开发高效的生物分离工艺以生产高纯度生物制药是当今制药和生物技术行业面临的最紧迫挑战之一。此外，用于复杂生物分析应用的高分辨率分离正变得越来越重要。虽然人们普遍认为非特异性相互作用通常会使单模色谱分离复杂化（例如，离子交换、反相），但这些额外的相互作用也会导致意外的选择性(1,2).
多模（MM）色谱系统设计的最新进展产生了以前未描述的色谱材料类别，与传统的单模色谱材料相比，这些色谱材料可以提供替代性和改进的选择性(三–9). Johansson等人开发了一个MM配体库，可用于在高盐条件下捕获带电蛋白质(4,5). Liu等人开发了一种硅基MM树脂，能够进行弱阴离子交换和反相相互作用，同时分离酸性、碱性和中性药物化合物(9). 小配体假亲和色谱材料，如用于疏水电荷感应色谱的材料，已经产生了以前未描述的MM配体类别，这些配体提供了独特的选择性，这主要是由于多个低亲和力MM相互作用，而不是与某些类蛋白质的特异性结合(10). 此外，最近开发了几个MM配体库，并将其用于色谱树脂中，用于生物混合物的筛选。该技术的应用范围包括制备蛋白质纯化(11,12)用于质谱分析的前端分离(13,14).
虽然MM树脂具有很大的生物分离潜力，但对这些配体与蛋白质表面结合的性质缺乏基本了解。我们最近使用了冷休克蛋白B突变体的同源文库来检测离子交换（SP Sepharose FF）和MM色谱表面（Capto MMC）上蛋白质结合行为的差异(15). 色谱实验表明，与SP Sepharose FF相比，Capto MMC对大多数蛋白质的保留更强。尽管该研究提供了MM色谱系统中蛋白质结合行为的隐含信息，有必要更直接地询问这些系统中MM-蛋白结合的潜在性质。
在本研究中，我们使用核磁共振滴定实验15N个/13将富含C的人类泛素作为模型蛋白，结合泛素突变体库获得的色谱数据，对MM配体与泛素结合的性质进行深入分析。结合位点通过一系列1H（H）-15不同配体浓度下的N相关光谱，以观察配体诱导的各种残基化学位移的变化。确定了MM配体特异性蛋白-配体相互作用的主要位点，并计算了结合区域内残基的离解常数，以确定和排序这些区域在蛋白质表面的相对结合亲和力。最后，利用粗颗粒配体对接模拟来研究MM配体与蛋白质表面确定的优先结合区之间的相互作用模式。核磁共振滴定实验与蛋白质库获得的色谱数据结合使用，代表了一种以前未描述的方法，用于探索MM色谱系统中蛋白质吸附的结构基础。
结果和讨论
线性梯度条件下突变株的色谱保留行为。
使用泛素突变体文库检查离子交换和MM色谱中蛋白质结合行为的差异（注：这些色谱材料的代表性配体显示在). 这些突变体包括单点突变，涉及降低表面疏水性、去除负电荷以及用精氨酸替换赖氨酸。测定了在线性梯度条件下获得的这些突变体在阳离子交换（SP-Sepharose FF）和MM（Capto MMC）色谱系统中的保留时间，结果显示在 A类和B类分别为。如中所示A类，所有变体（突变体D58A除外）表现出与阳离子交换器上的天然泛素类似的色谱行为。突变体D58A由于负表面电荷损失引起的静电斥力降低而表现出更强的保留力。这些结果是预期的，因为这些蛋白质（D58A除外）的净电荷和电荷分布是相同的。
的结构(A类)代表性阳离子交换色谱配体1-丙磺酸；(B类)代表性的多模色谱配体，N-苯甲酰-DL-甲硫堇。（注：这些配体固定在树脂上的位置用方框表示。）
突变变异体在线性盐梯度中的保留时间(A类)SP Sepharose FF和(B类)Capto MMC与天然蛋白质的比较（注：与天然蛋白质（灰色）和变体（条形）相关的误差由平均标准偏差确定）。
与蛋白质库在阳离子交换柱上相对较弱的保留相比，在相同的pH条件下，蛋白质在MM-Capto MMC柱上表现出较强的保留。例如，尽管蛋白质在大约0.22 M NaCl下从离子交换器中洗脱，但从MM系统中洗脱蛋白质需要显著更高的盐浓度（0.9–1.4 M）。此外，与离子交换系统观察到的行为相比，与MM表面的蛋白质结合亲和力存在显著差异。
如图所示B类在Capto MMC表面上观察到突变体的洗脱时间有显著变化。对于表面疏水性降低的突变体亚类，突变体F4A表现出与天然蛋白相似的亲和力，突变体L8A、I44A和V70A表现出吸附强度降低。这些结果表明，Leu 8、Ile 44和Val 70的疏水部分在天然蛋白与Capto MMC的结合亲和力中起着重要作用。另一方面，由于Phe 4疏水性的丧失不会影响蛋白质结合亲和力，因此该残基很可能不会与树脂表面发生强烈的相互作用。
如上所述，突变体D58A由于排斥性静电相互作用的损失，在离子交换系统中表现出更强的亲和力。然而，在MM系统中没有观察到同样的效果。事实上，未观察到变异保留行为的变化，这表明天冬氨酸残基可能位于蛋白质的一个区域，该区域对MM表面蛋白质保留的影响最小。
另一类突变体是表面赖氨酸被精氨酸取代的突变体。如图所示B类除Lys 29外，这些变体对MM表面的亲和力都有所增加。这种突变的影响是复杂的，因为精氨酸的胍基具有相对于赖氨酸的离域正电荷，并且具有可以形成多氢键的额外部分。此外，精氨酸的侧链被认为比赖氨酸的更疏水(16,17). 所有这些相互作用都可能在提高蛋白质表面对MM配体的亲和力方面发挥作用。此外，由于蛋白质亲和力的变化取决于赖氨酸残基的位置，这些结果也表明氨基酸的位置和周围微环境在确定氨基酸残基和配体部分之间的相互作用程度方面起着重要作用。
在这个MM系统中，检测蛋白质表面上对应于蛋白质保留的显著或最小变化的残基的位置是有指导意义的。如绿色所示()，Lys 6、Leu 8、Lys 11、Leu 44、Lys 48和Val 70位点的突变导致蛋白质吸附发生显著变化。另一方面，Phe 4、Lys 29、Lys 33、Asp 58和Lys 63位点（用蓝色表示）的突变几乎没有影响。如图所示，导致蛋白质保留率变化的位点都发生在蛋白质表面的一个不同区域，这可能表明与MM配体相互作用的首选结合区域。
基于多模色谱结果的泛素的彩色编码表面表示。绿色残基（6、8、11、44、48和70）在突变时显示出蛋白质吸附的显著变化，而蓝色残基（4、29、33、58和63）显示出很少或没有影响。
显然，这些色谱结果表明，阳离子和MM阳离子交换系统之间的结合亲和力和选择性都有显著差异。泛素文库在MMC柱中的结合明显更强，这表明配体-蛋白质相互作用位点可能发生协同作用。为了进一步了解这两种配体类型与蛋白质表面之间的相互作用，进行了异核序贯量子相关（HSQC）滴定实验。
1H（H）-15代表性色谱配体的N HSQC-NMR滴定实验。
蛋白质-甘氨酸滴定由1H（H）-15N HSQC，并使用MM阳离子交换配体的代表性类似物N-苯甲酰-DL-蛋氨酸进行(A类). 如中所述材料和方法，将等分的MM配体与固定浓度的同位素标记泛素进行滴定，以研究溶液中蛋白质-MM配体的相互作用。在这个核磁共振实验中，由于局部电子环境的扰动，蛋白质上与配体紧密接触并相互作用的标记酰胺基团发生了化学位移的变化。这些酰胺基团充当每种残留物的当地环境报告员。
在生成的2D系列中1H（H）-15N HSQC光谱中，每个酰胺基团都观察到蛋白质的未结合形式和配体结合形式的单一共振峰。线宽基本上没有交换展宽，并且具有配体依赖的化学位移值，其特征是蛋白质与配体相互作用的“快速交换”行为。因此，假设观测到的共振频率为时间平均值，并与单位点结合模型相吻合，如材料和方法.
观察到的化学位移变化表现出四种不同的模式(). 有些药物的位置与配体浓度没有关系(A类)表明这些残基与结合事件无关。其他残留物的迁移没有趋向饱和点(B类). 这种行为可能是由于非特异性和/或弱相互作用。在配体诱导的化学位移变化趋于饱和的位点中，观察到两类行为。这包括显示简单2态行为的位点，表明配体与单个近端位点结合引起的化学位移扰动(C类)以及显示更复杂的多站点行为的(D类). 当自旋由于多个非竞争结合事件而经历化学位移扰动时，化学位移的迁移通常以非线性方式发生，如所示D类这表明在站点之间的边界处发生了多相行为(图S1).
以下示例15N个-1在Capto MMC滴定实验中，H HSQC在0（红色）、0.64（橙色）、1.28（黄色）、1.92（绿色）、2.56（青色）和3.2 mM（蓝色）配体浓度下达到峰值。(A类)Asn 60是一种非结合残基(B类)Gln 2是一种显示化学位移变化的非结合残基(C类)Lys 6，一种结合残基，以及(D类)Phe 45，一种表现出多相行为的残基。
观察化学位移变化的分布以及这些变化如何在蛋白质表面上映射是有价值的。图S2一图中显示了在滴定实验中获得的泛素残基的最大观察化学位移变化（Δδ）。这些结果的结构表示如所示图S2b，显示了最大的化学位移变化是如何集中在蛋白质表面的一个不同区域的。尽管化学位移扰动数据可能有助于确定配体与蛋白质结合的相互作用，但这些数据的解释可能会因一些因素而变得复杂。最值得注意的是，可能没有直接与配体相互作用的相互作用位点外围的残基可能会由于靠近相互作用位点而遇到化学位移扰动。此外，与配体直接接触的残基不一定会发生显著的化学位移变化。此外，当附近存在多个相互作用时，很难确定离散的结合位点。
为了解决这些复杂问题，在滴定实验中检查化学位移的变化是有益的。在图S3为了进行比较，显示了由两个特定结合位点和一个非结合位点组成的几个残基的化学位移随配体浓度的变化。如图所示图S3，残基具有不同的离解常数，可以相应地分组为不同的结合位点。
从这一系列的1H（H）-15N HSQC光谱导致离解常数的测定(K（K）D类)根据单站点模型(材料和方法:等式2). 假定给定相互作用位点内的残留物具有类似的K（K）D类值。基于这些值、由配体大小决定的空间限制以及由表现出多相行为的位点定义的边界，将残基分组在一起，以确定蛋白质表面上的显式配体相互作用位点。MM配体-蛋白质滴定实验中获得的相互作用位点列表见A类，包括识别的相互作用位点的色码、每个位点内的残基以及相应的平均值K（K）D类值。（注：MM配体溶解度的限制限制了测定显式K（K）D类值大于15 mM。）如图所示A类，用K（K）D类0.4 mM，以及几个中间亲和位点（1-4 mM）。以下残基在核磁共振分析中显示出多相行为：F4、L8、F45、K48、H68和V70。虽然这些残留物不适合单个K（K）D类它们有助于突出假定结合位点之间的边界。
核磁共振测定多峰结合位点。(A类)数据包括色码结合位点、相关残基、平均离解常数(K（K）D类)，以及装配的标准误差K（K）D类值。(B类–D类)核磁共振测定泛素-MM配体相互作用位点的彩色编码表面表征。框状残基表示突变后蛋白质吸附发生显著变化的残基，而圈状残基则表示几乎没有影响的残基。显示多相行为的残留物以灰色表示。建议的首选结合区域用黑色表示。
蛋白质表面上的残基位置与核磁共振滴定实验中确定的相互作用位点相对应，如如图所示，蛋白质中正面上最强的相互作用位点（位点1）被其他几个中间亲和力相互作用位点包围。这五个结合位点都集中在蛋白质表面的离散区域，这表明这是与MM配体相互作用的优选结合区域。
尽管这些结果很有趣，但值得注意的是，核磁共振实验是在树脂中含有MM配体端基的自由溶液中进行的。当与含有固定化MM配体的色谱表面相互作用时，很可能在给定的时间内只有蛋白质的一个表面可以相互作用。因此，基于核磁共振结果和几何考虑，提出了一种蛋白质的拟议结合区，该结合区可以与色谱表面相互作用将核磁共振的配体相互作用结果与泛素突变体的色谱保留数据进行比较是有趣的。突变产生泛素蛋白库的氨基酸残基如用正方形或圆形表示。观察到，在MM柱上显示蛋白质保留时间可测量变化的蛋白库中的突变体（K6R、L8A、K11R、K48R、I44A和V70A）对位于优选结合区内的残基（用方块表示）进行了修饰。另一方面，位于远离优选结合区（F4A、D58A、K29R、K33R和K63R）的带有修饰残基（用圆圈表示）的突变体在色谱实验中导致蛋白质保留时间几乎没有变化。有趣的是，突变体L8A在MM柱上蛋白质保留时间减少最多，在优选结合区的外围表现出多相行为。此外，从中可以看出C类，Leu 8从蛋白质表面突起，这可能使其在结合MM色谱表面方面发挥更重要的作用。虽然突变体F4A在核磁共振中也表现出多相行为，但它位于突变体K11R在NMR实验中没有产生可测量的信号；然而，该残基位于提议的结合区域的外围，这可能解释了其色谱保留行为的适度增加。显然，将配体固定在固体载体上产生的空间效应可能会影响树脂表面所有变体的相对结合亲和力。未来的工作包括使用EPR和固态NMR，以进一步详细研究配体固定对蛋白质结合亲和力的亲和力和空间位阻效应。
用离子交换配体进行了一组类似的核磁共振研究。结果表明K（K）D类这些值比用MM配体获得的值大2个数量级。离子交换配体具有大于50 mM的结合常数，而多峰配体的结合常数范围为0.4至12 mM。与离子交换配体的较弱结合常数定性上与离子交换器上观察到的较低保留相一致(A类). 此外，与MM系统相比，与离子交换配体获得的相互作用位点分布在整个蛋白质表面。
进行粗粒度模拟以确定MM配体在图1所示最强相互作用位点内最可能的对接构象涉及Lys 6、Ile 44和His 68残基。为该相互作用位点确定的最低能量构象如所示如图所示，涉及多种相互作用，包括与Lys 6的电荷-电荷相互作用、与Ile 44的疏水相互作用以及与His 68的π-π堆积。这些多重相互作用可能是配体对蛋白质表面这一区域高亲和力的原因。当蛋白质吸附到固体底物上时，配体的多点连接也可能对近端位点的协同性很重要。
通过核磁共振确定的最强相互作用位点的粗粒度建模预测多峰配体结合构象。表面颜色表示核磁共振测定的结合位点().
虽然模拟表明该位点存在一个单一的低能结合构象，但模拟中还发现了其他具有较低亲和力的可能结合方向。这种与MM配体潜在结合方向的多样性可能在蛋白质吸附到MM色谱系统中发挥重要作用，其中配体固定在树脂上。在这些条件下，蛋白质与空间受限的配体相互作用，可能无法与蛋白质达到最小能量接触。然而，由于可以采用其他几种低能构象，该蛋白质可能仍然能够通过另一种相互作用模式与固定化MM配体相互作用。
结论
本文采用多方面的方法研究了MM色谱系统中蛋白质吸附的性质。蛋白质文库的色谱结果表明，蛋白质表面特定区域发生突变时，蛋白质对固体载体的亲和力发生了显著变化。核磁共振的结果进一步揭示了特定的MM配体结合位点，这些位点聚集在一起形成一个独特的优选结合区域，与色谱结果一致。蛋白质表面首选区域的结合位点聚集表明，MM色谱系统中的结合通过多个表位发生。然而，值得注意的是，核磁共振数据解释中的困难使得定义这些结合位点的准确边界变得非常困难。MM配体和首选结合区之间的粗颗粒配体对接模拟表明，涉及多种相互作用，包括电荷-电荷、疏水接触和π-π堆积。这些结果表明，化学多样性在创造MM色谱系统的高亲和力和独特选择性方面起着重要作用。
这项工作提高了对MM色谱中蛋白质结合亲和力的理解，并阐明了蛋白质表面上的配体相互作用位点。此外，其他与MM表面显着结合的蛋白质可能具有类似的假亲和行为，其表面具有不同的优先结合区域。此外，虽然这项工作侧重于蛋白质泛素，但我们认为，使用核磁共振、蛋白质库和分子建模的方法可以用于深入了解蛋白质-甘氨酸相互作用发挥重要作用的广泛系统（例如，生物分离、生物材料和药物传递）。特别是，这种方法可能有助于确定合适的MM配体和操作条件，以便从非常相似的变体中分离蛋白质，这是生物加工中的一个关键挑战。最后，虽然这里介绍的核磁共振和对接研究侧重于溶液中的配体与蛋白质的结合，但为了阐明这些系统中的亲和力和空间效应，未来检查蛋白质与含有MM配体的固体树脂系统的结合将很重要。
材料和方法
本研究中使用的材料和设备的详细信息见SI文本.
线性梯度实验。
在pH值为5的Capto MMC柱上分析突变变体。在60个柱体积中，以1 mL/min的流速从100%缓冲液A（20 mM醋酸钠，pH 5）到100%缓冲液B（20 mC醋酸钠，含1.5 M氯化钠，pH值5）进行线性梯度洗脱，以获得每个突变变体的保留时间数据。根据每个突变变体的初始浓度，使用25至50μL样品的注射体积。在280 nm紫外波长下监测柱流出物。除缓冲液B（20 mM醋酸钠和0.5 M氯化钠，pH 5）外，在相同的实验条件下，还在SP Sepharose柱上分析变体。
13C类/15N同位素标记蛋白的表达和纯化。
13C类/15通过培养BL21（DE3）菌株获得N个泛素样品大肠杆菌，包含基于MOPS的最小培养基中泛素变体的质粒(18)，0.2%13C葡萄糖作为碳源和0.2%15N氯化铵作为氮源。培养基中还添加了10 mg/L硫胺素和100 mg/L氨苄西林。当细胞肉汤通过添加1 mM IPTG达到0.6（600 nm）的光密度时，诱导泛素表达。通过离心收集细胞，并将其重新悬浮在裂解缓冲液中（50 mM Tris/HCl pH 7.5，含有DNAse的蛋白酶抑制剂混合物）。通过将细胞悬浮液通过三次法国压榨机进行溶解。通过在4°C下以12000 rpm离心1 h去除细胞碎片（Sorvall SS-34固定角转子）。通过向上清液中添加乙酸进行酸沉淀，直到溶液的pH值达到5.0。然后在4°C下以12000 rpm再次离心混合物1 h，以去除沉淀的蛋白质污染物。上清液通过0.2μm孔径的注射器过滤器过滤。将蛋白质溶液加载到16-mL SP Sepharose FF阳离子交换柱上，并使用线性梯度洗脱从100%缓冲液a（50mM醋酸钠，pH 5）到100%缓冲液B（50mM乙酸钠，含有0.5M氯化钠，pH值5）以1 mL/min的流速在60个柱体积中进行部分纯化。使用分子量截止值为3000 Da的Centriprep管进行离心，收集、汇集并浓缩含有泛素的洗脱液组分。蛋白质的最终纯化步骤是使用Sephadex G-50凝胶过滤柱进行的，该凝胶过滤柱与含有10 mM醋酸钠（pH 5.0）和0.02%叠氮化钠的缓冲液进行平衡。使用Centriprep管再次收集、汇集并浓缩含有泛素的洗脱液部分，以准备核磁共振实验。
核磁共振实验。
所有NMR光谱都是在25°C下使用Bruker 800MHz光谱仪获得的，该光谱仪配备有1H（H）/13C类/15N低温探头和z轴梯度。使用Bruker TopSpin 2.1软件和软件包Sparky采集和处理数据(19). 使用公布的化学位移值（BioMagResBank登录号6457）指导主干分配的确认。样品的初始体积为400μL，在核磁共振缓冲液中含有0.1 mM同位素标记的泛素（10 mM醋酸钠，pH 5.0，0.02%叠氮化钠，1μM 3-（三甲基硅基）丙酸-d4钠盐和5%D2O） ●●●●。对于离子交换配体（1-丙磺酸）的滴定实验，A类)将浓缩溶液形式的配体在NMR缓冲液中稀释至1.0 M的浓度，并在滴定蛋白质溶液之前用NaOH将pH调节至5.0。对于MM配体（N-苯甲酰-DL-蛋氨酸）的滴定实验，B类)，将冻干配体添加到0.1 mM同位素标记的泛素溶液中，以在滴定之前获得3.2 mM的浓度（注：由于该配体的溶解度有限，这是能够获得的最大浓度）。由于GE Healthcare提供的商用MM阳离子交换材料（Capto MMC）由固定化对映体组成，因此我们在研究中也使用了类似的外消旋混合物。
在12个系列中分析了配体诱导的酰胺化学位移变化1小时-15在固定的泛素浓度（0.1 mM）和不同的蛋白-甘氨酸比（1∶1.6-1∶32）下获得N个HSQC谱。由于在滴定研究期间观察到的酰胺共振在很大程度上没有交换展宽，并且在结合和非结合化学位移的总体加权平均值上，配体诱导的化学位移变化处于快速交换状态，可以建模如下：
其中δ和n个分别表示结合物的化学位移（ppm）和摩尔分数(b)和未绑定(u个)状态。因此，表观离解常数(K（K）D类)通过拟合计算1H和15N化学位移变化（Δδ），作为配体浓度的函数，使用单位点结合模型(20,21)定义于等式2:
哪里K（K）D类是离解常数[L（左）]T型和[P（P）]T型是配体和蛋白质的总浓度，Δδ是化学位移变化。通过拟合曲线K（K）D类获得了核磁共振实验中确定的每个酰胺基团的值。由于结合事件是在涉及的各种残基之间进行协调的，因此相互作用位点内的所有残基都应该具有相似的K（K）D类值。通过将K（K）D类与配体相互作用的残基与平均化学位移变化的蛋白质表面图的值可以通过以下方法识别和聚集K（K）D类将值转换为交互站点，如中所述结果和讨论用Origin 8（OriginLab）进行曲线拟合和计算，用PyMol（Schrödinger）进行蛋白质可视化。
粗训练对接仿真。
使用Autodock软件包执行粗粒度对接模拟，详细信息见SI文本.
