肿瘤等位基因特异性拷贝数分析

乳腺癌中异常肿瘤细胞的倍性和分数。

为了研究非整倍体和非异倍细胞在乳腺癌中的相关性，我们检查了乳腺癌系列的倍性和异常细胞分数估计。由于病理学家对肿瘤样本进行了宏观解剖，以尽可能多地去除周围的非肿瘤组织，因此异常的细胞分数估计将反映肿瘤内的非癌细胞，而不是肿瘤周围的正常细胞。我们发现肿瘤平均浸润了49%的非癌细胞，其中45%的细胞倍性为2.7n或更高。这些结果证实了同时考虑非增殖细胞混合物和肿瘤非整倍体的重要性。

根据561转录物的表达模式，乳腺癌可分为五种不同的亚型(13). 这五个亚组，即内脏A、内脏B、ERBB2、基底样和正常样乳腺癌，与不同的临床结果相关(14). 我们将倍性和异常细胞分数估计值与这些基于基因表达的乳腺癌亚型相关联。按乳腺癌亚型对异常细胞的估计百分比进行分层显示出显著差异(图3A类)Luminal A亚型的异常肿瘤细胞比例最高，ERBB2和Normal-like亚型的比例最低。根据分子亚型分层的肿瘤倍性评估显示，Luminal A、Basal-like和Normal-like亚型的倍性最低，ERBB2亚型的倍率最高(图3B类). 对于Luminal A亚型来说，特定的倍性分布及其特征性的畸变少（以及偏好涉及整个染色体臂的畸变）意味着这些肿瘤具有共同的二倍体状态，少数子宫内膜癌通过内复制进行多倍体化（只有少数额外畸变），导致四倍体状态。

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图3。

五种乳腺癌亚型中异常肿瘤细胞和倍性的百分比。使用的分子亚型：LumA、Luminal A(n个= 45); 亮度B，亮度B(n个= 10); ERBB2号机组(n个= 12); 基色、类基色(n个= 12); 正常，正常(n个= 8). (A类)五种亚型中异常肿瘤细胞百分比的分布。方框图显示了中间值（粗线）和上下四分位数（方框）。晶须达到盒子四分位范围1.5倍内的最大极值。而内脏A癌的异常肿瘤细胞水平最高(P（P）= 6.9 × 10⁻⁶，未成对t吨不等方差检验、鲁米纳A亚型与所有其他癌之间的差异检验），ERBB2和正常亚型肿瘤的异常细胞比例最低(P（P）= 3.7 × 10⁻⁴和P（P）= 8.4 × 10⁻³）。(B类)五个亚型的倍性分布。绝大多数Luminal A肿瘤的倍性接近2n，而较小部分的倍性则接近4n。鲁米纳B亚型癌在2n和4n肿瘤中的分布大致相同，其中两个肿瘤为3n。平均而言，ERBB2亚组表现出最高水平的倍性，但范围也最广。Basal-like亚组显示出倍性为1.6n–2n的病例和2.8n–3.2n的病例。正常类肿瘤显示一组倍性接近2n的病例和一组倍性高于3n的病例。

ASCAT档案允许准确分析收益、损失、LOH和拷贝数中性事件，并允许深入了解肿瘤发展。

人群中的得失频率可以从ASCAT曲线中推断出来。在我们的乳腺癌系列中，这导致了与以前的（array-CGH）报告相类似但略为显著的模式(15–17) (图S6A类). 然而，与直接从Log R数据中得出的结果相比，分子亚型分层导致ERBB2和正常型亚型的增益和损耗频率明显更高(图S6B类). 因此，与之前的报告相反，之前的报告仅描述了这两种亚型的有限数量的畸变(15–17)ASCAT配置文件的使用带来了明显的收益和损失。由于ERBB2和正常型亚型中非阳性细胞的比例较高，早期方法忽略了这些畸变(图3A类)，这是使用ASCAT配置文件时考虑的一项功能。

ASCAT配置文件还允许我们调查LOH和复制中性事件。这是不可能使用直接评估肿瘤样本的SNP阵列数据的，因为与细胞混合后没有显示这些事件。基因组中出现了一种独特的LOH模式(图4A类)，LOH在染色体臂8p、11q、16q和17p上最常见。16号染色体的q臂显示了LOH的最高比例，包括位于钙粘蛋白家族多个成员中的其他SNP（例如。，CDH1型,CDH3型,CDH15型,CDH13型、和CDH8型). 对拷贝数中性事件频率的计算表明，许多区域的频率高于20%，有些峰值高达50%(图4B类). 我们在这里将拷贝数中性事件定义为生殖系中SNP杂合子的等位基因偏见，使得总拷贝数与肿瘤倍性没有差异。根据这个定义，拷贝数中性事件是指阵列CGH无法检测到的所有基因组畸变。我们观察到，许多丢失频率较高的基因组区域也更有可能存在拷贝数中性事件。这在染色体/染色体臂1p、2、3、4q、9q、15和19p中尤为明显。这表明，实际损失的频率（一个等位基因的损失，可能与另一个等位数的增加相结合）远高于先前报道的频率（仅考虑DNA总量，而不区分两个等位蛋白）。另一个值得注意的是染色体17q，它显示了高频率的增益和较高水平的拷贝数中性事件。这个染色体臂包含了ERBB2号机组基因，一种因与乳腺癌相关而闻名的基因。第2、3、4、6、12和15号染色体的拷贝数中性事件的总体频率最高，这些染色体以前未被报道为乳腺癌基因组畸变的关键区域，这表明拷贝数中性的事件可能代表了乳腺癌基因组异常的一个尚未探索的as-y图。

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图4。

LOH和拷贝数中性事件的频率。(A类)基因组中LOH的频率。探针沿基因组顺序显示x个轴，从染色体1到染色体X，不同的染色体由灰色线分隔。(B类)基因组中拷贝数中性事件的频率。对于二倍体肿瘤，拷贝数中性事件对应于LOH的子集（拷贝数中性LOH），但对于四倍体肿瘤来说，拷贝数中立事件也可以是a的三个拷贝和B的一个拷贝(C类)按乳腺癌分子亚型分层的每例LOH比例（肿瘤中失去杂合性的生殖系杂合探针的百分比）。使用的分子亚型和方框图图例与图3与其他四种亚型相比，发光蛋白A亚型的LOH发生率显著降低(P（P）= 2.3 × 10⁻⁶，未成对t吨具有不等方差的测试）。更引人注目的是基底细胞样亚型的LOH水平升高(P（P）= 1.0 × 10⁻³). 事实上，三分之二的Basal-like肿瘤在40%以上的基因座杂合生殖系中显示LOH。(天)按乳腺癌分子亚型分层的每个病例拷贝数中性事件的比例。夜光A(P（P）= 4.7 × 10⁻³，未成对t吨用不相等的方差进行检验，检验鲁米纳A亚型和所有其他癌症之间的差异）和正常型(P（P）=0.95）子类型显示低水平的拷贝数中性事件，Luminal B子组显示中等水平(P（P）=0.99），以及类似巴萨的(P（P）=0.043）和ERBB2亚型(P（P）=0.064）显示拷贝数中性事件的最高频率。

乳腺癌亚型全基因组LOH和拷贝数中性事件谱的分层揭示了迄今为止未知的差异(图4C类和天). 在Basal-like亚型中，LOH的发生频率明显更高(P（P）= 1.0 × 10⁻³由一个未结婚的人t吨用不等方差检验，检验基底样癌和所有其他癌之间的差异）。这一观察，结合基底样乳腺癌的特殊倍性范围(图3B类)，使我们假设Basal-like肿瘤的基因组最初从二倍体减少到部分单倍体状态（约1.5n），随后进行全基因组复制，导致约3n倍体(图S7).

ASCAT算法。

Illumina SNP阵列提供两个输出轨迹：Log R（测量总信号强度）和B等位基因频率（BAF）（测量等位基因对比度）(25). Log R轨迹类似于通用阵列CGH平台的输出，并量化了每个基因组位点的（总）拷贝数。BAF轨迹显示了两个可选核苷酸（称为“A”和“B”）中的每一个在所描述的每个SNP位点上的相对存在。

两种复发现象使癌症样本的基因型分析复杂化，在我们的研究中也经常发生：非遗传细胞浸润和肿瘤细胞非整倍体(图S1). 我们表示Log R和BAF数据(第页和b）作为等位基因特异性拷贝数的函数(n个_{A、 我}和n个_{B、 我})，解释非增殖细胞浸润和肿瘤非整倍体(SI材料和方法详细信息）：

在等式。1和2,我代表基因组位置，γ是一个常数，取决于所使用的SNP阵列技术。样本的平均倍性由ψ=2（1）建模−ρ)+ρψ_t吨，带ψ_t吨肿瘤倍性（范围为1.6～4.8，对应的肿瘤倍性范围为1.6n～4.8n）。样本的畸变细胞分数由ρ（介于0和1之间的值）建模。参数γ可从文献中获得(25)（100%纯样品中缺失时，为Log R的下降），而ρ和ψ_t吨需要根据每个肿瘤样本的数据分别进行估计。基于这些方程，我们可以将等位基因特异性拷贝数估计值表示为数据和参数的函数(SI材料和方法).

为了使我们的方法对输入数据中的噪声不太敏感，Log R和BAF都通过一种专门设计的分割和滤波算法——Allele-Specific Piecewise Constant Fitting（ASPCF）进行了预处理(SI材料和方法详细信息）。首先，将种系DNA纯合子的探针（即高度为0和1的BAF带中的探针）从BAF轨道中移除，因为它们对于确定总拷贝数没有信息。因为我们的乳腺癌系列由血液和肿瘤对组成，所以我们使用血样中产生的基因型来消除种系中的纯合探针(图S2A类). 然后，ASPCF将分段常数函数同时拟合到Log R和BAF数据，要求变化点出现在两个拟合函数中的相同基因组位置(图S2B类). 因此，获得了基因组的分段，每个分段对应于两个相邻变化点之间（或变化点和染色体臂的起点/终点之间）的基因组区域。对于Log R，为每个段获得一个拟合值，而对于BAF，ASPCF的输出可能由每个段的一个或两个值组成。这些值在0.5左右对称。如果发现异常细胞处于平衡状态（As和B的数量相等），则只返回一个值0.5。如果异常细胞表现出等位基因偏倚，它将出现在两个方向上（例如，ABB和AAB基因型的SNP都会出现），导致ASPCF输出两个对称值，约为0.5(图S2B类).

这些ASPCF平滑数据随后用作ASCAT算法（在R中实现）的输入，以估计参数ρ（畸变细胞分数）和ψ_t吨（肿瘤倍性），以及绝对等位基因特异性拷贝数调用(和). 利用真拷贝数是非负整数的事实，我们寻找ρ和ψ的值_t吨因此，等位基因特异性拷贝数估计值尽可能接近种系杂合SNP的非负整数。ρ和ψ的最佳值_t吨估计如下：

• (我)计算ρ（0.10，0.11，…，1.05）和ψ网格下的基因组等位基因特异性拷贝数分布_t吨值（1.00、1.05…、5.40）
• (ii（ii）)对于每个参数-值组合，计算所有SNP的全基因组等位基因特异性拷贝数谱到非负整数解的总距离并求和(等式。三).
• 
• 这里圆形（）函数四舍五入到最近的非负整数。重量w个_我对于具有等位基因偏倚（BAF≠0.5）的片段中的探针，=1，以及w个_我无等位基因偏倚片段中的探针=0.05（BAF=0.5），因为前者被认为更可能是异常片段。
• (三)确定了所有局部最小值，并将其视为数据的可能解释。对于每一种可能的解释，都会计算一个良好的分数。这是菲特的优点克计算为总距离与非负整数之间的线性比例缩放到百分比：克=100%，当d日=0和克=0时d日=当每个SNP的等位基因特异性拷贝数与非负整数相差0.25时获得的距离(). 值0.25被选为一个合理的最大距离（所有探针的平均值），考虑到此良好距离仅针对局部最小值进行计算。
• (iv（四）)ASCAT自动排除与不太可能的解释相对应的局部最小值：(1)倍性（计算为平均总拷贝数）超出用户定义范围（1.6n–4.8n）的解决方案(2)异常肿瘤细胞百分比过低的溶液（ρ<0.20）(三)“浮动”解决方案——显示基因组畸变但不显示任何等位基因拷贝数为0的SNP的解决方案（根据此标准，ASCAT避免在没有证据显示较高倍性时以较高倍性进行解释），以及(4)质量分数低于80%的解决方案。
• (v（v）)如果仍有一个候选解决方案，则报告此解决方案。如果仍然存在多个解决方案，则根据其拟合优度对这些解决方案进行排序，并报告排名最高的解决方案。对于报告的解决方案，ASCAT返回异常肿瘤细胞的百分比、肿瘤倍性（计算为平均总拷贝数）、拟合优度和肿瘤的全基因组等位基因特异性拷贝数分布（ASCAT分布），以及每个发现的异常的畸变可靠性得分(SI材料和方法详细信息）。

我们感谢Elmar Bucher和Tuuli Lappalainen提供的生物信息援助；Therese Sörlie分享与乳腺癌分子亚型的相关值；Grethe I.G.Alnaes和Fredrik E.Johansen执行部分Illumina基因分型；和Trond Stokke进行了有价值的讨论。基因分型的运营成本由挪威研究委员会拨款155218/V40和175240/S10（发给A.-L.B.-D.）、功能基因组学-Norsk ForskningsróD（挪威研究委员会）（FUGE-NFR）FUGE/NFR 181600/V11（发给V.N.K.）和Swizz Bridge Award（A.-L.B--D.）提供。实验室援助由挪威癌症协会拨款D99061（给A.-L.B.-D.）和D03067（给V.N.K.）资助。P.V.L.是佛兰德斯研究基金会（FWO）的博士后研究员，也是癌症研究所的访问科学家，由FWO和欧洲癌症研究协会的旅费资助。S.H.N.是挪威癌症协会（PK01-2007-0356）的博士后研究员，由Lillemor Grobstoks Legacy for Cancer Research提供旅费资助。C.M.P.得到了国家癌症研究所乳腺专业卓越研究计划拨款P50-CA58223-09A1、乳腺癌研究基金会和V癌症研究基金会的支持。