神经科学杂志。2009年8月5日；29(31): 9839–9849.
全身脂多糖通过重新编程大脑对中风的反应保护大脑免受缺血性损伤：IRF3的关键作用
,1 ,1 ,1 ,三 ,1 ,1 ,2和
1 巴努·戈帕兰
三俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所基因组医学研究所44195
Philberta Y.Leung先生
1分子微生物学和免疫学系
克里斯蒂娜·哈林顿
2俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学疫苗和基因治疗研究所97239，以及
1分子微生物学和免疫学系
2俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学疫苗和基因治疗研究所，邮编97239
三俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所基因组医学研究所44195
通讯作者。 信件应寄至Mary P.Stenzel-Poore博士，俄勒冈州波特兰Sam Jackson Park路3181号俄勒冈健康与科学大学L220分子微生物学和免疫学系，邮编97239。，ude.usho@meroop 收到日期：2009年5月26日；2009年6月29日修订；2009年6月30日接受。
版权©2009年神经科学学会0270-6474/09/299839-11$15.00/0 摘要
脂多糖（LPS）预处理通过激活其受体Toll-like receptor 4（TLR4）对随后的脑缺血损伤提供神经保护。自相矛盾的是，缺血后内源性配体激活TLR会加重中风损伤。在这里，我们在LPS预处理的背景下定义了TLR在缺血后的一种新的保护作用。中风后24小时收集的大脑微阵列分析显示，LPS预处理动物中存在一组独特的上调基因。对该独特基因集的启动子分析确定了I型干扰素（IFN）相关转录调控元件的过度表达。这一发现表明存在I型干扰素或干扰素调节因子（IRF），它们上调干扰素刺激基因。实时逆转录-PCR证实IFNβ上调。脑卒中时脑室内直接注射干扰素β足以实现神经保护。TLR4通过其配体分子Toll/白细胞介素受体域包含的配体诱导干扰素β（TRIF）和IRF3转录因子，可以诱导IFNβ和干扰素刺激基因。我们发现皮层神经元缺氧缺糖在体外中风模型中，中风后TRIF的激活可减少神经元死亡。此外，缺乏IRF3的小鼠在我们的体内模型。我们的研究首次证明了TRIF/IRF3信号的神经保护能力，并表明干扰素刺激基因，无论是由干扰素β诱导还是由增强的TLR信号传导至IRF3，都是保护大脑免受缺血性损伤的有效手段。
介绍
越来越清楚的是，Toll-like receptor（TLR）信号加重了中风损伤。缺乏TLR2或TLR4的小鼠在多种脑缺血模型中不易受到损伤(曹等人，2007;Lehnardt等人，2007年;齐格勒等人，2007年). TLR由小胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞表达，并由缺血后大脑中存在的损伤相关分子HSP70（TLR4）和HMGB1（TLR2和TLR4(Kinouchi等人，1993年a,b条;Faraco等人，2007年). TLR激活可诱导炎症分子肿瘤坏死因子α（TNFα）、IL1β、诱导型一氧化氮合酶和其他细胞毒性介质的产生，从而增加组织损伤。
虽然中风后TLR4的激活加剧了损伤，但中风前TLR4激活可保护大脑免受损伤。脂多糖（LPS）是一种细菌来源的强效TLR4配体，全身给药可使动物在几种脑缺血模型中耐受损伤(Tasaki等人，1997年;Rosenzweig等人，2004年;Hickey等人，2007年). LPS诱导的缺血耐受反映了LPS诱导耐受LPS的现象。巨噬细胞最初暴露于LPS可诱导促炎性TNFα，但在随后的LPS暴露期间，由于TLR4适配器分子MyD88的信号传导受到干扰，TNFα的生成显著减少(West和Heagy，2002年;Fan and Cook，2004年;Liew等人，2005年). 相反，巨噬细胞在初次接触LPS时几乎不会产生干扰素β（IFNβ），但在二次接触时会增加IFNβ的产生(Broad等人，2007年)这表明TLR4信号通过Toll/白细胞介素受体域包含的适配器诱导IFNβ（TRIF）适配器分子上调。因此，LPS预处理可能会导致细胞转换其主导的TLR4信号通路。
通过TRIF的TLR4信号通过激活干扰素调节因子IRF3诱导干扰素β。全身注射干扰素β可减少缺血性脑损伤(刘等人，2002;Veldhuis等人，2003年)可能通过激活干扰素刺激基因（ISG）。IRF3本身可能具有类似的神经保护作用。IRF3与基因启动子内的干扰素刺激反应元件（ISRE）结合，使许多ISG的表达增加到与I型IFN诱导的表达相同的程度(Nakaya等人，2001年). 因此，IRF3的激活可能独立地导致对缺血性中风的保护。因此，增强TLR4向TRIF–IRF3–IFNβ的信号转导有望有助于神经保护。
我们认为LPS预处理或预处理会改变细胞环境，因此TLR4的后续激活会通过TRIF增加IRF3的信号传递，并上调神经保护细胞因子IFNβ。因此，通过这种方式，LPS预处理可以重新编程缺血期间TLR4的后续激活，从而导致神经保护性I型IFN信号的增加。在这里，我们为这种重新编程及其神经保护作用提供了证据。
材料和方法
老鼠。
C57BL/6小鼠（雄性，8-12周，～25 g）购自Jackson实验室。干扰素β基因敲除小鼠由Leanderson博士（瑞典隆德隆德大学）提供。IRF3基因敲除小鼠购自日本筑波的RIKEN生物资源中心。这两个菌株在C57BL/6背景下回交至少八代。所有老鼠都被安置在美国实验动物护理协会批准的设施中。手术根据俄勒冈健康与科学大学、机构动物护理和使用委员会以及美国国立卫生研究院的指导方针进行。
LPS治疗。
小鼠腹腔注射200μl生理盐水或LPS[0.2–1.0 mg/kg；大肠杆菌血清型0111页：B4页; 目录号L2630，通过苯酚萃取纯化，蛋白质含量<3%（Sigma）]。对每一批新的LPS进行滴定，以确定对受试小鼠的特定菌株具有神经保护作用的最佳剂量。
大脑中动脉闭塞。
用4%氟烷麻醉小鼠，并使用先前描述的单丝缝合方法进行大脑中动脉闭塞（MCAO）(Stevens等人，2002年). 简单地说，一条硅涂层8-0单丝尼龙外科缝线穿过颈外动脉进入颈内动脉，以阻塞大脑中动脉，并在腔内维持40、45或60分钟。闭塞的持续时间基于初步研究，该研究旨在确定在对照组小鼠中获得35%至45%的梗死面积所需的时间。众所周知，遗传背景会影响缺血结果，从而影响梗死面积。然后移除缝合线以恢复血流。在整个手术过程中，用激光多普勒血流仪监测脑血流（CBF）。在所介绍的每项研究中，闭塞期间的平均CBF在基线的10%至17%之间。排除了在闭塞期间CBF未保持在该组正常值范围内的小鼠（在联合研究中，<4%的所有动物）。使用温控加热垫将体温维持在37°C。MCAO手术的存活率>80%。
梗死评估。
为了可视化梗死区域，将6×1mm冠状中切面置于1.5%2,3,5三苯基四氮唑氯化物（TTC）和0.9%PBS中，并在37°C下染色15分钟。使用NIH图像分析，根据大脑半球的计算机扫描图像确定梗死大小。为了解释梗死区内的水肿，每个节段的梗死面积间接计算如下：100×（对侧半球面积-同侧半球活组织面积）/（对侧大脑半球面积）(Swanson等人，1990年).
基因表达研究的实验设计。
C57BL/6小鼠分为10组，每组4只：第1-3组注射生理盐水，分别于3、24和72小时处死。第4-6组接受LPS注射，分别于第3、24和72小时处死。第7组和第8组接受生理盐水注射，72小时后进行45分钟MCAO。第9组和第10组接受LPS注射，72小时后进行45分钟MCAO。第7组和第9组在闭塞开始后3 h死亡，第8组和第10组在闭塞结束后24 h死亡。在杀死小鼠时，将动物麻醉，然后灌注肝素盐水。一个组(n个=6）被列为未处理的对照。在无RNase条件下，取1 mm切片（距离吻端4 mm），根据TTC染色确定梗死面积。从额叶4毫米处分离出同侧皮层区域，并在液氮中快速冷冻。
RNA分离。
使用Qiagen RNeasy Lipid Mini试剂盒分离总RNA。如下文所述，将单个动物的RNA杂交到单个阵列。
基因芯片表达分析。
在俄勒冈州健康与科学大学基因微阵列共享资源的Affymetrix微阵列核心中进行了微阵列分析。使用NuGEN Ovation Biotin RNA扩增和标记系统_V1标记RNA样品。按照Affymetrix技术手册中的描述进行杂交，并根据Ovation标记协议的建议进行修改。根据产量和大小分布对标记的cRNA靶进行质量检查。质量测试样品与MOE430 2.0阵列杂交。阵列图像由Affymetrix GeneChip操作软件处理。对核心设施内不符合经验定义的截止值的阵列进行改造，并与新阵列杂交。使用稳健的多芯片平均方法对数据进行标准化(Irizarry等人，2003年). 然后使用双向方差分析模型对每个基因的标准化数据进行分析，将条件和时间作为组。后hoc将未经处理的小鼠作为对照组进行比较。第页使用Hochberg和Benjamini方法对数值进行多次比较调整(Hochberg和Benjamini，1990年). 如果调整了第页值<0.05，调节倍数变化大于或等于2。
转录调控网络分析。
使用基于Web的程序Promoter Analysis and Interaction Network Toolset（PAINT）3.5版(Vadigepalli等人，2003年)，我们检测了与微阵列识别的独特基因调控相关的预测调控元件。简言之，使用PAINT，我们获得了MOE430 Affymetrix基因芯片上所示转录物的5000 bp上游序列（33635个转录物被鉴定为5000 bp的上游序列）。使用TRANSFAC PRO数据库版本10.4，PAINT识别了这些上游序列中的假定转录因子结合序列[转录调控元件（TRE）]。这个基因库和已鉴定的TRE被用作我们的参考比较组。PAINT的统计成分（调整了错误发现率第页值设置为≤0.2），用于确定与参考对照组（即LPS预处理小鼠中唯一表达的基因与33635个成员参考组相比）相比，单个基因簇中过度表达的TRE。
MCAO期间脑室注射干扰素β。
如前所述，将重组小鼠（rm）IFNβ（细胞科学）或载体[人工脑脊液（aCSF）]注射到左侧脑室(Meller等人，2005年). 手术前后立即注射（1μl）rmIFNβ（200 U）或aCSF（60 min MCAO）。中风后24小时测量梗死体积。
定量实时PCR检测干扰素β。
用DNA酶处理RNA，并使用Omniscript RT试剂盒（Qiagen）转录成cDNA。使用TaqMan PCR Master Mix（Applied Biosystems）进行实时逆转录-PCR。对于IFNβ，使用小鼠IFNβ的TaqMan基因表达测定混合物（Mm00439546_S1；Applied Biosystems）。β-actin的引物和探针来自Integrated DNA Technologies：正向，5′-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′；背面，5′-CAATAGTGATGACCGCGT-3′；探头CACTGCGCATCCTCTTCCTCCC。样本在ABI-Prism 7700（应用生物系统）上运行。使用Applied Biosystems序列检测软件对结果进行分析。使用比较周期阈值（CT）方法测定IFNβ的相对定量（2-ΔΔCT)如Applied Biosystems User Bulletin#2所述。结果被归一化为β-肌动蛋白，并呈现为相对于未处理小鼠的结果。所有反应均一式三份。
氧糖剥夺在体外.
从胚胎第15天到第17天，制备小鼠初级混合皮层培养物。将皮质切开，用胰蛋白酶-EDTA（Invitrogen）解离，并以4.5×10的密度铺板5细胞/ml涂在涂有聚乙烯的盖玻片上-我-鸟氨酸（15 mg/L）。在每次实验之前，细胞在神经基础培养基（含4.5 g/L葡萄糖；补充谷氨酰胺和B27-AO；Invitrogen）中培养5天。培养物由约60%的神经元组成（范围为53–66%），通过神经元特异性核蛋白染色（Millipore生物科学研究试剂）确定，星形胶质细胞（GFAP）<5%+; Sigma）和<5%小胶质细胞（番茄凝集素+; 向量实验室）。通过去除培养基并用Dulbecco的PBS（Invitrogen）替代，然后在85%N的厌氧环境中培养，进行氧-葡萄糖剥夺（OGD）2，10%一氧化碳2和5%H2在37°C下持续3 h。使用电子氧气/氢气分析仪（Coy Laboratories）监测室内的厌氧条件。将暴露培养基替换为神经基底培养基（含4.5 g/L葡萄糖；补充谷氨酰胺和B27-AO），并将细胞放回常氧培养箱中，终止OGD。在OGD间隔期间，将控制板保存在常氧培养箱中。
细胞死亡评估在体外.
细胞死亡在体外OGD后24 h用荧光、细胞渗透、DNA结合染料检测：碘化丙啶（PI）作为细胞死亡指标，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）作为总细胞数指标。盖玻片与PI（1.5μg/ml；Sigma）孵育5分钟，用PBS清洗，并在10%福尔马林中固定30分钟。使用含DAPI（Southern Biotechnology Associates）的Fluoromount-G安装介质将盖玻片安装在载玻片上。用荧光显微镜（Leica）观察染色细胞，并使用Metmorph7软件（Molecular Devices）进行分析。在每个封面纸条上的两个随机视野中统计PI和DAPI染色细胞的数量，并计算死亡率，即平均值（PI）/（DAPI）×100每视野。在一个实验中，每次治疗都使用三份盖玻片，整个实验重复三次或更多次。
结果
全身注射LPS诱导大脑炎症反应
如前所述，MCAO前3天全身给予LPS（0.2 mg/kg）可显著减轻缺血损伤(Rosenzweig等人，2004年,2007). 为了阐明神经保护的可能机制，我们在MCAO前的时间点从LPS治疗和对照小鼠的皮层中分离出RNA。使用Affymetrix寡核苷酸微阵列，我们鉴定了263个基因（228个增加，35个减少）在LPS注射后3小时显著调节，176个基因（174个增加，2个减少）在LPS处理后24小时显著调节。然而，在LPS给药后72小时内，除五个差异调节基因仍在增加外，大多数基因组变化已降至基线水平(A类;). 与未处理的基线组相比，经盐处理的对照组在任何时间点均未表现出具有统计学意义的基因调控。
全身注射LPS可诱导大脑中的早期基因调节，与炎症反应一致。对C57BL/6小鼠给予生理盐水或LPS（0.2mg/kg，腹腔注射）。在治疗后的不同时间（3、24和72小时），小鼠(n个=每个时间点4个），并收集皮层脑组织。分离RNA并与Affymetrix基因芯片（MOE430）杂交。A类图表示LPS或盐处理小鼠与未处理对照组相比差异调节的基因数量。后续冲程的时间用黑色箭头表示。B类利用可用的公共数据库和已发表的文献将推测的生物功能分配给受调控的基因。
表1。
| 标题 | 符号 | 折叠更改 |
|---|
| 血清淀粉样蛋白A3 | Saa3协议 | 6.48 |
| 拓扑异构酶（DNA）IIα | 排名前2a | 2.14 |
| UDP葡萄糖醛酸转移酶2家族，多肽B37 | Ugt2b37型 | 3.53 |
| RIKEN cDNA 4930440C22基因 | | 2.24 |
| RIKEN cDNA 4930554P06基因 | | 2.35 |
干扰素转录调控元件与LPS预处理相关
我们使用基于网络的程序PAINT 3.5版，在LPS和盐水预处理动物中检测到与独特基因调控相关的TRE。我们比较了中风后24小时LPS预处理小鼠中唯一增加的基因簇中确定的TRE（158个基因）()由MOE430基因芯片的～33000个转录物组成的参考簇。这使得可以确定与预处理集群中的基因相关的过度表达的TRE。我们使用中风后24小时盐摄入小鼠中唯一增加的基因簇（128个基因）进行了相同的比较(). 对LPS预处理组的分析确定了14个经调整的TRE第页值<0.2，而盐摄入组仅显示5个过度表达的TRE(). LPS预处理组中14个确定的TRE中有5个是干扰素相关的[IRF（V$IRF_Q6和V$IRF _Q6_01）、IRF8、ISRE和IRF7]，两个是核因子-κB（NFκB）组分（cRel、NF-kappaBp65）。确定的TRE与LPS预处理簇中的基因之间相互作用的网络描述如所示干扰素相关TRE（红色）与显示的大量基因相关（60%；127个中的76个）。事实上，文献中已经报道了大量具有确定的干扰素TRE的基因被I型干扰素诱导(，红色星号）。NFκB调节元件也过度表达；在127个基因中的54个（42%）上发现了这些序列(，蓝色），其中30人也共享IFN TRE(). 最近有报道称，cRel在IFN刺激期间直接与启动子结合并调节几个ISG基因(Wei等人，2008年). 因此，cRel/NFκB可能在与LPS预处理相关的干扰素指纹图谱中发挥整体作用。总的来说，在LPS预处理小鼠中风后24小时诱导的基因中，79%（127个中的100个）包含IFN或NFκB的调节序列(). I型干扰素信号的优势促使我们研究增强的I型干扰素信号在LPS诱导的神经保护中的可能作用。
LPS预处理诱导一组独特的基因对MCAO作出反应。在MCAO前72小时（45分钟），用LPS（0.2 mg/kg）或生理盐水预处理C57BL/6小鼠。MCAO后3或24小时，小鼠(n个=每个时间点4个）并收集同侧皮质脑组织。分离RNA并与Affymetrix基因芯片（MOE430）杂交。维恩图显示了与未处理对照组相比，在每种情况下差异调节的基因数量。箭头表示监管方向。
表3。
在LPS预处理小鼠中风后24小时诱导的基因中，TREs被确定为显著过度表达
| 转录调控元件 | 已调整第页代表人数过多的数值
|
|---|
| LPS组 | 盐类 |
|---|
| c-Rel/V$CREL_01 | 0 | >1.00 |
| 交换偿付费/V$交换偿付费_Q6 | 0 | >1.00 |
| 交换偿付费/V$交换偿付费_Q6_01 | 0.01 | >1.00 |
| NF-kappaB（第65页）/V$NFKAPPAB65_01 | 0.01 | 0.86 |
| RREB-1/V$RREB1_01 | 0.01 | >1.00 |
| IRF-8/V$ICSBP_Q6 | 0.03 | 0.99 |
| NF-Y/V$NFY_Q6 | 0.03 | >1.00 |
| ISRE/V$ISRE_01 | 0.07 | >1.00 |
| STAT5B（同二聚体）/V$STAT5B_01 | 0.07 | >1.00 |
| IRF-7/V$IRF7_01 | 0.15 | >1.00 |
| COMP1/V$COMP1_01 | 0.17 | 0.37 |
| 弗雷亚克-3/V$弗雷亚克3_01 | 0.17 | >1.00 |
| 肌肉TATA盒/V$MTATA_B | 0.17 | >1.00美元 |
| Ik1/V$Ik1_01 | 0.199 | 0.64 |
| S8/V$S8_01 | >1.00 | 0 |
| E2/V$E2_01 | 0.69 | 0.0024 |
| C/EBPβ/V$CEBPB_02 | >1.00 | 0.13 |
| HNF-1/V$HNF1_C | >1.00 | 0.13 |
| 肌生成素/NF-1/MYOGNF1_01 | 0.94 | 0.19 |
在LPS预处理小鼠中风后，大多数基因中确定的干扰素和NFκB相关TRE增加。假设性基因-TRE网络显示，在LPS预处理小鼠中风后，确定的TRE与基因的关系增加。基因以黑色表示，干扰素相关TRE以红色表示，NFκB相关TRE为蓝色，其他TRE为灰色。第页值阈值设置为0.2。
经鉴定的干扰素或NFκB相关TRE在LPS预处理小鼠中风后诱导的基因。描述LPS预处理小鼠中风后24小时诱导的基因内IFN和NFκB调节位点发生的矩阵。基因列在右侧，TRE列在顶部。基因5′序列中TRE的识别用红色方框表示。红色星号显示了已发表文献中报道的由I型干扰素诱导的基因。
LPS预处理小鼠卒中后IFNβ水平升高
干扰素诱导基因的增加和干扰素相关TRE的过度表达表明，在LPS预处理小鼠中风后大脑皮层可能存在干扰素β。使用实时PCR，我们检测了LPS预处理和盐处理小鼠中风后大脑中IFNβ转录水平。与未处理对照组相比，预处理组和未处理组小鼠中风后IFNβ水平升高(). 然而，LPS预处理小鼠的水平在3小时时高出9倍（LPS处理组为59.4±22，盐水处理组为6.7±3；第页<0.001），24小时时高3.5倍（LPS治疗组，45.3±23，盐水治疗组，11.7±6；第页<0.001）。我们在MCAO前（注射后72小时）检测了IFNβ水平，以证实中风后IFNβ的增加与预处理LPS注射导致的任何IFNβ残留增加无关。经LPS和盐处理的小鼠中的IFNβ水平在统计学上与未处理的对照组相当（分别为1.49±1.4和0.74±0.6）（数据未显示）。因此，中风后，用LPS预处理的小鼠对缺血损伤产生更强大的IFNβ反应。
LPS预处理小鼠MCAO后IFNβ水平升高。用LPS或生理盐水预处理小鼠MCAO（3和24小时）后，对来自皮层的RNA进行实时PCR分析。数据标准化为β-肌动蛋白。结果显示为相对于未处理控件的折叠增加。n个=每组3-4只小鼠；数据为组平均值±SEM***第页通过Bonferroni的双向方差分析<0.001事后（post-hoc）测试。
干扰素β在脑对缺血的内源性反应中不起作用
非预处理小鼠中风后IFNβ比未处理小鼠增加6.7倍(). 虽然不像LPS预处理小鼠那样健壮，但这确实表明干扰素β可能在中风内源性反应中发挥保护作用。为了确定中风后的增加是否具有保护作用，干扰素β基因敲除小鼠接受40分钟MCAO，然后再灌注72小时。野生型和干扰素β基因敲除小鼠的梗死面积相似（38.5±2 vs 39.5±1%；第页= 0.7). 因此，在大脑对缺血的正常反应中，干扰素β本身似乎并不起关键作用。
干扰素β对缺血性损伤的保护作用
为了确定IFNβ的更强劲的增加（九倍）()在LPS预处理小鼠中风后会影响缺血，我们测试了MCAO后外源性IFNβ在大脑中的作用。我们在MCAO前后立即向C57BL/6小鼠脑室注射重组小鼠IFNβ，24小时后测量梗死面积。使用干扰素β治疗的动物与使用车辆治疗的小鼠相比，梗死体积显著减少（31.9±4 vs 49.4±2%；第页< 0.001). 这一结果支持了这样一种观点，即大脑中IFNβ的表达增加可以保护大脑免受缺血性损伤。
TRIF介导的信号在缺血模型中具有保护作用在体外
LPS预处理小鼠中风反应中IFNβ和I型干扰素相关基因的增加反映了经典内毒素耐受中对LPS的二次反应，并支持TLR对中风反应的可能重新编程，从而导致TRIF介导的事件。为了确定中风后通过TRIF发出的信号是否会诱导保护作用，我们使用合成TLR3配体Poly I:C（InvivoGen），该配体仅通过TRIF-依赖途径发出信号。我们推断，在缺血时激活该通路将提供急性保护，免受缺血损伤。为了验证这一点，将来自小鼠的混合皮层培养物暴露于OGD中3小时，然后用不同剂量的Poly I:C进行治疗，随后恢复到正常氧条件。20小时后，细胞死亡被确定。OGD后急性Poly I:C治疗显著降低了OGD介导的细胞死亡(). 因此，缺血后通过TRIF的信号传递提供保护，防止损伤在体外这表明脑卒中后TRIF介导的脑内信号转导可以减少缺血性损伤。
缺氧缺糖后TRIF信号传导诱导神经保护。混合皮层培养物暴露于OGD 3 h，然后用增加剂量的Poly I:C进行处理。24 h后通过PI染色评估细胞死亡。显示平均值±SEM***第页<0.001，与经药物治疗的OGD对照组相比。n个=2–4个单独重复的实验。未接触OGD的最高剂量Poly I:C处理不会导致细胞死亡（数据未显示）。
IRF3是LPS诱导的脑缺血保护所必需的
为了进一步探索TRIF–IRF3通路，我们测试了IRF3是否是LPS诱导的缺血保护的关键效应器。首先，我们确定IRF3是否参与大脑对中风的内源性反应。IRF3基因敲除小鼠接受40分钟MCAO，然后再灌注72小时。IRF3敲除小鼠显示出与野生型小鼠相似大小的梗死（41.2±5%对43.4±4%；第页= 0.8). 因此，IRF3在大脑对缺血的正常反应中并不起关键作用。接下来，我们确定IRF3是否是LPS诱导的缺血耐受所需的效应器。在MCAO 40 min前72 h用LPS（0.4 mg/kg）预处理IRF3基因敲除小鼠，24 h后处死。显示IRF3基因敲除小鼠不能预先用LPS进行预处理（减少17.3 vs 53.2%）。因此，IRF3对于LPS预处理的保护作用是必需的。
IRF3是LPS预处理的重要介质。IRF3基因敲除小鼠和野生型小鼠在MCAO 40 min前72 h用LPS（0.4 mg/kg）或生理盐水预处理。术后24小时用TTC染色法测量梗死体积。所示数据为组平均值±SEM*第页用Bonferroni's进行双向方差分析，<0.05事后（post-hoc）测试；n个=每组7-10个。
讨论
我们提出了LPS诱导缺血性损伤神经保护的分子模型，其中系统性LPS预处理对中风反应中TLR4信号进行重新编程，将其导向神经保护途径。全身注射LPS可在大脑中诱导早期炎症基因组反应，该反应已消退72小时。然而，这些LPS预处理小鼠对中风的反应发生了改变，并且在缺血暴露后3小时就诱导了新的基因调控模式。大脑中对LPS反应的基因组变化表明，脑TLR可能在中风前激活，在中风事件激活后，TLR继续以改变的信号通路作出反应。事实上，在LPS预处理的动物中风后诱导的独特基因中，IFN调节元件过度表达，这表明在这种情况下TLR信号可能发生改变。为了实现这一点，我们研究了通过TRIF依赖途径增加信号传导的可能性，这可能是与LPS预处理相关的神经保护机制。
IFNβ的诱导是依赖TRIF的TLR4级联反应的标志(Biswas等人，2007年). 根据这一点，我们发现LPS预处理在中风后3和24小时增加了脑内的IFNβ。然后我们测试了是否需要增加IFNβ来实现神经保护。缺乏干扰素β的小鼠出现的梗死面积与野生型小鼠相似，这表明内源性干扰素α不能保护大脑免受缺血性损伤。然而，卒中时脑室内外源性注射IFNβ可显著保护缺血损伤，表明局部上调该细胞因子可能具有神经保护作用。我们的在体外利用模拟缺血进行的研究表明，OGD后用TLR3配体Poly I:C激活TRIF–IRF3通路可以减少神经元死亡，从而支持TRIF依赖性信号传导可以保护缺血损伤的观点。
TRIF–IRF3级联在脑卒中自然反应中的作用似乎相对较小，因为缺乏IRF3的小鼠表现出与野生型小鼠相似大小的梗死。然而，IRF3在LPS预处理中起着关键作用，因为IRF3缺乏的小鼠在LPS的预处理中不能保护其免受缺血损伤。由于这些小鼠在诱导耐受期间和缺血事件后IRF3缺乏，我们不能排除诱导期和缓解期对IRF3的需求。在初步研究中，我们发现Poly I:C预处理对中风具有保护作用（我们未发表的观察结果），这表明TRIF信号可能足以诱导耐受。在内毒素-内毒素（LPS）耐受性模型中，先前接触低剂量内毒素可防止随后接触高剂量内毒素，这一概念得到了大量支持，即需要TRIF–IRF3信号。Biswas等人（2007年）表明在MyD88缺陷小鼠中诱导内毒素耐受，但在TRIF或IRF3缺陷小鼠中未诱导内毒素耐受(Biswas等人，2007年). 因此，尽管TRIF依赖性信号可能参与诱导耐受，但LPS预处理小鼠中风后IRF3依赖性基因的增强以及OGD后Poly I:C阐明的保护性反应也支持TRIF–IRF3途径在保护性表型中的作用。
我们假设LPS预处理抗缺血损伤导致类似内毒素耐受的TLR4信号转导。已知耐受内毒素（LPS）的细胞通过上调途径抑制剂，即IRAK-M、Tollip、Ship1和Trim30α，抑制促炎性MyD88–TNFα途径(Lang和Mansell，2007年;Shi等人，2008年)在二次接触TLR4配体期间，导致炎症细胞因子反应降低。这些途径的抑制将随后的TLR4信号转导至TRIF–IRF3–IFNβ途径并导致IFNβ的生成增加(Bagchi等人，2007年). 同样，LPS预处理可能上调大脑中的炎症通路抑制剂，这些炎症通路抑制剂将随后的TLR信号向下分流至TRIF–IRF3–IFNβ通路。因此，在缺血情况下，内源性TLR配体的释放可能会导致TLR信号转导至TRIF–IRF3–IFNβ途径，导致IFNβ上调。
我们的数据支持预处理动物中风后TLR4信号重定向的模型。与对照动物不同，LPS预处理小鼠在中风后表现出IFNβ和IFN相关基因的显著上调，根据启动子区域分析，这些基因可能通过TLR4–TRIF–IRF3途径产生。Hirotani等人（2005）在使用TRIF缺陷小鼠的内毒素耐受试验中表明，二次激发后I型干扰素相关基因的诱导完全依赖于TRIF(Hirotani等人，2005年). 总之，这些数据表明，I型干扰素“指纹”是在TLR4–TRIF–IRF3下游生成的，并支持TLR4重新编程的概念。
TRIF介导的神经元保护作用表明，重组TLR反应具有保护作用在体外模型，并通过直接在大脑中给予的IFNβ的保护作用。其他研究表明，全身注射干扰素β可以减少缺血性中风大鼠和兔模型的组织损伤(刘等人，2002;Veldhuis等人，2003年). 在这些研究中，IFNβ的保护作用可能是通过中风后血脑屏障（BBB）的渗漏介导的，其中IFNβ可能直接作用于脑实质。最近的一项研究Maier等人（2006）其中BBB完整性被认为得以保留，但在全身注射IFNβ后，未能显示缺血性脑损伤的减轻(Maier等人，2006年). 因此，与我们的数据一样，这些结果支持干扰素β的神经保护作用集中发生的观点。
我们证明IRF3是LPS诱导的神经保护所必需的，这很可能是通过诱导IFNβ和其他ISG实现的。在我们的微阵列分析中，发现了两种具有保护作用的潜在ISG调节剂Trim30和Ifit1。Trim30已被证明通过抑制TLR4诱导的NFκB活化来负调节LPS诱导的TNFα和IL6表达(Shi等人，2008). 在LPS预处理小鼠的大脑中，我们发现在LPS治疗后3和24小时以及中风后24小时Trim30的mRNA水平增加。这种诱导可能在中风后抑制脑内炎症细胞因子方面发挥作用。尽管Shi等人（2008）据报道，Trim30的表达依赖于NFκB，启动子序列也包含一个ISRE位点(). 此外，我们发现LPS预处理小鼠在LPS给药后和中风后24小时再次诱导Ifit1。最近发现密切相关的基因Ifit2可以抑制LPS介导的TNFα和IL6的诱导(Berchtold等人，2008年)尽管它没有直接与TLR信号的抑制有关。LPS预处理小鼠中这两个ISG基因和IFNβ的诱导支持了中风后TLR重新编程反应导致神经保护状态的假设。
我们的数据表明，全身注射LPS可以重新编程大脑中TLR4表达细胞。TLR4在大脑中广泛表达(Lehnardt等人，2002年;奥尔森和米勒，2004年;Chakravarty和Herkenham，2005年)，许多研究表明，外周LPS在大脑内诱导炎症反应(Chen等人，2005年;秦等，2008). 然而，目前尚不清楚LPS是否穿过BBB和/或是否诱导外周细胞因子进入大脑。最近的证据表明，系统性脂多糖在大脑中诱导TLR4信号传导，与外周细胞因子反应无关(Chakravarty和Herkenham，2005年;Gosselin和Rivest，2008年). 然而，其他研究人员在全身给药后未能在脑实质内发现LPS(Singh和Jiang，2004年). 很明显，脂多糖与脑内皮细胞结合(Singh和Jiang，2004年;Verma等人，2006年). 因为这些细胞是体循环和脑实质之间的接口，它们可能有助于整合来自两个腔室的信息。因此，TLR4的重编程可能发生在大脑内皮内。
总之，我们已经证明LPS预处理对中风的细胞反应进行了重新编程，并导致了I型干扰素反应，对IRF3具有关键和保护作用。这些重编程事件可能是保护大脑免受额外损伤的内源性过程的例证，并表明LPS预处理从根本上改变了细胞对中风的反应。这是首次证明预处理刺激在缺血事件后产生干扰素指纹，也是首次报道TRIF–IRF3信号在损伤后的神经保护作用。
脚注
这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R01 NS050567（M.P.S.-P）的支持。我们感谢Jo-Lynn Boule、Eric Tobar、Delfina Homen、Tao Yang和Nikola Lessov博士的出色技术支持，感谢Roger Simon博士的建设性讨论。在俄勒冈州健康与科学大学基因微阵列共享资源的Affymetrix微阵列核心中进行了微阵列分析。
工具书类
- Bagchi A、Herrup EA、Warren HS、Trigilio J、Shin HS、Valentine C、Hellman J.MyD88依赖性和MyD88诱导依赖性途径在TLR激动剂之间的协同、启动和耐受性。免疫学杂志。2007;178:1164–1171.[公共医学][谷歌学者]
- Berchtold S、Manncke B、Klenk J、Geisel J、Autenrieth IB、Bohn E.强迫IFIT-2表达在转录后水平抑制LPS诱导的TNF-α表达。BMC免疫学。2008;9:75. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Biswas SK、Bist P、Dhillon MK、Kajiji T、Del Fresno C、Yamamoto M、Lopez-Collazo E、Akira S、Tergaonkar V。MyD88依赖性、TRIF途径在脂质A/TLR4诱导内毒素耐受中的作用。免疫学杂志。2007;179:4083–4092.[公共医学][谷歌学者]
- Broad A，Kirby JA，Jones DE。Toll样受体相互作用：对MyD88依赖性细胞因子的耐受性，但对MyD88-依赖性干扰素-β的产生增强。免疫学。2007;120:103–111. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- 曹CX，杨庆伟，吕福禄，崔杰，傅海波，王建中。减少Toll样受体4缺陷小鼠的脑缺血再灌注损伤。生物化学与生物物理研究委员会。2007;353:509–514.[公共医学][谷歌学者]
- Chakravarty S，Herkenham M.非造血细胞上的Toll样受体4在内毒素血症期间维持中枢神经系统炎症，不依赖于系统性细胞因子。神经科学杂志。2005;25:1788–1796. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Chen R，Zhou H，Beltran J，Mallellari L，Chang SL.内毒素耐受期间脑和血清中细胞因子的差异表达。神经免疫杂志。2005;163:53–72.[公共医学][谷歌学者]
- Fan H，库克JA。内毒素耐受的分子机制。《内毒素研究杂志》。2004;10:71–84.[公共医学][谷歌学者]
- Faraco G、Fossati S、Bianchi ME、Patrone M、Pedrazzi M、Sparatore B、Moroni F、Chiarugi A。神经细胞在不同应激条件下释放高迁移率族蛋白box 1，在体内外加剧缺血性神经变性。神经化学杂志。2007;103:590–603.[公共医学][谷歌学者]
- Gosselin D，Rivest S.MyD88在脑内皮细胞中的信号传导对全身炎症期间的神经元活动和糖皮质激素释放至关重要。分子精神病学。2008;13：480–497。[公共医学][谷歌学者]
- Hickey EJ、You X、Kaimaktchiev V、Stenzel-Poore M、Ungerleider RM。脂多糖预处理对深低温停循环引起的脑损伤具有强大的保护作用。胸心血管外科杂志。2007;133:1588–1596.[公共医学][谷歌学者]
- Hirotani T、Yamamoto M、Kumagai Y、Uematsu S、Kawase I、Takeuchi O、Akira S。MyD88和含有Toll/IL-1结构域的适配器诱导IFN-beta对脂多糖诱导基因的调节。生物化学与生物物理研究委员会。2005;328:383–392.[公共医学][谷歌学者]
- Hochberg Y，Benjamini Y。多重显著性测试的更强大程序。统计医学。1990;9：811–818。[公共医学][谷歌学者]
- Irizarry RA、Gautier L、Cope LM。寡核苷酸阵列统计分析的R包。收件人：Parmigiani G、Irizarry RA、Zeger SL，编辑。基因表达数据分析：方法和软件。纽约：Springer；2003[谷歌学者]
- Kinouchi H，Sharp FR，Hill MP，Koistinaho J，Sagar SM，Chan PH.大鼠短暂局灶性脑缺血后70-kDa热休克蛋白和hsp70 mRNA的诱导。大脑血流代谢杂志。1993年a；13:105–115.[公共医学][谷歌学者]
- Kinouchi H，Sharp FR，Koistinaho J，Hicks K，Kamii H，Chan PH.大鼠局灶性脑缺血后“半暗带”神经元中热休克hsp 70 mRNA和HSP70 kDa蛋白的诱导。大脑研究。1993年b；619:334–338.[公共医学][谷歌学者]
- Lang T，Mansell A.Toll样受体和相关通路的负调控。免疫细胞生物学。2007;85:425–434.[公共医学][谷歌学者]
- Lehnardt S、Lachance C、Patrizi S、Lefebvre S、Follett PL、Jensen FE、Rosenberg PA、Volpe JJ、Vartanian T。类收费受体TLR4对脂多糖诱导的中枢神经系统少突胶质细胞损伤是必需的。神经科学杂志。2002;22:2478–2486. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Lehnardt S、Lehmann S、Kaul D、Tschimmel K、Hoffmann O、Cho S、Krueger C、Nitsch R、Meisel A、Weber JR。Toll样受体2介导局灶性脑缺血的中枢神经系统损伤。神经免疫杂志。2007;190:28–33.[公共医学][谷歌学者]
- Liew FY，Xu D，Brint EK，O'Neill LA。类收费受体介导免疫反应的负调控。Nat Rev免疫学。2005;5:446–458.[公共医学][谷歌学者]
- 刘浩、辛莉、陈碧波、Teoh R、唐碧兰、谭玉华。β干扰素给药在兔血栓栓塞性脑缺血模型中产生有益的结果。神经科学快报。2002;327:146–148.[公共医学][谷歌学者]
- Maier CM、Yu F、Nishi T、Lathrop SJ、Chan PH。干扰素-β在短暂性局灶性中风模型中未能起到保护作用。(打、击等的)一下。2006;37:1116–1119.[公共医学][谷歌学者]
- Meller R、Stevens SL、Minami M、Cameron JA、King S、Rosenzweig H、Doyle K、Lessov NS、Simon RP、Stenzel Poore MP。骨桥蛋白对中风的神经保护作用。大脑血流代谢杂志。2005;25:217–225.[公共医学][谷歌学者]
- Nakaya T、Sato M、Hata N、Asagiri M、Suemori H、Noguchi S、Tanaka N、Taniguchi T。病毒感染期间不同IRF介导的基因诱导途径。生物化学与生物物理研究委员会。2001;283:1150–1156.[公共医学][谷歌学者]
- Olson JK，Miller SD。小胶质细胞通过多个TLR启动中枢神经系统固有和适应性免疫反应。免疫学杂志。2004;173:3916–3924.[公共医学][谷歌学者]
- Qin L，He J，Hanes RN，Pluzarev O，Hong JS，Crews FT。乙醇治疗后内毒素增加全身和脑细胞因子的产生和神经炎症。神经炎症杂志。2008;5:10. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Rosenzweig HL、Lessov NS、Henshall DC、Minami M、Simon RP、Stenzel-Poore MP。内毒素预处理可预防小鼠缺血神经保护期间的细胞炎症反应。(打、击等的)一下。2004;35:2576–2581.[公共医学][谷歌学者]
- Rosenzweig HL、Minami M、Lessov NS、Coste SC、Stevens SL、Henshall DC、Meller R、Simon RP、Stenzel-Poore MP。内毒素预处理可防止中风后TNFa的细胞毒性作用：TNFa在LPS缺血耐受中的新作用。大脑血流代谢杂志。2007;27:1663–1674.[公共医学][谷歌学者]
- Shi M，Deng W，Bi E，Mao K，Ji Y，Lin G，Wu X，Tao Z，Li Z，Cai X，Sun S，Xiang C，Sun B.TRIM30α通过靶向TAB2和TAB3降解负调控TLR-介导的NF-κB活化。自然免疫学。2008;9：369–377。[公共医学][谷歌学者]
- Singh AK，Jiang Y.外周脂多糖如何诱导大鼠大脑中的基因表达？毒理学。2004;201:197–207.[公共医学][谷歌学者]
- Stevens SL、Bao J、Hollis J、Lessov NS、Clark WM、Stenzel-Poore MP。使用流式细胞术评估炎症的时间变化。大脑研究。2002;932:110–119.[公共医学][谷歌学者]
- Swanson RA、Morton MT、Tsao-Wu G、Savalos RA、Davidson C、Sharp FR.测量脑梗死体积的半自动方法。大脑血流代谢杂志。1990;10:290–293.[公共医学][谷歌学者]
- Tasaki K、Ruetzler CA、Ohtsuki T、Martin D、Nawashiro H、Hallenbeck JM。脂多糖预处理可诱导自发性高血压大鼠抵抗随后的局灶性脑缺血损伤。大脑研究。1997;748:267–270.[公共医学][谷歌学者]
- Vadigepalli R、Chakravarthula P、Zak DE、Schwaber JS、Gonye GE。PAINT：基因调控网络识别的启动子分析和交互网络生成工具。OMICS公司。2003;7:235–252.[公共医学][谷歌学者]
- Veldhuis WB、Derksen JW、Floris S、Van Der Meide PH、De Vries HE、Schepers J、Vos IM、Dijkstra CD、Kappelle LJ、Nicolay K、Bär PR。干扰素-β阻断炎症细胞浸润，减少大鼠缺血性卒中后梗死体积。大脑血流代谢杂志。2003;23:1029–1039.[公共医学][谷歌学者]
- Verma S、Nakaoke R、Dohgu S、Banks WA。脑内皮细胞释放细胞因子：对脂多糖的极化反应。大脑行为免疫。2006;20:449–455.[公共医学][谷歌学者]
- Wei L、Fan M、Xu L、Heinrich K、Berry MW、Homayouni R、Pfeffer LM。生物信息学分析显示cRel是干扰素刺激基因子集的调节器。干扰素细胞因子研究杂志。2008;28:541–551. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- West MA，Heagy W.内毒素耐受性：综述。重症监护医学。2002;30：S64–S73。[公共医学][谷歌学者]
- Ziegler G、Harhausen D、Schepers C、Hoffmann O、Röhr C、Prinz V、König J、Lehrach H、Nietfeld W、Trendelenburg G。TLR2在小鼠短暂性局灶性脑缺血中具有有害作用。生物化学与生物物理研究委员会。2007;359:574–579.[公共医学][谷歌学者]
