中的皮层中制造神经元与胶质细胞。神经元。2007;54：357–369。[公共医学][谷歌学者]
  • Miura M，Tamura T，Mikoshiba K.小鼠神经胶质原纤维酸性蛋白基因的细胞特异性表达：星形胶质细胞特异性表达的顺式和反式作用启动子元件的鉴定。神经化学杂志。1990;55:1180–1188.[公共医学][谷歌学者]
  • Muramatsu T，Mizutani Y，Ohmori Y，Okumura J.三种非病毒转染方法对卵子早期鸡胚中外源基因表达的比较。生物化学。生物物理学。Res.Commun公司。1997;230:376–380.[公共医学][谷歌学者]
  • Noctor S、Flint A、Weissman T、Dammerman R、Kriegstein A。来自放射状胶质细胞的神经元在新皮质中建立放射单位。自然。2001年；409:714–720.[公共医学][谷歌学者]
  • Ono K、Takebayashi H、Ikeda K、Furusho M、Nishizawa T、Watanabe K、Ikenaka K。前脑Olig2祖细胞分化的区域和时间依赖性变化，以及对背侧大脑皮层星形胶质细胞发育的影响。开发生物。2008年；320:456–468.[公共医学][谷歌学者]
  • Saito T，Nakatsuji N.使用体内电穿孔。开发生物。2001年；240:237–246.[公共医学][谷歌学者]
  • Sato Y、Kasai T、Nakagawa S、Tanabe K、Watanabe T、Kawakami K、Takahashi Y。电穿孔转基因在鸡胚中的稳定整合和条件表达。开发生物。2007;305:616–624.[公共医学][谷歌学者]
  • Silver DJ，Steindler DA。大脑发育、损伤和癌症期间常见的星形细胞程序。《神经科学趋势》。2009;32:303–311. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Stott S，Kirik D.目标子宫内逆转录病毒载体在啮齿动物大脑中的基因转移。《欧洲神经科学杂志》。2006;24:1897–1906.[公共医学][谷歌学者]
  • Tabata H，Nakajima K.高效子宫内利用电穿孔技术将基因转移到发育中的小鼠大脑：发育中皮层神经元迁移的可视化。神经科学。2001年；103:865–872.[公共医学][谷歌学者]
  • Takahashi T，Goto T，Miyama S，Nowakowski RS，Caviness VS.，Jr神经元起源序列和新皮质层命运：与发育中小鼠脑壁起源细胞周期的关系。《神经科学杂志》。1999;19:10357–10371. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tanabe K、Takahashi Y、Sato Y、Kawakami K、Takeichi M、Nakagawa S.Cadherin是视网膜水平细胞树突状形态发生和突触末端组织所必需的。发展。2006;133:4085–4096.[公共医学][谷歌学者]
  • Urasaki A，Mito T，Noji S，Ueda R，Kawakami K。黑腹果蝇中脊椎动物Tol2转座因子的转座。基因。2008年；425:64–68.[公共医学][谷歌学者]
  • Vives V、Alonso G、Solal A、Joubert D、Legravend C。EGFP转基因小鼠中枢神经系统中S100B阳性神经元和胶质细胞的可视化。J.公司。神经醇。2003;457:404–419.[公共医学][谷歌学者]
  • Walsh C，Cepko CL.克隆相关的皮层细胞显示出几种迁移模式。科学。1988年；241:1342–1345.[公共医学][谷歌学者]
  • Wang DD，Bordey A.星形胶质细胞之旅。掠夺。神经生物学。2008年；86:342–367. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wang X，Qiu R，Tsark W，Lu Q.小鼠大脑发育中的快速启动子分析和双皮质激素DsRed表达对年轻神经元的遗传标记。《神经科学杂志》。物件。2007;85:3567–3573.[公共医学][谷歌学者]
  • Watanabe T、Saito D、Tanabe K、Suetsugu R、Nakaya Y、Nakagawa S、Takahashi Y。Tet-on诱导系统结合卵内电穿孔分析了基因在鸡胚体细胞发生中的多重作用。开发生物。2007;305:625–636.[公共医学][谷歌学者]
  • Yasuda S、Oceguera-Yanez F、Kato T、Okamoto M、Yonemura S、Terada Y、Ishizaki T、Narumiya S.Cdc42和mDia3调节微管与动粒的连接。自然。2004;428：767–771。[公共医学][谷歌学者]
  • Zerlin M，Milosevic A，Goldman JE。新生脑室下区的神经胶质祖细胞异步分化，导致神经胶质克隆的空间分散，并导致未成熟神经胶质在成年哺乳动物中枢神经系统中持续存在。开发生物。2004;270:200–213.[公共医学][谷歌学者]
文章来自基因到细胞由以下人员提供威利