T细胞从CD4在胸腺中发育−CD8（CD8）−分化为CD4的双阴性人群+CD8（CD8）+成熟前双阳性群体转化为单阳性（SP）CD4+或CD8+细胞。CD4和CD8基因具有不同的调节[在Kioussis和Ellmeier中综述(1)].
CD8共受体在大多数T细胞中表达为CD8αβ异二聚体；然而，肠道上皮内淋巴细胞或CD8+树突状细胞仅表达CD8αα同源二聚体(2,三). 这表明CDα和CD8β基因的表达是相互协调和独立调节的。CD8基因复合体位于一个80-kb的基因组片段中，该基因组片段包括转基因小鼠中适当发育和亚特异性表达的所有基因调控区域。利用转基因报告基因分析和位点中DNaseI超敏簇（cI-IV）的靶向缺失研究揭示了CD8基因在发育过程中的复杂调控模式，并为调控元件的功能冗余和层次结构提供了证据(4–10).
基因座控制区（LCR）为顺式-赋予基因组织特异性和发育时性表达的作用基因调控元件。第一个被鉴定的LCR是人类β-珠蛋白LCR(11)在对γδ-地中海贫血的研究之后顺式-调节DNA元件(12). LCR以表达细胞中的DNaseI超敏位点（HS）为特征，并根据其将组织特异性、拷贝数依赖性和位置-整合依赖性表达传递给链接的转基因的能力在功能上（而非结构上）进行定义(11). LCR被认为是通过建立活性染色质中心起作用的，并且还与基因位点从其染色体区域（CT）迁移到允许转录的核室（称为转录工厂）有关(13–15). 目前人们认为转录工厂可能是由高活性基因从头产生的，这些基因由强大的调控元件控制，如启动子、增强子和LCRs(16).
hCD2基因包含一个T细胞特异性LCR，位于其3′侧翼区域。与其他LCR相比，hCD2-LCR具有2-kb的大小和三个定义的DNaseI HS（HS-1、HS-2和HS-3）的单一组，其组成相对紧凑。DNaseI HS-1是一种经典的增强子，但在转基因小鼠中无法克服位置效应，而DNaseI HS-3对保护小鼠免受这种位置效应至关重要。对hCD2-LCR的研究表明，LCR通过克服异染色质介导的位置效应变异（PEV），在转基因小鼠T细胞中实现了位置无关的表达，无论其相对于连接启动子的方向如何(17–19). hCD2-LCR已成功用于驱动T细胞特异性表达连接的转基因，从而为研究淋巴系统提供了有价值的工具，例如表达特定TCR、荧光蛋白或cre公司重组酶(20,21).
在转基因结构中包含LCR可能会在整合点对相邻的内源性染色质产生影响；然而，这一过程在很大程度上仍未得到研究。最近，Noordermeer等人的一项研究(15)描述了人类β-珠蛋白-LCR插入基因丰富的染色体位置时与其环境的相互作用。
在这里，我们描述了mCD8基因复合体中hCD2-LCR整合位点不同的两个敲入小鼠系，以研究LCR对发育调控位点调控的影响。我们报告CD8基因位点最初由谱系中的LCR激活（CD4+CD8基因沉默的细胞；然而，在几个复制周期后，CD4内的负面影响+细胞抑制LCR的活动并沉默CD8位点。
结果
CD8基因在hCD2-LCR敲除小鼠T细胞上的表达。
为了确定特定基因组位点内hCD2-LCR的活性，我们制作了mCD8-（hCD2-LCR）敲除小鼠。为此，将LCR插入小鼠CD8基因座的两个不同位置(图S1)在小鼠CD8基因复合物的基因间区域内，但在已知的调控区域外(4). 我们已经将合成的两个敲除鼠系分别指定为CD8/LCR（cII-III）和CD8/LCR-（cIII-IV）(). 在两个CD8/LCR敲除系中，hCD2-LCR是CD8α启动子的5′和CD8β启动子的3′。然而，两个品系之间LCR与这些启动子的距离不同(). 本文中的结果来自CD8/LCR敲除小鼠（C57BL/6），除非另有说明，否则每个整合都是纯合的。
CD8/LCR敲除小鼠。靶向CD8基因复合物图，显示hCD2 LCR与CD8α和CD8β基因的整合位点。(A类)敲入线CD8/LCR（cII-III）(B类)敲入序列CD8/LCR（cIII-IV）（条纹盒，hCD2-LCR；填充盒，翻译外显子；开放盒，未翻译外显基因）。DNaseI-HS簇的位置如垂直箭头所示。限制性酶位点由垂直条（B，BamHI；C，Cla I；H，Hpa I）表示。水平线表示hCD2-LCR整合位点与CD8基因启动子的相对距离。
CD8/LCR敲除系脾外周血T细胞的比较显示CD4上CD8α和CD8β的表达+单元格(). 这表明在CD8基因复合体中插入hCD2-LCR可以解除其在谱系内某些细胞中的表达，这通常会关闭CD8的表达。然而，CD4之间的比率没有变化+和CD8+在外周器官中观察到单个阳性细胞和胸腺细胞总数和T细胞亚群的绝对数量().
小鼠CD8/LCR敲除的成熟T细胞中CD8辅助受体的表达。(A类和B类)αβTCR上CD8共受体的表达+通过分别绘制CD4与CD8α或CD8β的比值来分析脾细胞。(C类)CD4上CD8α和CD8β共受体的分布+T细胞。(D类)CD8中CD8α或CD8β表达水平的平均荧光强度（mfi）+淋巴细胞，以野生型水平的百分比表示。统计分析：未配对学生t吨测试(***P（P）≤ 0.001; **P（P）≤ 0.01). 误差条代表SD。
有趣的是，在CD4中+在敲除小鼠的血统中，我们检测到CD8基因座似乎对LCR的存在具有抵抗力的细胞。因此，敲入线（cII-III）显示了8.3%的CD4，敲入线上（cIII-IV）显示了44%+CD8表达被抑制的细胞(). 而≈CD4的90%+来自细胞系（cII-III）的细胞表达CD8共受体，无论是CD8αβ异二聚体（75%）还是CD8αα同二聚体+来自株（cIII-IV）的细胞将CD8共受体独家表达为CD8αβ异二聚体(). 这表明，hCD2-LCR在CD8位点不同位置的存在解除了CD4内CD8α和CD8β的差异表达+血统。
在CD8中+与野生型相比，我们观察到两种敲除系中CD8α和CD8β的表达水平显著增加，如平均荧光强度增加所示()表明hCD2-LCR对CD8内这些基因的转录具有增强作用+血统。
CD8/LCR敲除小鼠系的DNaseI分析。
为了确定hCD2-LCR是否破坏CD8基因复合体的正常染色质配置，我们评估了分选细胞群中CD8基因复合物基因调控区簇II（cII）的DNaseI超敏性。CD8基因复合物的簇II包含三个HS（cII-1、cII-2和cII-3），第三个位于CD8α基因的启动子区域(4). 来自两个CD8/LCR敲除系的总胸腺细胞的DNaseI分析揭示了野生型小鼠的预期超敏模式(4). 分类CD8中cII的DNaseI超敏反应分析+与野生型小鼠相比，这两种敲除系的外周血T细胞显示，LCR并不破坏cII-1和cII-3 HS的形成和维持(). 与野生型CD4相比+CD8基因位点在分类CD4中通常不显示DNaseI超敏反应的细胞+（CD8+)敲入系（cII-III）HSs cII-1和cII-3的外周血淋巴细胞可以检测到，尽管强度较低(). 另一方面，CD4+（CD8+)敲入系（cIII-IV）HS cII-1的淋巴细胞几乎不存在，HS cII-3较弱且弥散，这表明插入的LCR维持CD8α表达的机制在两个系中不同().
小鼠CD8/LCR敲除的T细胞中的DNase I HSs簇II。(A类)外周血CD8的DNaseI分析+，CD4+，或CD4+（CD8+)淋巴细胞。将BamHI消化的DNA与CD8αcDNA探针杂交。母带（8.7 kb和3.1 kb）和cII-1、cII-2和cII-3的带（分别为5.5 kb、3.8 kb和1.8 kb）用箭头表示。(B类)CD8基因复合物簇II的地图。水平条显示CD8αcDNA探针。水平箭头表示DNaseI HSs cII-1、cII-2和cII-3的条带大小。垂直箭头表示DNaseI HS的位置。
在hCD2-LCR中有三个DNaseI超敏反应区域(17). 为了评估hCD2-LCR的HS是否正确形成，我们对两个敲除系的胸腺细胞进行了DNaseI分析。Southern blot分析表明hCD2-LCR的三个HS正确形成(图S2).
与hCD2-LCR相关的CD8位点的核定位。
为了检测CD8基因在两个敲入系成熟外周血淋巴细胞核中的定位，将野生型脾脏T淋巴细胞以及4-6周龄的CD8/LCR（cIII-III）和CD8/LCR（cIII-IV）小鼠按亚群进行分类，纯度约为95%(). 如前所述，使用多色显带（mcb）片段4，从小鼠6号染色体的八个微切片重叠片段库中观察染色体主干(22,23). 多色带片段4从小鼠6号染色体的C1域延伸到C3域，并含有CD8α基因(). 因为这个探针识别了6号染色体的一小部分，所以被指定为“亚染色体区域”（sCT）。使用这种定位探针的优点是可以更准确地测量与相邻染色体位点相关的微小相对运动。为了使CD8α基因可视化，使用了含有CD8基因座的BAC克隆。
CD8/LCR敲除小鼠CD8基因的核定位。(A类)小鼠6号染色体重叠片段库。片段4（粗体）用于研究CD8在细胞核中的重新定位。(B–D类)用于分析的分类T细胞群。显示了事件的数量（n）和以微米为单位的平均距离。统计分析（未配对学生t吨测试）CD8基因与其sCT之间的距离(***P（P）≤ 0.001). (B类)野生型CD4中CD8基因信号中心到其sCT中心的距离+和CD8+淋巴细胞(P（P）= 0.00053). (C类)CD4中CD8基因与其sCT的距离+（CD8+)和CD8+来自敲除细胞系CD8/LCR（cII-III）的细胞(P（P）= 0.039). (D类)CD4中CD8基因与其sCT的距离+，CD4+（CD8+)和CD8+CD8/LCR（cIII-IV）敲除小鼠的细胞。[CD4+与CD4相比+（CD8+),P（P）= 0.190 × 10−13; CD4细胞+与CD8相比+,P（P）= 0.195 × 10−5].
为了测量基因与其区域的距离，评估基因信号中心到其sCT信号中心的距离(图S3).说明CD8α基因在外周CD4中的重新定位+和CD8+以野生型小鼠的SP细胞为对照。如前所述(22)，CD8基因在CD4中靠近其sCT的中心+SP细胞的平均距离为1.250μm。相反，在野生型CD8中+SP群体中，基因座从其染色体主干环出，平均距离为1.552μm。
探讨hCD2 LCR在CD8基因座中的整合如何影响CD4基因的核定位+，CD4+（CD8+)和CD8+使用CD8/LCR敲除小鼠的细胞。如所示，CD8位点的定位与其表达模式相关。因此，在（cII-III）小鼠CD8-表达的T细胞中，与非表达细胞相比，该基因更远离其染色体主干的中心，如[CD4中1.565μm+（第8页）+)CD8中为1.432μm+细胞数量]。类似地，在非表达（CD4+)来自（cIII-IV）小鼠的T细胞CD8位点保持在其sCT中心附近，平均距离为0.944μm。相反，在两个表达CD4的人群中，该基因远离其染色体主干+（CD8+)和CD8+与这些小鼠的平均距离分别为1.489μm和1.380μm(). 我们从这些结果得出结论，插入的LCR抑制CD4谱系中CT内位点的回缩，从而延长这些细胞中CD8的表达。
随着年龄的增长，CD4细胞上hCD2-LCR依赖性CD8表达的缺失。
年轻（≤2.5个月）和老年（≥8.5个月）小鼠外周T细胞CD8/LCR敲除的比较显示，尽管LCR持续存在，CD4的百分比+关闭CD8表达的细胞随着年龄的增长而增加。而CD4的15%+来自敲入系（cII-III）的年轻小鼠和来自系（cIII-IV）的43%的小鼠的细胞不表达CD8辅受体，在老年小鼠中，这些细胞数量分别增加到22%和86%(图S4A类). 比较CD4百分比的总结图+CD8（CD8）−年轻和老年CD8/LCR小鼠之间的细胞显示，这两种敲入系的变化具有统计学意义().
年轻与老年CD8/LCR敲除小鼠中CD8共受体的表达。(A类)CD4中CD8共受体表达的比较+年轻和老年CD8/LCR敲除小鼠之间的细胞。CD4的百分比+CD8（CD8）−外周T细胞中的细胞表达与CD4总量有关+细胞。(B类)CD44中CD8共受体的表达低的和CD44高的亚群体。CD4的百分比+CD8（CD8）−细胞表达与总CD4有关+细胞。(A类和B类)错误栏显示SD。统计分析：未配对学生的t吨测试(***P（P）≤ 0.001).
使用CD44细胞表面标记物对年轻敲除小鼠CD4细胞上CD8基因的表达进行分析，以区分幼稚和激活/记忆期T细胞，结果显示CD4的百分比+CD8（CD8）−在CD44中，两个敲除细胞系中的细胞都较高高的与CD44相比低的人口(和图S4B类).
在淋巴细胞减少宿主中转移后CD4细胞上hCD2-LCR依赖性CD8表达的缺失。
CD44细胞高的细胞经历了抗原和几个增殖周期。为了评估敲除系CD4 T细胞上CD8表达的缺失是否与增殖有关，我们转移了纯分选的CD4+（第8页）+)从敲入系（cII-III）到重组激活基因2（Rag2）缺陷小鼠的淋巴结细胞−/−). Rag2的淋巴减少环境−/−宿主诱导转移的细胞快速增殖，以补充外周T细胞室。转移的淋巴细胞的扩张与原始（CD44）的转移有关低的)至激活的（CD44高的)表型(24,25). 98%纯CD4过继移植后8周+（CD8+)来自敲入系（cII-III）的细胞群中，59%的淋巴细胞已成为CD4+CD8（CD8）−，并且只有40%的细胞保留CD4+（CD8+) (图S5A类). 进一步分析表明，67%的CD4+CD44细胞低的细胞仍然表达CD8共受体，而只有39%的CD4+CD44细胞高的细胞为CD4+（CD8+) (图S5B类).
更准确地定义CD4上CD8表达缺失之间的关系+我们将羧基荧光素二乙酸酯、琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的富含T细胞的淋巴结细胞从细胞系（cII-III）转移到Rag2−/−主机。这使得能够同时识别经过增殖的细胞以及这些细胞上CD8共受体表达水平。转移后7天，αβTCR+用流式细胞仪分析供体细胞，比较不同增殖程度细胞中CD8共受体的表达。显示分裂数的增加与CD4比例的增加相关+失去CD8共受体表达的细胞（从未分割群体中的13%到经历六次以上分裂的细胞中的59%）。
将CD8/LCR敲除淋巴细胞转移到淋巴细胞减少宿主。转移到淋巴细胞减少宿主后，CFSE标记的CD8/LCR（cII-III）淋巴细胞。CD4上CD8共受体的表达+用于注射的淋巴细胞（输入）。CD4的CFSE谱+移植后7天供体细胞（输出）。CD4中CD8表达谱+根据分割数划分的单元格。百分比与CD4总量有关+细胞。
为了评估CD8基因复合体中LCR的整合位点是否影响CD8共受体表达缺失的敏感性，我们将每个敲入系的淋巴细胞转移到Rag2中−/−并在转移后2或6周比较来自宿主小鼠的淋巴结和脾脏细胞。图S6显示CD4的百分比+CD8（CD8）−无论供体细胞来源如何，移植后2周细胞数量增加。我们得出结论，CD4的增殖+（CD8+)来自任何一个敲入系的细胞都会导致CD8表达的丧失，而LCR对CD4细胞施加了CD8表达+血统。
讨论
插入hCD2-LCR对外周血T细胞CD8表达的影响。
hCD2-LCR保护转基因不受位置-整合依赖性效应的影响，并已用于转基因中，以将连接的转基因表达导向所有T细胞(17,19). 构建体的随机和多拷贝整合限制了不同转基因株系的比较以及LCR与相邻染色质之间相互作用的分析。虽然已经进行了原位减少转基因拷贝数的研究，允许在同一整合位点比较拷贝数不同的转基因株系，但转基因的随机整合仍然是此类分析的主要限制(17,26,27).
在两个产生的mCD8-（hCD2-LCR）敲除小鼠系中，LCR相对于两个CD8基因的启动子处于相同的方向，但距离不同(). 观察到的LCR对两个CD8基因影响的差异可能归因于其与相关启动子的距离不同，这与已发表的发现一致，即启动子与LCR的远端位置具有竞争劣势(28).
因此，符合（cII-III）75%的CD4+细胞同时表达CD8α和CDβ基因，而在细胞系（cIII-IV）中只有48%表达CD8辅受体(). 在后一种情况下，CD8α基因的激活可能是速率限制步骤，由于CD8β链不能在没有CD8α链的细胞表面表达，因此表型FACS数据反映了CD8α位点的不完全激活(29). 事实上，当LCR插入一个等位基因上的cII和cIII之间，以及插入另一个等位基因上cIII和cIV之间时，小鼠表现出（cII-III）敲除小鼠的表型，这支持了CD8α基因在某些CD4中没有激活的观点+（cIII-IV）线中的细胞(图S7).
然而，由于距离不同，两个位点对LCR的差异竞争可能不是CD8α基因未完全激活的唯一机制性原因。这种“位置效应”的另一种解释可能是，在敲入序列（cIII-IV）中，LCR插入调控簇III的5′，而在序列（cII-III）中，它插入簇III的3′。过去，对小鼠CD8基因复合物簇III缺失纯合子的分析表明，上皮内淋巴细胞CD8α的表达受损，而上皮内淋巴细胞通常携带一个沉默的，可能是异染色质化的CD8β位点(30). 这些过去的发现和这里提供的数据暗示了簇III调控元件的其他功能，例如在两个CD8基因之间划分转录活性或隔离异染色质。
插入的hCD2-LCR对CD8基因复合物染色质结构的影响。
正常情况下，成熟CD4+不表达CD8共受体的淋巴细胞，CD8位点不是DNaseI超敏反应(7,30). CD4的DNaseI超敏反应分析+（CD8+)细胞群显示了两个敲除系之间cII染色质构型的差异。因此，在CD4中+（CD8+)CD4中CD8α的敲入细胞（cII-III）表达+细胞是通过维持cI-1和cI-3的超敏反应来实现的。相反，在CD4中+（CD8+)来自（cIII-IV）敲除小鼠的细胞仅CD8启动子保持与转录活性相关的实质性超敏反应(). 在基因敏感区插入人β-珠蛋白-LCR的敲除小鼠中，发现LCR的DNaseI超敏反应是以正确的组织特异性方式形成的(15). 类似地，hCD2-LCR的三个超敏位点也在插入位点中正确形成，这表明LCR可以与其全套因子相互作用，从而确保相关基因的激活(31) (图S2).
LCR对连接的CD8基因进行核重定位。
先前显示，在异源基因组基因座中异位插入LCR可诱导基因座的组织特异性重新定位，使其远离CT，并增加与转录工厂的关联(14,15). 在这两个敲入系中，CD8基因在CD4中外显表达+在所有表达CD8的细胞类型中，该基因座在距离其sCT中心相似的距离处循环，而在CD4中该基因座靠近sCT中心收缩+CD8（CD8）−单元格(). 这些结果并不一定意味着这些运动会将基因带到6号染色体的更宽域之外。我们的数据为大量新出现的信息提供了帮助，这些信息表明，对于含有LCR的基因座来说，转录有LCR独立和LCR依赖的步骤。因此，LCR已被证明对该位点广泛传播的超乙酰化，或对其远离着丝粒异染色质或核外围的重新定位都是不必要的(14,15,32). 然而，它们似乎有助于微小的核内运动，例如从CT中循环出一个位点。仅使用6号染色体的一小段作为CT的参考点，就可以检测到这种细微的运动。
LCR的影响随着扩散而下降。
而在hCD2-LCR报告转基因小鼠中，所有CD4细胞都表达转基因，而在CD8/LCR敲除小鼠中，一些外周CD4细胞表达转基因+αβTCR T细胞关闭CD8基因位点，表明CD4谱系内对LCR作用具有相反的活性(5,17,21). 在CD4中+谱系，LCR必须与几种正常关闭CD8基因表达的调节机制竞争。因此，在CD8/LCR敲除小鼠中CD4可能+停止表达CD8共受体的细胞会这样做，因为LCR不能推翻该细胞系中CD8基因复合体的正常异染色质化。
在这两个敲除序列中，CD4+SP细胞似乎特异性地聚集在CD44内高的这表明，一旦原始细胞被激活并成为记忆细胞，CD4谱系中沉默CD8基因复合体的正常机制将主导插入的LCR的激活作用(和图S4B类).
事实上，敲除供体CD4上CD8共受体表达的缺失+（CD8+)淋巴细胞在缺乏淋巴细胞的宿主中过继转移后，证实LCR活性的丧失与细胞的增殖史有关(和图S5). 因此，在CD4谱系中，LCR的作用似乎一直受到质疑，并且随着细胞增殖，通常导致CD8位点关闭的条件变得主导于LCR作用，这导致CD8共受体表达的终止。CD4中CD8表达的“延迟”终止+正常情况下，胸腺中CD8辅受体表达终止的细胞揭示了hCD2-LCR与内源性CD8调节元件和启动子之间的动态相互作用。
当复制叉穿过LCR区域时，染色质因子可能不稳定，随着细胞分化的进行，它们在位点上的恢复效率降低。在这种情况下，很难区分两种可能性：(我)活化因子的浓度随着分化而降低，或(ii（ii）)激活因子仍然存在，但其他沉默因子施加了与激活状态不兼容的新染色质构型。
应该注意的是，由于在大多数情况下增殖伴随着分化，这一过程可能会创造一个与hCD2-LCR功能不相容的新核环境。然而，这种可能性与许多转基因小鼠中的hCD2-LCR活性不一致，这些转基因小鼠将其用作调节元件，并且在分化细胞中的效力没有降低(20,21). 本文描述了发生这种情况的唯一情况，即LCR嵌入一个位点（CD8），该位点在压力下关闭特定（CD4）细胞系。
总之，对CD8/LCR敲除小鼠的分析表明，hCD2-LCR克服了CD4谱系大多数细胞中CD8基因复合体的正常发育沉默。当用作转基因时，敲除小鼠中的CD8表达在很大程度上反映了hCD2基因的调节，但在那些CD8基因被认为关闭的谱系中，CD8基因复合体中LCR的存在似乎持续存在争议。因此，随着细胞进行多轮复制，插入的LCR对内源性CD8基因启动子的影响似乎减弱。
材料和方法
生成mCD8-（hCD2-LCR）靶向结构。
生成目标构造的克隆策略如所述SI材料和方法.
ES细胞的转染和筛选。
如前所述进行ES细胞的转染和选择，详见SI材料和方法.
mCD8-（hCD2-LCR）敲除小鼠的产生。
所有畜牧业和实验程序均按照英国内政部法规和研究所指南进行。针对每个CD8/LCR靶向事件，来自两个独立ES克隆的小鼠表现出相似的表型；因此，仅从每个品系的一个克隆中产生了C57BL/6和纯合CD8/LCR敲除小鼠品系的回交。用于这些研究的所有小鼠都是从回交至少10次的小鼠到C57BL/6小鼠的后代。
流式细胞仪分析。
外周血淋巴细胞（106)以适当的组合用以下抗体染色：异硫氰酸荧光素（FITC）抗TCRβ（H57-597）、FITC抗CD44（Caltag）、藻红蛋白（PE）抗TCRβ（H57-597），PE抗CD4（RM 4-5）、PE抗CD44抗CD8α（53-6.7）、APC抗CD8β/Ly-3（eBio H35-17.2）和APC抗CD4（GK1.5）。FACS分析在FACSCalibur（BD Biosciences）上进行，数据使用FlowJo软件进行分析。抗体从eBioscience获得，除非另有说明。
细胞隔离。
使用Dynabeads（Invitrogen）去除B220、Ter119、Gr1或CD11b表达阳性的细胞。所有细胞分选均在MoFlo XDP（Beckman Coulter）上进行。对于转移实验，CD4+（CD8+)使用细胞。使用Invitrogen试剂盒进行CFSE标记。分类的CD4+，CD8+，或CD4+（CD8+)群体（纯度>97%）用于DNaseI分析，如前所述(7,17,19).
过继细胞移植。
抹布2−/−给受体小鼠静脉注射0.8×106分类CD4+（CD8+)CD8/LCR（cII-III）系或2×10系淋巴细胞6来自CD8/LCR（cII-III）或CD8/LCR-（cIII-IV）的T细胞富集的总淋巴结细胞。
3D FISH分析。
对于3D FISH分析，分类CD4+，CD4+（CD8+)和CD8+使用群体。如前所述制备、杂交和分析载玻片(22).
