糖尿病。作者手稿;PMC 2011年11月1日提供。
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美国国立卫生研究院:美国国家卫生研究院223214
尽管大鼠的β细胞质量显著增加,但糖脂毒性随年龄增长而损害β细胞功能
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加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学蒙特利尔糖尿病研究中心
CRCHUM–Technopole Angus,2901 Rachel Est,Montréal,QC,加拿大H1W 4A4
加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学医学系
B.扎鲁基
加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学蒙特利尔糖尿病研究中心
CRCHUM–Technopole Angus,2901 Rachel Est,Montréal,QC,加拿大H1W 4A4
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D.K.哈格曼
加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学蒙特利尔糖尿病研究中心
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加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学医学系
M.G.拉图尔
加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学蒙特利尔糖尿病研究中心
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M.塞马奇
加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学蒙特利尔糖尿病研究中心
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加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学生物化学系
V.罗斯肯斯
美国佛蒙特州伯灵顿佛蒙特大学医学院内分泌、糖尿病和代谢科
P.C.摩尔
美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学科夫勒糖尿病中心
M.普伦斯基
加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学蒙特利尔糖尿病研究中心
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加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学营养系
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C.J.罗德斯
美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学科夫勒糖尿病中心
T·L·杰顿
美国弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学医学院内分泌、糖尿病和代谢科
V.普瓦图
加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学蒙特利尔糖尿病研究中心
CRCHUM–Technopole Angus,2901 Rachel Est,Montréal,QC,加拿大H1W 4A4,ac.laertnomu@tuotiop.tnecniv公司
加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学医学系
加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学营养系
加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学生物化学系
G.字体,加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学蒙特利尔糖尿病研究中心;CRCHUM–Technopole Angus,2901 Rachel Est,Montréal,QC,加拿大H1W 4A4;加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学医学系;
通讯作者。 当前地址:D.K.Hagman,美国华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心公共卫生科学部癌症预防计划
G.Fontés和B.Zarrouki为这项工作做出了同样的贡献。
- 补充资料
1
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摘要
目标/假设
胰腺β细胞长期暴露于过量的葡萄糖和脂肪酸中,被称为糖脂毒性,被认为是导致2型糖尿病患者糖稳态受损的原因。然而,在体内糖脂中毒条件下,β细胞功能缺陷与β细胞质量减少的相对贡献仍存在争议。因此,我们试图确定大鼠的糖脂毒性是否是由于β细胞功能受损和/或β细胞质量减少所致,以及老年动物是否更容易受到糖脂毒性条件的影响。
方法
Wistar大鼠(2个月龄和6个月龄)接受72小时的葡萄糖+静脉脂肪乳或生理盐水输注。用高血糖钳夹评估体内胰岛素分泌和敏感性。测定离体胰岛的体外胰岛素分泌、胰岛素生物合成和基因表达。免疫组化检测β细胞质量和增殖。
结果
在2个月大的Wistar大鼠中72小时输注葡萄糖+静脉脂肪乳剂不会影响胰岛素敏感性、胰岛素分泌或β细胞质量。相比之下,在6个月大鼠中,尽管β细胞质量和增殖增加,但会导致体内胰岛素抵抗和胰岛素分泌减少。这与:(1)葡萄糖刺激的第二相胰岛素分泌和胰岛素原生物合成减少有关;(2) 胰岛素含量降低;和(3)β细胞基因在分离的胰岛中的表达减少。
结论/解释
在这种体内模型中,尽管β细胞质量显著增加,但糖脂毒性的特征是葡萄糖调节的β细胞功能的年龄依赖性损害。
关键词:衰老、生物合成、基因表达、葡萄糖钳夹、高血糖、高脂血症、胰岛素、朗格汉斯岛
介绍
当胰岛β细胞不能补偿外周胰岛素抵抗时,2型糖尿病在遗传易感个体中发生[1]. 慢性高血糖[2]、高脂血症[三]以及两者的结合[4]被认为是导致β细胞衰竭的原因。具体地说,糖脂毒性假说认为,长期升高的葡萄糖和脂肪酸水平协同导致2型糖尿病的β细胞功能障碍[4,5].
葡萄糖脂类毒性损害体内β细胞功能的机制尚不清楚。虽然在Zucker糖尿病脂肪大鼠身上进行的实验有助于确定糖脂毒性的一些细胞机制[三]在这个模型中,由于瘦素信号被破坏而导致的细胞内脂肪酸代谢的深刻变化限制了这些发现与人类状况的相关性。在非遗传啮齿动物模型中,循环脂肪酸水平的长期升高通常会导致体内胰岛素分泌减少[6-8]和体外试验[8,9],尽管报告了相互矛盾的结果[10,11]. 在2个月大的Wistar大鼠72小时内交替和周期性地注射葡萄糖和静脉脂肪乳(IF),我们之前观察到胰岛素基因表达和胰岛素含量降低,而高血糖钳夹和孤立胰岛中的胰岛素分泌保持不变[12]. 我们假设,脂肪酸对体内胰岛素分泌的不一致影响是由于:(1)通过注入不含葡萄糖的脂类,不完全复制糖脂中毒条件;(2)使用能够对脂质输注诱导的胰岛素抵抗状态产生足够补偿反应的幼年动物。众所周知,年龄是人类β细胞衰竭的独立危险因素[13].
据我们所知,在体内正常大鼠中,葡萄糖和脂肪酸水平同时升高是否会损害胰岛素分泌和/或导致β细胞质量下降的问题尚未得到研究。然而,这是我们理解糖脂毒性发病机制的关键问题。因此,我们试图解决以下问题。首先,正常大鼠体内是否发生糖脂毒性?第二,糖脂毒性是由于β细胞功能缺陷、β细胞质量损失还是两者兼而有之?第三,年龄是糖脂毒性发展的易感因素吗?
方法
动物、输液和高血糖夹
所有程序均符合美国国立卫生研究院实验动物护理原则,并经蒙特利尔大学医院动物保护机构委员会批准。雄性Wistar大鼠体重分别为250至300 g(约2个月大)和500至600 g(约6个月大;加拿大QC圣康斯坦特Charles River),在控制温度下饲养,昼夜循环12小时,不受限制地饮用水和标准实验室食物。如前所述,对动物进行颈静脉和颈动脉插管[12]并且能够恢复5天(电子辅助材料[ESM]图1). 将动物随机分为两组,分别接受0.9%生理盐水(体积/体积;Baxter,Mississauga,ON,加拿大)或70%葡萄糖(重量/重量;McKesson,Montreal,QC,Canada)加20%IF(体积/容积)(Intralipid;Fresenius Kabi,Uppsala,Sweden)和20U/ml肝素(Sandoz,Boucherville,QC,加拿大;葡萄糖+IF)。使用输液泵(泵33;加拿大哈佛仪器公司,加拿大QC圣罗兰)进行输液,同时独立操作两个注射器。初始葡萄糖输注率分别为3.3和2.8 ml kg−1小时−1分别检测2个月龄和6个月龄大鼠的血糖水平,并在整个72h输注期间将血糖水平维持在13.8至16.7mmol/l的目标范围内。IF+肝素的输注速度为1.7 ml kg−1小时−1在整个输液过程中保持不变。生理盐水组的输注速率与葡萄糖+IF组的输注速率相匹配。如前所述,在72小时输注之前和结束时,对第一组大鼠进行一步高血糖钳夹,然后进行精氨酸团注,以测量体内胰岛素分泌[12]. 简单地说,通过颈静脉注入50%葡萄糖(McKesson)溶液,将血糖控制在13至14 mmol/l,持续70分钟,并使用葡萄糖分析仪根据瞬时评估进行调整(YSI Incorporated,Yellow Springs,OH,USA)。60分钟注射一团精氨酸(174 mg/kg)(Sandoz)。在−30、0、5、15、30、45、60、61和70分钟时,从颈动脉采集血浆样本,进行胰岛素和C肽测量。在灌注后钳夹结束时,杀死动物,取下胰腺进行形态学分析。这个M/I公司通过除以葡萄糖钳下半部的平均葡萄糖输注率计算胰岛素敏感性指数(M(M)以μmol kg表示−1最小值−1)通过平均循环胰岛素值(我以pmol/l表示)[7]. 通过将胰岛素敏感性校正后的胰岛素分泌处置指数(DI)乘以M/I公司夹钳后半段平均循环C肽指数(单位:nmol/l)[7]. 通过C肽/胰岛素比率评估胰岛素清除率[7].
胰岛分离、胰岛素分泌和胰岛素原合成的测定
在第二系列实验中,在输注结束时通过胶原酶消化和右旋糖酐密度梯度离心分离胰岛[14]. 对于围手术期实验,将每批100个胰岛放置在Swinnex腔室(Millipore,Nepean,ON,Canada)中,并用含有2.8 mmol/l葡萄糖的KRB缓冲液围手术期60分钟。在时间0时,葡萄糖浓度增加至16.7 mmol/l,共持续70分钟。在60分钟时,通过向KRB中添加10 mmol/l精氨酸,持续10分钟,测量精氨酸对葡萄糖诱导的胰岛素分泌的影响。在70分钟时,KRB的葡萄糖浓度降低至2.8 mmol/l。在整个围手术期每隔1分钟采集一次样本,以测定胰岛素。在围手术期结束时,用酸化乙醇提取细胞内胰岛素,以测量胰岛素含量。为了测量胰岛素原的生物合成,将分离的胰岛在11 mmol/l葡萄糖下回收1 h,然后清洗每批100个胰岛,转移到含有2.8 mmol/l-葡萄糖的KRB中,并在37°C下培养90 min。离心后,胰岛在37°C的KRB中用2.8或16.7 mmol/l葡萄糖再次悬浮30分钟。然后用含有2.8或16.7 mmol/l葡萄糖和3.7×10的KRB替换培养基6Bq公司[三H] 亮氨酸(GE-Amersham Biosciences,Baie d'Urfé,QC,加拿大),然后在37°C下培养胰岛30分钟。然后用冷KRB清洗胰岛三次,并在100 mmol/l HCl中进行超声处理。以17100×克将等分样品用三氯乙酸沉淀15分钟,以测量总蛋白合成。剩余的上清液部分用于通过用抗牛胰岛素抗血清(Millipore/Linco,Billerica,MA,USA)和碱性尿素凝胶电泳进行免疫沉淀来测量胰岛素原的生物合成[15].
分析测量
使用试剂盒(NEFA C试剂盒;日本大阪Wako Chemical)评估血糖和NEFA水平。胰岛素和C肽通过放射免疫分析法(Linco Research,St Charles,MO,USA)进行评估,三酰甘油通过试剂盒(GPO Trinder试剂盒;Sigma Aldrich,Saint Louis,MO(USA))进行评估。
逆转录聚合酶链反应
从各150个胰岛的等分样品中提取总RNA,并按照所述进行RT-PCR[12]使用ESM中列出的引物结果表示为靶mRNA与亲环素mRNA的比值。
表1
2月龄和6月龄Wistar大鼠在72小时输注生理盐水或葡萄糖和IF前后高血糖钳夹期间的功能变量
变量 | 预融合 | 注射后
|
---|
| 2个月
| 6个月
|
---|
2个月 | 6个月 | 盐分 | 葡萄糖+IF | 盐分 | 葡萄糖+IF |
---|
GIR(μmol kg)−1最小值−1) | 346.4±10.5 | 277.3±12.0** | 377.5±13.9 | 329.0±11.8* | 274.5±28.9 | 241.4±22.3 |
血浆胰岛素(pmol/l) | 1,464.7±141.3 | 1,392.1±146.7 | 1,625.9±188.1 | 1,658.5±369.9 | 1,429.2±247.5 | 2,650.4±372.5* |
M/I公司指数(μmol kg−1最小值−1×百万摩尔/升) | 0.27±0.03 | 0.25±0.03 | 0.24±0.02 | 0.26±0.04 | 0.23±0.03 | 0.11±0.02* |
血浆C肽(pmol/l) | 4,178.4±278.2 | 4,654.4±420.4 | 3,143.4±153.4 | 3,322.3±277.5 | 4,462.7±531.9 | 5,603.6±554.5 |
DI(C肽×米/我索引) | 1.10±0.10 | 1.02±0.09 | 0.76±0.11 | 0.80±0.10 | 0.98±0.17 | 0.56±0.09* |
C-肽:胰岛素(摩尔比) | 3.19±0.23 | 3.63±0.25 | 2.03±0.29 | 2.42±0.30 | 4.03±0.98 | 2.28±0.24* |
β细胞质量、增殖和凋亡
切下脂肪的皱褶,称重,固定在4%的缓冲多聚甲醛(wt/wt)中,并嵌入石蜡中。如前所述,在胰岛素免疫染色和苏木精复染后,将切片(5μm)安装在玻片上进行免疫组织化学和β细胞质量分析[16]. 如前所述,通过免疫组织化学染色核标记物Ki67和胰岛素来测量β细胞增殖[16]计算每只动物1000到1500个胰岛β细胞。使用改良的TUNEL染色法测定凋亡的β细胞[16].
数据和统计的表达
数据表示为平均值±SEM。使用Student’st吨测试或方差分析,然后使用Tukey–Kramer诚实显著差异测试或Bonferroni事后调整(视情况而定)进行二对二比较。值为对<0.05被认为是显著的。
结果
在6个月大的Wistar大鼠体内输注葡萄糖+IF诱导胰岛素抵抗并损害胰岛素分泌
在开始72小时输注之前,对2个月和6个月大的雄性Wistar大鼠进行一步高血糖钳夹,然后在钳夹的最后10分钟内注射精氨酸(). 两个M/I公司2月龄和6月龄大鼠的指数和DI相似()表明两组在输注前的胰岛素敏感性和分泌相似。
在2个月和6个月大的Wistar大鼠输血72小时前,高血糖钳夹下的体内胰岛素分泌。血糖水平(一)以及葡萄糖钳制期间的血浆胰岛素水平(b条)注射精氨酸丸后(c)在2个月大(实线,黑色三角形)和6个月大(虚线,黑色正方形)的大鼠中。数据为每组14至16只大鼠的平均值±SEM
然后,两个年龄组的大鼠接受葡萄糖+干扰素或盐水输注72小时。与盐水输注对照组相比,葡萄糖+干扰素输注导致血糖和NEFA水平持续升高;这两个年龄组的海拔高度相当(). 通过将输液提供的能量(葡萄糖+IF融合组)与食物摄入提供的能量相加计算得出的能量摄入在两组之间没有差异(数据未显示)。6个月大鼠的循环三酰甘油水平高于2个月大的大鼠,而6个月龄组的葡萄糖+IF输注导致三酰甘油降低(可能是由于肝素的联合输注),尽管这没有达到显著性().
表2
给2个月和6个月大的Wistar大鼠输注生理盐水或葡萄糖+IF 72小时后的代谢变量和胰腺重量
变量 | 2个月大
| 6个月大
|
---|
盐分 | 葡萄糖+IF | 盐分 | 葡萄糖+IF |
---|
葡萄糖(毫摩尔/升) | 6.6±0.6 | 13.9±1.5** | 6.1±0.3 | 16.2±1.9** |
胰岛素(pmol/l) | 341±116.8 | 2900±738.2* | 181.2±60.2 | 2195±584.6** |
NEFA(毫摩尔/升) | 0.3±0.1 | 0.9±0.2* | 0.26±0.07 | 0.8±0.1** |
三酰甘油(mmol/l) | 0.5±0.1 | 0.4±0.1 | 1.0±0.1*** | 0.6±0.1 |
胰腺重量(g) | 1.44±0.1 | 1.07±0.0* | 2.2±0.1 | 1.73±0.1** |
在2个月大的组中,葡萄糖+IF输注显著增加了循环胰岛素水平(). 输注后30分钟内和高血糖钳夹开始前,血浆胰岛素下降,但仍高于盐水组(). 随后高血糖钳夹期间的血糖和胰岛素水平以及对葡萄糖钳夹末端精氨酸丸的反应如所示葡萄糖+IF组和生理盐水组的胰岛素分泌曲线在葡萄糖钳夹期间相似()和对精氨酸的反应(). 血浆C肽水平,M/I公司在葡萄糖+IF-和盐水混合组中,指数、DI和C肽/胰岛素比率相似(). 这些数据表明,葡萄糖+IF输注对2月龄大鼠的胰岛素敏感性、胰岛素分泌或胰岛素清除率没有显著影响。
在2-(a–c)和6个月大(d–f日)Wistar大鼠。图表显示了血糖水平(a、 d日)以及葡萄糖钳制期间的血浆胰岛素水平(b、 e(电子))注射精氨酸丸后(c、 (f)). 数据为4只2个月龄盐水融合大鼠和9只葡萄糖+干扰素融合大鼠的平均值±SEM,以及8只盐水融合和8只葡萄糖+IF融合6个月龄大鼠的数据±SEM
在6个月大的组中,在葡萄糖+IF输注结束时循环胰岛素水平升高()并且,与2个月大的大鼠相比,在输注后30分钟内和钳夹开始之前,该值没有下降()尽管血糖水平恢复到基础值(). 与生理盐水组相比,胰岛素水平在钳夹的整个稳态期间保持升高(). 在钳夹初始阶段,胰岛素对葡萄糖的反应明显低于生理盐水组(). 相反,精氨酸对葡萄糖诱导的胰岛素分泌的增强作用在葡萄糖+IF-和盐诱导的动物中具有相似的程度(). 尽管钳夹期间循环胰岛素水平较高,但两个输注组的葡萄糖输注率没有差异,因此M(M)/葡萄糖+干扰素融合动物的I指数显著降低,表明存在胰岛素抵抗(). 在钳夹期间,葡萄糖+IF组的血浆C肽水平没有升高;因此DI显著降低()提示胰岛素分泌受损。此外,葡萄糖+IF组的C肽/胰岛素比率显著低于生理盐水组(),表明胰岛素清除率降低。综上所述,这些数据表明,葡萄糖+IF输注诱导6个月大鼠的胰岛素抵抗和胰岛素清除受损,这些变化与高胰岛素血症相关,但与葡萄糖刺激胰岛素释放缺陷相关。
6个月大鼠输注葡萄糖+IF后,葡萄糖、葡萄糖刺激的胰岛素原生物合成和β细胞基因表达导致第二相胰岛素分泌受损
为了进一步描述6个月大鼠体内注射葡萄糖+IF 72小时后观察到的胰岛素分泌缺陷()在输注结束时分离胰岛,体外灌流评估胰岛素分泌动态。在盐水灌注大鼠的胰岛中,我们观察到胰岛素对葡萄糖的快速第一阶段分泌,持续约10分钟,然后是持续的第二阶段,正如之前在大鼠胰岛中观察到的那样(; [17]). 精氨酸导致胰岛素释放进一步增加(). 葡萄糖+IF输注大鼠的胰岛对葡萄糖攻击的反应是第一阶段释放的幅度与生理盐水输注动物的相似,但第二阶段胰岛素分泌的幅度明显减弱(). 与高血糖钳夹结果一致()葡萄糖+IF-胰岛对精氨酸的增量分泌反应与盐水灌注动物胰岛无显著差异().
给6个月大的Wistar大鼠输注葡萄糖+IF或生理盐水72小时后,围融合胰岛的体外胰岛素分泌。一在2.8(−10至0分钟)和16.7 mmol/l葡萄糖(0至60分钟)的存在下,从葡萄糖+IF-(虚线,黑色三角形)和盐水融合(连续线,黑色方形)动物分离的胰岛分泌胰岛素。b条胰岛素分泌对10 mmol/l精氨酸和16.7 mmol/l葡萄糖的反应(60至70分钟)。c在胰岛素分泌的第一阶段(0至10分钟)和第二阶段(10至60分钟),对葡萄糖作出反应,对精氨酸(Arg)在16.7 mmol/l葡萄糖存在的情况下作出反应,盐注入(白条)和葡萄糖+干扰素(黑条)动物胰岛中胰岛素分泌的AUC。数据为7的平均值±SEM(a、 c(c))和四个(b条)每组动物**对<0.01 vs各盐水组
葡萄糖+干扰素融合动物胰岛的细胞内胰岛素含量显著降低(). 为了检查这是否是由于葡萄糖调节的胰岛素原生物合成受损所致,从6个月大鼠分离的胰岛接受代谢脉冲放射标记,使用[三H] 亮氨酸在2.8或16.7 mmol/l葡萄糖存在下作为示踪剂。在含盐动物的胰岛中[三H] 观察到亮氨酸掺入免疫沉淀胰岛素原是对葡萄糖的反应(). 这种增加在葡萄糖+IF输注动物的胰岛中不再显著。相反,在两组中,葡萄糖显著增加了示踪剂与总蛋白的结合,尽管葡萄糖+干扰素融合大鼠的胰岛中增加的幅度更大(). 为了校正葡萄糖对整体蛋白质合成的影响,胰岛素原的生物合成通过总蛋白质生物合成进行了正常化。正常的胰岛素原生物合成在盐诱导大鼠胰岛中对葡萄糖的反应中显著增加,但在葡萄糖+干扰素诱导组中没有增加().
注射葡萄糖(GLU)+IF或生理盐水(SAL)72小时后,6个月龄Wistar大鼠胰岛中的胰岛素含量和胰岛素原生物合成。一围产期结束时测定的胰岛胰岛素含量(n个=9).b–d段岛屿是在[三H] 亮氨酸和2.8或16.7 mmol/l葡萄糖作用30分钟。数据表示为2.8 mmol/l-葡萄糖条件(2.8G,n个=4).b条将示踪剂并入免疫沉淀胰岛素原(c)总蛋白质和(d日)通过并入总蛋白使免疫沉淀胰岛素原正常化*对<0.05, **对< 0.01, ***对<0.001 vs生理盐水组。蛋白质生物合成
通过对2个月大鼠交替注射葡萄糖和IF的方案,我们先前观察到胰岛素mRNA表达在胰岛素分泌发生任何变化之前下降[12]. 为了检测本模型中胰岛素基因的表达,我们测量了葡萄糖+IF-和盐水灌注的6个月大鼠胰岛中胰岛素的成熟信使核糖核酸和前信使核糖核酸(). 与我们之前的观察结果一致[12]葡萄糖+干扰素融合6个月大鼠胰岛中成熟和前mRNA的胰岛素显著减少。此外,胰腺-氟同源盒-1的表达(Pdx1页),其靶基因谷氨酸2(也称为Slc2a2公司)和葡萄糖激酶[18],其上游调节因子早期生长反应-1显著降低,特异性β细胞基因如转录因子的表达也显著降低马法和脂肪酸受体Gpr40型(也称为Ffar1公司). 胰岛素和胰岛素样生长因子-1受体的表达也降低。最后,(1)PAS激酶的表达,我们最近发现它与孤立胰岛的糖脂毒性信号机制有关[19]、和(2)C/ebpβ(也称为增强子结合蛋白),一种与葡萄糖毒性有关的转录因子[20]在葡萄糖+干扰素融合大鼠的胰岛中显著降低。细胞周期调节因子cyclin D1、D2或D3的表达没有显著变化;(2) 细胞周期素依赖性激酶抑制剂第16页(也称为Cdkn2a公司); 或(3)胰腺内分泌祖细胞标记物赫斯1和Sox9指数().
给6个月大的Wistar大鼠输注葡萄糖+IF或生理盐水(SAL)72小时后,胰岛中的基因表达。β细胞特异性基因的mRNA水平(一)和细胞周期相关基因(b条)通过RT-PCR测定,并将其归一化为亲环素mRNA水平。结果表示为葡萄糖+IF组(黑条)中的基因/亲环素mRNA比率比相应的盐水对照值(虚线)增加了一倍,并且是6到13只动物的平均值±SEM*对<0.05, **对<0.01, ***对<0.001 vs生理盐水组
输注葡萄糖+IF增加6个月大鼠胰腺β细胞质量和β细胞增殖
为了研究在葡萄糖+干扰素融合的6个月大鼠中观察到的胰岛素分泌缺陷是否与胰岛质量的变化有关,我们通过对输注结束时切除的胰腺切片进行形态计量分析来测量β细胞质量(). 在2个月大的大鼠中,葡萄糖+IF输注不会影响β细胞质量()或胰岛大小分布(). 相反,在6个月大的大鼠中,与生理盐水组相比,葡萄糖+IF输注使β细胞质量增加了近两倍(). 这与所有大小级别的β细胞簇数量的总体增加有关(). 在葡萄糖+干扰素融合的6月龄大鼠的胰岛中很容易检测到增殖标记Ki67阳性的β细胞()但在含盐胰岛中很少见(). 输注方案对2月龄大鼠Ki67阳性细胞百分比没有明显影响(). 在两个年龄组中,葡萄糖+IF输注后胰腺重量减少了约25%(). TUNEL阳性β细胞在两组胰岛中均极为罕见(数据未显示)。
在2个月和6个月大的Wistar大鼠中注射葡萄糖+IF(黑条)或盐水(白条)72小时后,β细胞的质量和增殖。β细胞质量(一)胰岛的大小簇分布(b、 c(c))2个月大(a、 b条)和6个月大(a、 c(c))大鼠。d日盐水或盐水后6个月大鼠胰腺切片Ki67染色的代表性图像(e(电子))葡萄糖+IF输注。(f)各组约1000个细胞中Ki67阳性细胞的百分比如图所示。数据表示为每组四只动物的平均值±SEM*对<0.05, **对<0.01, ***对<0.001与相应盐水组
讨论
本研究旨在确定大鼠体内的糖脂毒性是否是由于β细胞功能的真正缺陷、β细胞质量的丢失或两者兼而有之,以及是否在老年动物中更为明显。我们报告称,持续和联合输注葡萄糖和IF 72小时会导致胰岛素抵抗和β细胞功能受损,尽管6月龄Wistar大鼠的β细胞质量显著增加,但2月龄Wistar大鼠没有。在这些糖脂中毒条件下观察到的功能缺陷包括对葡萄糖诱导的胰岛素分泌、胰岛素原生物合成和胰岛素基因表达的协同抑制。
我们以前曾报道过,在2个月大的Wistar大鼠中,72小时周期性和交替输注葡萄糖和IF不会影响胰岛素分泌[12]. 我们目前的研究结果表明,同时、持续地注入相同总量的葡萄糖和IF也不能损害幼年动物的胰岛素分泌。总的来说,这些研究结果表明,无论给药方式如何,幼年Wistar大鼠都对糖脂毒性有抵抗力。这些发现与之前使用葡萄糖的报告形成对比[11,21-25]或IF[6,7,9-11],显示增强[10,11,24,25]或减少[6,7,9,21,23]胰岛素分泌。我们假设,在本研究中,IF对幼年大鼠胰岛素分泌的抑制作用不足,即使在伴随葡萄糖升高的情况下,也是由于应变、性别、年龄或输注率的差异,正如一些研究所表明的那样[6,7,11].
衰老是人类β细胞衰竭的独立危险因素[13],但与年龄相关的变化限制β细胞产生补偿反应的能力的机制仍有待确定。与葡萄糖+干扰素输注对幼年大鼠缺乏影响相反,输注葡萄糖+干酪根的6个月大Wistar大鼠在体内高血糖钳夹和体外融合胰岛中表现出葡萄糖诱导的胰岛素分泌减少。幼年大鼠对糖脂中毒条件缺乏敏感性,这表明应在老年动物中进行啮齿动物β细胞衰竭的研究,这与人类2型糖尿病的典型情况更为相似。大多数研究表明,长期接触脂肪酸对人体胰岛素分泌的影响表明,在年轻、健康的个体中,脂肪酸的摄入会引起胰岛素分泌的充分代偿性增加[26-28]而肥胖者的这种反应受损[29]或有2型糖尿病家族史[28].
本研究的结果与之前关于人类的报告有着有趣的相似之处。首先,正如这里所观察到的,由于长期输注脂质导致的人体胰岛素分泌受损是葡萄糖反应的特异性,因为精氨酸反应相对正常[30]. 第二,如果脂肪和葡萄糖同时输注,在非糖尿病参与者中观察到24小时输注葡萄糖后DI的增加并没有发生[31]. 第三,Carpentier等人最近的一项研究[32]表明空腹血糖与人类对脂质诱导的β细胞功能障碍的易感性之间存在着强烈的相关性。因此,本研究中使用的大鼠输注方案似乎是研究糖脂毒性机制的一个有价值的模型,因为它再现了这种现象在人类中的重要特征,即对年轻、健康的个体缺乏有害影响,但是,由于年龄、遗传倾向或先前存在的β细胞缺陷,易受糖脂毒性影响的个体的葡萄糖和脂肪酸水平同时升高,DI降低。值得注意的是,这里使用的术语是广义的糖脂毒性,即描述同时升高的葡萄糖和脂肪酸对β细胞功能或质量的有害影响。事实上,我们模型中的功能缺陷与显著的细胞死亡无关,与之前的体外研究相比[33-38]. 这些差异可能部分是由于使用的IF(Intralipid)主要含有不饱和脂肪酸,这些不饱和脂肪酸类已被证明对饱和脂肪酸诱导的细胞凋亡具有保护作用[33,36].
据我们所知,我们的结果首次证明,体内的糖脂毒性影响葡萄糖调节的β细胞功能的三个主要方面,即胰岛素基因表达、胰岛素原生物合成和胰岛素分泌。在葡萄糖+干扰素融合的6个月大鼠中观察到的胰岛素基因表达下降与我们之前使用交替输注的观察结果一致[12]并证实了我们之前的体外研究结果[39-42]糖脂毒性影响胰岛素基因。此外,我们的研究结果表明,在6个月大的大鼠中输注葡萄糖+IF会削弱葡萄糖刺激胰岛素原生物合成的能力,导致胰岛素含量显著降低。这些观察结果与油酸盐对分离胰岛中胰岛素原生物合成的抑制作用一致[15]. 重要的是要承认,这些结果并不一定表明翻译有缺陷,而是对葡萄糖信号的反应发生了改变。因为精氨酸和葡萄糖联合刺激的胰岛素分泌被认为是人类β细胞总分泌储备的一种测量方法[43]在葡萄糖+干扰素融合的6个月大鼠中,葡萄糖钳末端对精氨酸团的反应没有改变,这表明尽管胰岛素储存量显著减少,但这些动物的总分泌能力仍然保持不变。
尽管β细胞质量增加了一倍,但在葡萄糖+干扰素融合的6个月大鼠中仍出现了β细胞功能障碍。这与在未检测到凋亡的情况下,β细胞的高增殖率有关。因此,据报道老年啮齿动物的β细胞增殖能力降低[44,45]似乎在此设置中没有发挥作用。然而,引人注目的是,β细胞质量的显著增加不足以提供足够的功能补偿。文献中有几个例子表明,β细胞质量增加与β细胞功能受损之间存在明显的脱节[22,46,47],我们的观察进一步强调了功能性而非解剖性肿块是胰岛素分泌的生理相关变量的概念[47]. 很容易推测,实验消融后β细胞质量的快速扩张[46,48]或者为了应对代谢需求的增加(本研究),产生功能不成熟的β细胞。β细胞特异性基因(如胰岛素、,Pdx1,谷氨酸2、葡萄糖激酶、,Gpr40型). 有趣的是,在接受60%胰脏切除术的Zucker肥胖大鼠的胰岛中观察到类似的β细胞基因表达下降[48]. 面对Pdx1页该缺陷似乎与先前的研究相矛盾,该研究显示胰腺-氟同源盒-1在β细胞复制中的作用[49]但与最近的一份报告一致Pdx1页单倍体不足并不影响β细胞的增殖能力[50].
总之,这种糖脂毒性模型中的β细胞功能障碍的特征是胰岛素基因表达和葡萄糖调节的胰岛素原生物合成的协同减少,导致胰岛素储存量的急剧减少和葡萄糖引起的第二相胰岛素分泌的特异性丧失,尽管β细胞增殖和质量显著增加,但这只发生在老年动物身上。我们的数据支持这样一种观点,即循环葡萄糖和脂肪酸的长期过量所定义的糖脂毒性可导致体内功能性β细胞衰竭,而无可检测到的细胞毒性,这是功能失调的β细胞质量的一个例子。
致谢
这些研究得到了以下机构的支持:(1)美国国立卫生研究院(R01DK58096 to V.Poitout;R01DK068329 to T.L.Jetton;R01DK50610 to C.J.Rhodes;以及Ruth L.Kirschstein National Research Service Award to D.K.Hagman);(2) 加拿大卫生研究院(MOP 77686至V.Poitout,MOP 12653至M.Prentki);(3)加拿大糖尿病协会(G.Fontés的博士后奖学金和M.Prentki的运营补助金)。B.Zarrouki得到蒙特利尔糖尿病研究中心/默克-弗罗斯特博士后奖学金的支持。V.Poitout担任加拿大糖尿病和胰岛β细胞功能研究主席。M.Prentki担任加拿大糖尿病和代谢研究主席。我们感谢G.Fergusson和M.Ethier(CRCHUM)、K.Herzer和J.Lausier(佛蒙特大学)提供的宝贵技术援助,以及S.Bonner-Weir(Joslin糖尿病中心)和E。Joly(CRCHUM)感谢富有成果的讨论。
脚注
电子辅助材料本文的在线版本(doi:10.1007/s00125-010-1850-5)包含对授权用户可用的补充材料。
利益的双重性作者声明,与这份手稿相关的兴趣不存在二元性。
参与者信息
G.字体,加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学蒙特利尔糖尿病研究中心。CRCHUM–Technopole Angus,2901 Rachel Est,Montréal,QC,加拿大H1W 4A4。加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学医学系。
B.扎鲁基,加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学蒙特利尔糖尿病研究中心。CRCHUM–Technopole Angus,2901 Rachel Est,Montréal,QC,加拿大H1W 4A4。加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学医学系。
D.K.Hagman,蒙特利尔糖尿病研究中心,蒙特利尔大学,蒙特利尔,加拿大QC。CRCHUM–Technopole Angus,2901 Rachel Est,Montréal,QC,加拿大H1W 4A4。加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学医学系。
M.G.拉图尔,加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学蒙特利尔糖尿病研究中心。CRCHUM–Technopole Angus,2901 Rachel Est,Montréal,QC,加拿大H1W 4A4。
M.Semache,蒙特利尔糖尿病研究中心,蒙特利尔大学,蒙特利尔,加拿大QC。CRCHUM–Technopole Angus,2901 Rachel Est,Montréal,QC,加拿大H1W 4A4。加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学生物化学系。
V.罗斯肯斯,美国弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学医学院内分泌、糖尿病和代谢科。
P.C.摩尔,美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学科夫勒糖尿病中心。
M.Prentki,加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学蒙特利尔糖尿病研究中心。CRCHUM–Technopole Angus,2901 Rachel Est,Montréal,QC,加拿大H1W 4A4。加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学营养系。加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学生物化学系。
C.J.Rhodes,美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学科夫勒糖尿病中心。
T.L.Jetton,美国弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学医学院内分泌、糖尿病和代谢科。
V.波伊图特,加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学蒙特利尔糖尿病研究中心。CRCHUM–Technopole Angus,2901 Rachel Est,Montréal,QC,加拿大H1W 4A4,ac.laertnomu@tuotiop.tnecniv公司.加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学医学系。加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学营养系。加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学生物化学系。
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