动脉粥样硬化的炎症性质已经得到了很好的证实，但在动脉壁中引发炎症的因素仍基本未知。无菌动物易患动脉粥样硬化，表明内源性物质引发炎症1成熟的动脉粥样硬化病变在坏死核心中含有胆固醇晶体的宏观沉积物，但它们在动脉粥样硬化形成后期的出现被认为不符合原发性炎症刺激的条件。然而，使用一种新的显微镜技术，我们发现在饮食诱导的早期动脉粥样硬化病变中存在微小的胆固醇晶体，它们的出现与炎症细胞的首次出现相一致。
其他晶体物质可以通过刺激caspase-1激活NLRP3炎症小体而诱导炎症2,三导致IL-1家族细胞因子的分裂和分泌。在这里，我们证明胆固醇晶体也激活吞噬细胞中的NLRP3炎性体在体外在一个涉及吞噬-溶酶体损伤的过程中。同样，当腹腔注射胆固醇晶体时，胆固醇晶体会引起急性炎症，在缺乏NLRP3炎性体、组织蛋白酶B、组织酶L或IL-1分子组分的小鼠中，这种炎症会受到损害。此外，当用NLRP3-、ASC-或IL-1α/β缺陷的骨髓重建低密度脂蛋白受体（LDLR）缺陷小鼠并喂以高胆固醇饮食时，它们显著降低了早期动脉粥样硬化和炎症依赖性IL-18水平。
我们的结果表明，结晶胆固醇作为一种内源性危险信号，其在动脉或其他部位的沉积是炎症的早期原因，而不是后期结果。这些发现为动脉粥样硬化的发病机制提供了新的见解，并为该病的治疗指明了新的潜在分子靶点。
胆固醇是脊椎动物不可或缺的脂质，实际上不溶于水环境，复杂的分子机制已经形成，可以调节胆固醇的合成及其在液体中的运输4胆固醇晶体被认为是动脉粥样硬化病变的标志5它们的出现有助于对晚期动脉粥样硬化病变进行组织病理学分类6然而，结晶胆固醇可溶于组织学中使用的有机溶剂，因此大晶体的存在可以识别，但只能间接地作为所谓的胆固醇晶体裂缝，它描绘了样品制备之前所占的空间。动脉粥样硬化斑块中的大胆固醇结晶裂痕通常仅在晚期病变中观察到，因此，晶体沉积被认为是在本病晚期出现的。然而，鉴于动脉粥样硬化与胆固醇水平密切相关，我们有兴趣确定胆固醇晶体在动脉粥样硬化形成过程中首次出现的时间和地点。
我们用高胆固醇饮食喂养动脉粥样硬化预防性载脂蛋白E缺乏小鼠，以诱导动脉粥样硬化7,8并结合激光反射和荧光共焦显微镜三鉴定晶体材料和免疫细胞。早在开始粥样化饮食两周后，粥样硬化窦病变早期内皮下免疫细胞内就出现了许多小晶体(和补充图1、2). 通过fillipin染色（未显示），反光材料主要为胆固醇晶体。晶体沉积和免疫细胞募集随着饮食的增加而稳定增加，晶体的出现与巨噬细胞的出现相关（r2=0.99，p<0.001）(). 胆固醇晶体不仅在坏死核心中检测到，而且在富含免疫细胞的内皮下区域也检测到。共焦成像显示晶体可以定位细胞内外()而在染色过程中用有机溶剂处理的相应H&E染色切片中，只有在8周的饮食后才能看到胆固醇结晶裂痕，较小的结晶仍然不可见(). 正如预期的那样，我们未能在正常饮食的小鼠主动脉窦切片中检测到巨噬细胞或晶体堆积(; 底部面板）。对人类晚期动脉粥样硬化病变的额外观察表明，除了在标准组织学中会留下胆固醇晶体裂缝的较大晶体外，富含免疫细胞的区域在细胞内外也含有较小的晶体(补充图3、4). 这些研究证实，晶体出现在饮食诱导动脉粥样硬化的最早时间点，同时内皮下空间出现免疫细胞。
胆固醇结晶出现在早期动脉粥样硬化病变中一，H&E染色和b条对Apo-E-KO小鼠的相邻主动脉窦切片进行共焦荧光和反射显微镜检查，按照指示喂食高胆固醇饮食（上面板）或常规饮食（下面板）。白色或黑色方框中的区域被放大；晶体反射信号是绿色编码的。c、 d、e、，病变大小（c）、晶体或巨噬细胞标记物MoMa-2染色量的量化以绝对值（d）或病变大小百分比（e）表示。每组三只小鼠的代表性切片如图（a、b）所示。平均值和s.e.m.如（c，d，e）所示。
与组织炎症有关的各种晶体，以及成孔毒素或细胞外ATP，可以通过触发NLRP3激活IL-1家族细胞因子9值得注意的是，NLRP3炎症小体的形成需要启动步骤，启动步骤可以由模式识别或激活NF-κB的细胞因子受体提供。细胞启动导致IL-1家族细胞因子和NLRP3本身的原形式的诱导，这是NRLP3激活所需的一个步骤在体外10为了测试胆固醇晶体是否能激活IL-1β的释放，我们用胆固醇晶体培养LPS引发的人PBMC。胆固醇晶体以caspase-1依赖性的方式诱导裂解IL-1β的强劲、剂量反应性释放(). 值得注意的是，添加到未激发细胞中的胆固醇晶体没有向上清液中释放IL-1β，这表明没有任何污染物足以激发细胞()10IL-1细胞因子由半胱氨酸蛋白酶-1处理，半胱氨酸酶-1可被各种炎性体激活9由于据报道NLRP3炎性体可识别多种晶体，我们接下来刺激缺乏NLRP3炎症体成分的小鼠的巨噬细胞。胆固醇晶体诱导野生型但非NLRP3-或ASC-缺陷巨噬细胞caspase-1裂解和IL-1β释放(). 转染dsDNA（dAdT），一种诱导AIM-2炎症小体的控制激活物11如预期，激活caspase-1并以ASC依赖但非NLRP3依赖的方式诱导IL-1β释放(). 此外，小鼠巨噬细胞也产生了裂解的IL-18，这是另一个IL-1家族成员，由炎性体处理(). 我们还发现，化学纯合成胆固醇晶体激活了NLRP3炎症小体，进一步证明胆固醇晶体本身而不是污染分子是生物活性物质(补充图5a). 值得注意的是，NLRP3激活的细胞启动可以通过其他促炎物质实现，如革兰氏阳性菌的细胞壁成分(补充图5b). 此外，最小修饰的低密度脂蛋白也能激活NLRP3细胞(补充图5c)12综上所述，这些数据证实了结晶胆固醇导致人类和小鼠免疫细胞中NLRP3炎症小体激活。
胆固醇晶体激活NLRP3炎症小体a、 b中，如图所示，用胆固醇晶体、MSU晶体（250µg/ml）或ATP处理静止或LPS引发的人PBMC，在存在或不存在caspase-1抑制剂zYVAD-fmk（10mM）的情况下（b）。ELISA和免疫印迹（IB）检测IL-1β。c、 日期：，IB检测上清液和细胞裂解物中的caspase-1（c），或ELISA检测上清中的IL-1β（d），上清液来自LPS引物的野生型、NLRP3-或ASC-缺陷巨噬细胞，这些巨噬细胞由胆固醇晶体、转染的dsDNA（dAdT）、nigericin或ATP刺激。e中，用胆固醇晶体或黑精刺激LPS激发的野生型巨噬细胞上清液的IL-18 ELISA。显示了四个供体（a、b）或三个独立实验（c、d、e）中的一个的平均值和标准偏差。
关于NLRP3炎症小体激活的分子机制的几个假设已经被提出三,13为了进一步阐明胆固醇晶体识别的相关机制，我们通过药物抑制细胞松弛素D或镧菌素A的吞噬作用，发现这些药物通过晶体抑制NLRP3炎症小体的激活(和补充图6 a、c、d). 相比之下，这些抑制剂并没有通过成孔毒素黑精或AIM2激活剂dAdT阻止NLRP3炎性体的激活(和补充图6a、c、d). 为了追踪内化颗粒的命运，我们对与胆固醇晶体孵育的巨噬细胞进行了联合共焦反射和荧光显微镜检查。这项分析表明胆固醇晶体在一部分细胞中引起了严重的肿胀()与其他聚合材料相同三,14.噬菌体膜含有脂筏成分15这使我们能够用标记有一种荧光颜色的筏形标记物霍乱毒素B对细胞表面进行染色，并在用不同荧光的霍乱毒素B渗透细胞后，额外标记内部吞噬溶酶体膜。事实上，在先前摄入胆固醇晶体的巨噬细胞中，这种染色显示，一些胆固醇晶体缺乏吞噬溶酶体膜，并且存在于部分细胞的胞浆中，因此间接表明晶体诱导的吞噬溶酶体膜破裂(). 可溶性溶酶体标记物的晶体诱导易位进入细胞质进一步支持了这一发现（见下文）。此外，在小鼠巨噬细胞中，胆固醇晶体剂量反应导致溶酶体吖啶橙荧光丧失，进一步证实溶酶体破坏(). 这些研究表明，胆固醇晶体诱导巨噬细胞溶酶体损伤，导致吞噬溶酶体内容物转移到胞浆中。在进一步的实验中，我们发现抑制溶酶体酸化或组织蛋白酶活性会阻止胆固醇晶体诱导IL-1β分泌的能力(). 同样，对缺乏单一组织蛋白酶（B或L）的小鼠细胞的分析也表明，与野生型细胞相比，胆固醇晶体导致IL-1β释放减少。然而，在较高剂量下，胆固醇结晶诱导的IL-1β释放对单个组织蛋白酶的依赖性较小，这表明组织蛋白酶B和L的功能冗余或潜在的额外蛋白酶(). 总之，这些实验表明胆固醇晶体诱导溶酶体蛋白水解酶内容物的移位，NLRP3炎性体可以通过尚未明确的机制检测到这种移位。
胆固醇晶体通过诱导溶酶体损伤激活NLRP3炎性体a、，在存在或不存在细胞松弛素D的情况下，用胆固醇晶体或尼格瑞辛刺激LPS引发的小鼠巨噬细胞上清液的IL-1βELISA。b、 c、，将小鼠巨噬细胞与DQ卵清蛋白单独孵育（b，左）或与胆固醇晶体（125µg/ml）（b，右；c）孵育2h，然后用A647-结合的霍乱毒素b（b，c）染色质膜。c、，细胞固定、渗透（0.05%皂苷），内膜用A555结合的胆红素B额外染色。细胞核用Hoechst染料染色。日期：，胆固醇晶体刺激小鼠巨噬细胞6h，吖啶橙染色，FACS分析。e、 f、，在巴非霉素A1存在或不存在的情况下，LPS引发的、用胆固醇晶体刺激的小鼠巨噬细胞的上清液的IL-1βELISA（e），或用胆固醇晶体刺激的LPS引发的野生型、组织蛋白酶B或L缺陷巨噬细胞的上清液的IL-1βELISA（f）。g、 小时，用100µg/ml oxLDL刺激小鼠巨噬细胞达到指定时间和荧光右旋糖酐（g，20h），用共焦荧光和反射显微镜联合成像我，将未激发的小鼠巨噬细胞与氧化低密度脂蛋白孵育24 h，并通过ELISA测定上清液中的IL-1β。（a，d-f，i）显示了三个独立实验中的一个；指和s.d.（a，e，f）；五个（b，c）或两个（g，h）独立实验的代表性图像。
以前已经证明氧化低密度脂蛋白（一种沉积在血管中的主要脂质）有可能损伤溶酶体膜16我们发现，与氧化低密度脂蛋白共同孵育的巨噬细胞将这种物质和有核晶体内化在大的、肿胀的吞噬-溶酶体腔室中(); 在一些细胞中，荧光标记染料移位到胞浆时，这些隔室破裂(，箭头）。时间进程分析显示，在与氧化低密度脂蛋白（未显示）孵育一小时后，就出现了小晶体，而在更长的孵育时间后，可以看到较大的晶体(). 胆固醇晶体的形成可能是由于酸性胆固醇酯羟化酶的活性，该酶将氧化低密度脂蛋白提供的胆固醇酯转化为游离胆固醇。如上所述，最小修饰的低密度脂蛋白可以激发细胞对NLRP3炎症小体的激活(补充图5c). 最近的证据表明，这种启动是通过激活TLR4/6同型二聚体和CD36进行的12这一点，再加上最小修饰的低密度脂蛋白倾向于形成晶体和破坏溶酶体膜，表明这些低密度脂素物种可能足以提供激活细胞释放IL-1β所需的信号1和信号2。事实上，在孵育24小时后，我们观察到在没有进一步NLRP3炎性体刺激的情况下，IL-1β自发释放().
在小鼠动脉粥样硬化病变中，我们不仅发现了巨噬细胞和树突状细胞，而且还发现了积聚在内膜间隙内的中性粒细胞（参见补充图2). IL-1β在中性粒细胞的募集中起着关键作用，并且IL-1依赖性的中性粒细胞腹腔内积聚经常被用作体内炎症小体激活和IL-1生成的测定2,17,18使用这种急性炎症模型，我们发现胆固醇晶体能强烈诱导中性粒细胞流入腹膜(). 在缺乏IL-1或IL-1受体（IL-1R）的小鼠中，胆固醇结晶沉积后中性粒细胞流入腹膜的量显著减少，这表明IL-1的产生确实是胆固醇结晶诱导炎症的诱导和必要因素体内此外，与野生型小鼠相比，缺乏NLRP3炎性体成分或组织蛋白酶B或L的小鼠在胆固醇晶体注射后向腹膜招募的中性粒细胞明显更少。然而，在胆固醇晶体沉积后观察到的中性粒细胞内流减少，在缺乏IL-1相关基因的小鼠中比在缺乏NLRP3炎性体相关基因的鼠中更为明显()可能是因为IL-1α信号传导和/或IL-1β的caspase-1非依赖性处理的作用19
体内在任何情况下，这些数据证实胆固醇晶体触发NLRP3炎症小体依赖性IL-1的产生体内.
NLRP3炎性体介导结晶诱导的腹膜炎症和动脉粥样硬化体内a、，对C57BL/6（n=23）、B6-129（n=13）或编码IL-1R（n=11）、IL-1α/b（n=111）、IL-1a（n=4）、IL-1-β（n=四）、caspase-1（n=7）、ASC（n=15）、组织蛋白酶b（n=10）、组组织蛋白酶L（n=5）、NLRP3（n=110）基因缺陷的小鼠腹腔注射胆固醇晶体或PBS（C57BL/6 n=14；B6-129 n=14）。15小时后分析腹腔灌洗细胞中性粒细胞。数据表示重复2-4次实验的小鼠集合组的平均值和标准偏差。b–d，用C57BL/6（n=7）、NLRP3-KO（n=9）、ASC-KO（n=8）或IL-1α/b-dKO（n=7）骨髓重建的雌性LDLR-KO小鼠被喂食高脂饮食8周，并分析血清IL-18浓度（b）和平均主动脉窦病变大小（c，d）。（c） 每个点代表单个小鼠连续横截面的平均病变大小。（d） Giemsa染色主动脉窦的代表性照片。插图显示图像的2倍放大部分（黑框），箭头指向动脉粥样硬化病变。
为了测试NLRP3炎性体是否参与血管壁动脉粥样硬化形成的慢性炎症，我们测试了缺乏NLRP3、ASC或IL-1细胞因子是否可以调节低密度脂蛋白缺乏小鼠的动脉粥样硬化发展20，家族性高胆固醇血症的模型。我们用野生型或NLRP3-、ASC-或IL1α/β-缺陷小鼠的骨髓重建致死性照射的低密度脂蛋白缺乏小鼠，并对这些小鼠进行8周的高胆固醇饮食。在这些辐射骨髓嵌合体中，低密度脂蛋白缺乏抗辐射实质导致动物在高脂肪饮食中出现高胆固醇血症，而它们骨髓来源的巨噬细胞和其他白细胞缺乏对胆固醇晶体作出反应所需的NLRP3-炎性体或IL-1途径成分。我们发现不同组的小鼠的血胆固醇水平相似（未显示）。然而，用NLRP3-、ASC-或IL-1α/b-缺陷骨髓重建的小鼠显示出血浆IL-18水平显著降低，IL-1家族细胞因子的分泌依赖于炎症小体，以及动脉粥样硬化中已知升高的生物标志物21(). 此外，最重要的是，骨髓源性细胞缺乏NLRP3炎性体成分或IL-1细胞因子的小鼠对发展为动脉粥样硬化具有显著抵抗力(). 与具有野生型骨髓的嵌合体低密度脂蛋白缺乏小鼠相比，这些小鼠主动脉的病变面积平均减少了69%。这些数据表明，骨髓来源细胞激活NLRP3炎性体是饮食诱导小鼠动脉粥样硬化的主要原因。
动脉粥样硬化病变中引发炎症的分子一直是一个长期的难题。虽然病变完全依赖于胆固醇，但这种丰富的天然分子被认为是惰性的。在这里，我们表明胆固醇的结晶形式可以引起炎症。炎症反应的程度和NRLP3激活的机制似乎与结晶尿酸、二氧化硅和石棉的相同2,三,13众所周知，所有这些晶体都会引发临床上重要的炎症，如痛风、矽肺和石棉肺。
痛风、矽肺和石棉肺的慢性炎症被认为是由于细胞无法破坏摄入的聚集物，导致连续几轮的细胞凋亡和晶体物质的再吸收22同样，免疫细胞不能降解胆固醇，而是依赖于将胆固醇输出到高密度脂蛋白颗粒，后者将胆固醇输送到肝脏进行处置。因此，这种或任何细胞机制清除晶体的成功可能取决于HDL的可用性。低血HDL水平是动脉粥样硬化疾病最显著的危险因素之一23以及增加高密度脂蛋白的药物手段正在积极寻求治疗。
尽管胆固醇不能被外周细胞降解，但它可以被细胞酶酰基酶A:胆固醇酰基转移酶（ACAT）转化为胆固醇酯。胆固醇酯形成液滴而不是晶体，被认为是胆固醇的储存形式4假设减少胆固醇储存有助于减少动脉粥样硬化，ACAT抑制剂在大型临床试验中进行了测试。使用两种这种抑制剂的研究表明，冠状动脉粥样斑块的大小并没有减少，而是增加了24,25我们的研究结果表明，胆固醇的结晶形式可能是导致动脉炎症的关键因素，而抑制ACAT后胆固醇的结晶可能会增加。事实上，ACAT缺乏的小鼠研究表明，富含胆固醇晶体会增强动脉粥样硬化的形成26根据我们的研究结果，减少胆固醇结晶或阻断炎性小体途径的治疗策略将通过减少动脉粥样硬化的发生或发展而具有临床益处。在这方面，我们的发现也为治疗这种疾病的药物的开发指明了新的分子靶点。
方法
试剂
Bafilmycin A1、细胞松弛素D和zYVAD-fmk来自Calbiochem。ATP、吖啶橙和聚（dA:dT）钠盐形成Sigma-Aldrich，超纯LPS购自Invivogen。Nigericin、Hoechst染料、DQ卵清蛋白和荧光胆角蛋白B购自Invitrogen。MSU晶体的制备如所述17.
胆固醇晶体制备
组织培养级或合成胆固醇购自Sigma，在热丙酮中溶解并冷却结晶。经过6次重结晶循环后，在10%无内毒素水的存在下进行最终结晶，以获得水合胆固醇晶体。采用电子冲击GC/MS和硅胶和乙酸乙酯（80:20）溶剂薄层色谱法分析胆固醇晶体的纯度。使用微管组织研磨机改变晶体尺寸。通过在PBS中添加DiD或DiI染料（Invitrogen）制备荧光胆固醇。
ELISA和Western Blot
根据制造商的说明，进行了IL-1β（Becton Dickinson）和IL-18（MBL International）的ELISA测定。在无血清DMEM培养基中进行caspase-1蛋白印迹分析实验。刺激后，通过添加10X裂解缓冲液（TBS和蛋白酶抑制剂中的10%NP-40）裂解细胞，并在4–20%还原性SDS-PAGE上分离核后裂解物。抗鼠caspase-1 pAb由P.Vandenabeele（荷兰根特大学）提供。如上所述，在无血清上清液中分析来自人PBMC的抗人裂解IL-1β（细胞信号），而不进行细胞溶解。
共焦显微镜
阿波（ApoE）−/−在无病原体设施中饲养的小鼠喂食西式饮食（Teklad调整卡路里88137；21%脂肪（wt/wt）、0.15%胆固醇（wt/w）和19.5%酪蛋白（wt/wt）；无胆酸钠），从8周龄开始，持续2、4、8或12周（每组3只小鼠）。按照描述对小鼠实施安乐死并收集心脏27心脏在主动脉瓣叶的起点连续切片，每三个切片（5µm）用苏木精和伊红染色，并通过光学显微镜成像。将相邻切片固定在4%多聚甲醛中，封闭并渗透（10%山羊血清/PBS中0.5%皂苷），并在37°C下用抗巨噬细胞（MoMa-2，Serotec）、DC（CD11c，Becton Dickinson）或中性粒细胞（抗中性粒细胞，Serotec）的荧光一级抗体染色1h，以进行共聚焦显微镜成像。
尸检后直接获得人类动脉粥样硬化病变，以2-3mm的间隔连续切片，并如上所述制备冰冻切片（5mm）。平行切片用Masson三色染色。如上所述，准备组织进行显微镜检查。用抗CD68（Serotec）对巨噬细胞进行染色，用荧光phaloidin（Invitrogen）观察平滑肌细胞。人类和小鼠样品用Hoechst染料进行复染，以显示细胞核。动脉粥样硬化病变在徕卡SP2 AOBS共焦显微镜上成像，其中免疫荧光染色通过标准共焦技术可视化，晶体通过使用声光分束器增强透射率的激光反射可视化，如所述三值得注意的是，在该装置中，激光反射和荧光发射发生在同一共焦面上。从每只小鼠的三个数字捕获切片（Photoshop CS4 Extended）中量化平均病变面积、晶体沉积量和单核细胞标记物的存在。为了量化晶体质量和存在的巨噬细胞，确定正像素的总和（分别是激光反射或荧光），并根据像素大小计算面积。小鼠巨噬细胞的共焦显微镜检查如前所述三DQ卵清蛋白仅在蛋白水解过程中发出荧光，并标记巨噬细胞中的吞噬小室。
吖啶橙溶酶体损伤试验
如前所述，通过流式细胞仪进行该分析三.
骨髓移植与动脉粥样硬化模型
8周龄女性LDLR−/−对小鼠进行致命照射（11 Gy）。骨髓由C57BL/6、NLRP3的股骨和胫骨制备−/−、ASC−/−和IL-1α−/−b条−/−使用补体（Pel-Freez Biologicals）和抗Thy1 mAB（M5/49.4.1，ATCC）耗尽供体小鼠和T细胞。用3.5×10重组受照小鼠6骨髓细胞注入尾静脉。4周后，用西式饮食喂养小鼠8周（Teklad调整卡路里88137；21%脂肪[wt/wt]，0.15%胆固醇[wt%wt]和19.5%酪蛋白[wt/wt]；不含胆酸钠）。对小鼠实施安乐死，并用福尔马林进行心内灌注。心脏被埋入OTC（Richard-Allen Scientific，Kalamazoo，MI）培养基中，冷冻，并从主动脉瓣叶的起源处通过主动脉连续切片，收集整个主动脉窦（800µm）的每一个截面（10µm。由两名独立研究人员对每只小鼠12个苏木精-伊红或吉姆萨染色的平均病变面积进行量化，结果几乎相同。血清胆固醇水平通过酶法测定（Wako Diagnostics），血清IL-18通过SearchLight蛋白质阵列技术测定（马萨诸塞州Billerica Aushon Biosystems）。
统计分析
组间差异的显著性通过单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的多组与对照组的后比较检验或Student的t吨测试2组。根据皮尔逊相关系数计算R平方。使用Prism（GraphPad Software，Inc.）进行分析。
