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公共科学图书馆一号。2010; 5（9）：e13002。
2010年9月27日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pone.0013002
预防性维修识别码：项目经理2946336
PMID：20885998

互补模型系统中与胰腺癌上皮间充质转移相关的糖原表达变化

凯文·莫宾,1 阿尔卡戴普·辛哈,1 艾米丽·尤格斯特,1 杰瑞米·米勒,1 朱莉安娜·罗斯,2 文森特·保利诺,2 文卡特什瓦尔·G·凯沙穆尼,三 Nhan Tran公司,2 迈克尔·贝伦斯,2 克雷格·韦伯,1和布莱恩·哈布1,*
罗杰·查马斯，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

背景

选择性检测和靶向经历上皮-间充质转化（EMT）的癌细胞的能力可能会导致治疗癌症（如胰腺癌）的方法的改进。以前，细胞糖基化的重塑与细胞分化有关，可能是EMT的一类有价值的分子靶点。

方法/主要发现

作为研究EMT中糖基化改变性质的第一步，我们对三个组织中聚糖相关基因的表达进行了表征体外每个模型系统都代表了胰腺癌EMT的一个互补方面。这些模型包括：1）TGFβ诱导的EMT，它提供了一种状态之间的主动转换；2） 一组22个胰腺癌细胞系，代表上皮样或间质样的终末分化状态；3）活跃迁移和静止细胞，这为迁移机制提供了一个视角。我们分析了587个参与糖基化（生物合成、糖转运、聚糖结合等）或EMT的基因的表达数据。在前两个模型中，糖原的改变率高于所有其他基因（分别为p<0.05和<0.005），但在迁移模型中没有改变。诱导的EMT模型和细胞系小组之间共享了几个功能主题，包括基质成分和蛋白多糖的改变，糖胺聚糖的硫酸化；甘露糖受体家族成员；O-糖基化起始；和某些形式的唾液酸化。蛋白质水平变化通过甘露糖受体MRC2和O-糖基化酶GALNT3的Western blot证实，细胞表面硫酸化变化通过Alcian Blue染色证实。

结论/意义

糖原的改变是癌症EMT的主要组成部分，其特征是基质成分的改变、GAG的硫酸化、甘露糖受体、O-糖基化和特定的唾液酸化结构。这些结果为靶向侵袭性和耐药形式的胰腺癌细胞提供了线索。

介绍

胰腺癌是所有主要癌症中存活率最低的癌症之一[1]胰腺癌的致命性与其在诊断前的早期扩散趋势有关[2],[3]及其对化疗药物的耐药性[2],[4]胰腺癌细胞迁移和耐药特性的获得可能会逐步发生，伴随着癌细胞的遗传和形态的不断变化。早期和癌前状态被认为是由胰腺导管内的异常增生细胞组成的[5]导管腺癌的发展特征是增生的上皮癌细胞聚集在被纤维化基质包围的管状导管结构中。胰腺癌的转移性播散需要细胞脱离上皮性导管结构，并具有迁移性间充质细胞的特征。这种转变涉及细胞的巨大重塑，可能是由遗传变异、细胞外信号和癌细胞分化程序的激活所驱动。描述胰腺癌细胞从上皮样性状向间质样性状表型转换相关的分子改变将为检测和靶向这种转换提供途径。

胰腺癌细胞的这种主要表型转换可能是由上皮-间充质转化（EMT）驱动的。EMT是一个生物程序，它协调细胞分化从上皮特征（强烈的细胞-细胞粘附、极性和光滑的形态）向间充质特征（最小的细胞-间接触、极性丧失和细胞投射增加）的转化[2],[6],[7],[8],[9]EMT通常在组织重塑过程中的发育和伤口愈合过程中被激活，但被认为被某些类型的癌细胞异常激活，从而产生与高致死性癌症相关的特征。多种证据支持EMT在促进胰腺癌侵袭性方面的重要性。细胞分化的一般组织学丧失是胰腺癌预后不良的高度准确的预测因素[10],[11]E-cadherin减少和vimentin增加的特异EMT标记物与生存率低下相关[12],[13]和入侵[14]胰腺癌小鼠模型再现了这种关系[15]与这些发现一致，一种称为snail的转录因子的诱导，控制E-cadherin的抑制，导致胰腺癌细胞的转移和化疗耐药性增加[16]此外，如吉西他滨耐药与间充质性状之间的相关性所示，间充质样癌细胞可能比上皮样癌细胞更具耐药性[17]以及失去上皮样特征的胰腺癌细胞对EGFR-抑制剂敏感性的丧失[8]深入的研究已经揭示了这种转化的许多调节机制和分子特征[2],[6],[7],[8],[9]，但在癌症EMT中起作用的体内因素以及与胰腺癌进展相关的因素尚不清楚。

在EMT期间，癌细胞的糖基化可能会显著重塑，尽管这种关联的性质尚未得到很好的描述。糖基化是一个动态过程，涉及内质网和高尔基体中各种糖基转移酶和相关酶之间的协同作用[18].聚糖结构参与蛋白质的正确折叠[19],[20],[21]，细胞内贩运[18],[20],[22]细胞生长和分化，[20],[23]、粘附和迁移[18],[24]和细胞免疫[20],[25]，以及其他功能。聚糖的变化已被检测到，并与各种病理条件有关[23],[26]此外，细胞表面的碳水化合物结构和分泌蛋白是细胞类型和状态的良好指标，因为它们随着发育而发生特殊变化[27],[28]、细胞分化和激活[29],[30]、和转换[31]因此，我们假设胰腺癌EMT的特征是特定的糖基化改变，在癌细胞分化或迁移中发挥功能作用。

作为检验这一假设的第一步，我们检测了三种EMT或迁移模型系统中糖基化相关基因的表达。实验上，监测基因表达比全面表征与每个模型系统相关的聚糖结构更容易处理，因此我们选择了这条路线进行初步研究。虽然不可能仅从糖原基因的基因表达推断聚糖结构，但糖原基因中的表达变化提供了对主要结构变化的见解，并为治疗干预的靶点提供了线索。以前已经使用专门用于测量相关转录物的聚焦微阵列或PCR阵列来检测糖原的表达变化[32],[33],[34]在这里，我们通过选择性分析587个聚糖相关基因（包括与EMT相关的基因）的目标基因列表中的数据，证明了使用全基因组表达谱来捕获相同的信息。这种方法的一个优点是能够使用标准的表达谱分析平台以及非专门用于检测糖原基因的历史数据。我们使用的细胞培养系统中，EMT可以通过TGFβ刺激来控制（模型1），或者各种细胞系的最终分化状态可以分为上皮样或间质样（模型2）。此外，我们检测了活跃迁移或静止的细胞（模型3）中的基因表达模式。每个模型系统代表了与EMT相关的细胞行为的不同方面：状态之间的活动转换、末端分化状态或迁移活动。我们在此报告了与每个模型系统相关且在模型系统之间常见的聚糖相关基因表达的主要变化。

结果

转化生长因子β诱导的EMT中糖原的表达

我们检测糖原表达变化的第一个模型系统是TGFβ对Panc-1和A549细胞系EMT的诱导。A549细胞系并非来源于胰腺癌，但纳入该细胞系是为了提供与EMT相关的一般性信息。此外，通过寻找两种细胞系中发生变化的基因，我们减少了候选基因的列表。TGFβ治疗导致两种细胞系中细胞间黏附的溶解和纺锤状突起的增加(图S1). 使用Affymetrix基因芯片对处理和未处理的细胞进行全基因组表达测量。为了对感兴趣的基因进行重点分析，我们使用了587个与糖基化和EMT相关途径相关的基因列表（参见表S1).

我们首先研究了糖基化相关基因是否比所有其他基因表现出更高的表达变化率(表1)这可能表明糖基化改变在EMT中起着重要作用。在所有基因中，用TGFβ治疗后，1524个独特的Affymetrix靶点改变了Panc-1和A549的表达。由于我们的聚糖相关基因占全部独特Affymetrix U133 Plus 2.0靶点的1.5%，因此糖原的随机表达预测，在那些改变表达的基因中，相应的糖原（或23个基因）的表达为1.5%。然而，1524个基因中有40个（2.6%）是我们目标列表中的糖原基因。通过χ2分析（X2 = 13.05，p<0.05）。这一结果表明，在TGFβ诱导的EMT中，聚糖相关基因的转录调控富集。

表1

糖原表达改变率。
模型系统
诱发EMT1 单元格行面板2 正在迁移单元格三
探测的基因总数35,88835,88816, 087
探测到的糖原（占总量的%）555 (1.5%)555 (1.5%)525 (3.3%)
总基因变化152436752778
糖原变化（占总变化的百分比）40 (2.6%)87 (2.4%)84 (3.0%)
糖原富集（p值，奇方）p<0.05p<0.005不重要
1改变的基因被定义为三倍Panc-1细胞中的显著差异（p<0.05）和A549细胞中+/-0.25倍的变化。
2间质样和上皮样细胞系之间的基因改变定义为p<0.05。
三改变的基因定义为Panc-1和MiaPaCa细胞中+/-0.25倍的变化。

对两种细胞系中改变超过1.5倍的基因进行检测(表2和​和3）三)揭示了一些功能主题。变化最大的是蛋白聚糖SPOCK1，它包含肝素和硫酸软骨素的糖胺聚糖侧链[35]与该蛋白相关的修饰糖胺聚糖硫酸化的基因上调，包括SULF2、CHST3和CHST11，HAS2上调，其参与糖胺聚糖透明质酸的合成。参与细胞运动和细胞外基质重塑的凝集素样受体MRC2上调。GALNT2和GALNT10的变化表明O-糖基化起始的改变，基质粘附的变化表现为几种整合素和基质蛋白LAMC2（γ2层粘连蛋白）的上调。其他升高的基因代表EMT和TGF信号功能。六个表达减少的基因在特异性方面没有表现出特别的富集，ST8SIA4是唯一的糖基转移酶减少。

表2

TGFβ诱导的EMT中表达增加的基因。
类别符号姓名1 恩特雷兹IDEMT引起的Panc-1折叠变化2 EMT引起的A549折叠变化2
糖蛋白类聚光灯1sparc/骨连蛋白、cwcv和kazal样结构域蛋白多糖（testican）166958.0470.53
TGF–Pathway公司长期业务流程2潜在转化生长因子β结合蛋白2405310.339.42
聚糖降解 硫酸钠2 硫酸酯酶2 55959 2.84 9.23
EMT标记 ZEB1号机组 锌指电子盒装订同源盒1 6935 8.31 2.74
糖蛋白类灯2层粘连蛋白，γ239182.926.45
缺口路径JAG1号机组锯齿状1前体1825.543.10
糖蛋白类ITGA2公司整合素，α2（CD49B，VLA-2受体的α2亚单位）36733.245.13
聚糖转移酶CHST3型碳水化合物（软骨素6）硫转移酶394692.314.30
TGF–Pathway公司TGFB1II型转化生长因子β1诱导的转录物170411.824.78
糖蛋白类ITGB3标准整合素，β3（血小板糖蛋白IIIa，抗原CD61）36903.842.58
甘氨酸转移酶HAS2型透明质酸合成酶230371.504.87
甘氨酸转移酶瑞士标准11碳水化合物（软骨素4）硫转移酶11505151.604.62
糖蛋白类ITGA5公司整合素，α5（纤维连接蛋白受体，α多肽）36781.703.74
TGF–Pathway公司TGFB1型转化生长因子，β170402.612.57
聚糖转移酶GALNT2公司多肽N-乙酰氨基半乳糖基转移酶225902.352.78
聚糖转移酶镀锌10ppGalNAc T10；GalNAc转移酶10555682.192.64
EMT标记麋鹿3ETS域蛋白（SRF辅助蛋白2）20041.812.99
努克。糖SLC35F2系列溶质载体家族35成员F2547331.832.74
糖蛋白类ITGAV公司整合素，αV（玻璃体凝集素受体，α多肽，抗原CD51）36851.582.68
CBP：C型凝集素MRC2系统内吞受体（巨噬细胞甘露糖受体家族）2腺苷受体，C型299021.982.15
糖蛋白类ITGA3公司整合素，α3（抗原CD49C，VLA-3受体的α3亚基）36752.081.90

表3

TGFβ诱导的EMT中表达减少的基因。
类别符号姓名1 入口IDEMT诱导的Panc-1折叠变化2 EMT引起的A549折叠变化2
糖蛋白类 CDH1型 钙粘蛋白1，1型，E-钙粘蛋白（上皮性） 999 4.01 9.52
聚糖转移酶ST8SIA4型ST8α-N-乙酰基-神经酰胺α-2,8-唾液酸转移酶479032.968.16
CBP：C型凝集素KLRC3型杀伤细胞凝集素样受体亚家族C，成员338236.842.78
CBP：C型凝集素CD302型C型凝集素结构域家族13，成员A99362.313.13
EMT标记扭转2扭转同源物2（果蝇）1175812.662.27
半乳糖凝集素LGALS3BP公司半乳糖凝集素6结合蛋白39591.912.78
1只包括表达变化大于+/-50%的探针。粗体基因显示了22细胞系面板的共同趋势。
2当给定基因存在多个探针时，计算结果的平均值。

胰腺癌细胞系中糖原的表达

第二个模型系统是一组22个胰腺癌细胞系。在细胞系中观察到细胞形态和粘附行为的多样性(图1). 某些细胞系具有强烈的上皮特征（圆形形态和大量的细胞-细胞接触），而其他细胞系则明显呈间质样（纺锤状突起和少量细胞-细胞粘附）。因此，我们试图确定区分这两种行为的基因表达特征。这一比较并不直接涉及EMT，而是揭示了与间充质和上皮表型相关的终末分化状态。

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选定胰腺癌细胞系的形态学和聚类。

上排为间充质样细胞系，下排为上皮样细胞系。注意，与上皮细胞更紧密的细胞间粘附和更球形的特征相比，在间充质样细胞中看到的细胞散射和纺锤状突起增加。图像通过10倍放大率的相控显微镜采集。

我们最初根据形态学和聚类将细胞系分为上皮样或间充质样(图1). 细胞系如CAPAN-2、HPAF-II和BXPC-3具有致密、圆形的集落，明确地被归类为类上皮细胞。在光谱的另一端，MiaPaCa-2和MPanc-96清楚地显示出低细胞-细胞相互作用和纺锤体样细胞投射的间充质特征。其他细胞系更难根据这些特征进行分类，表现出每种类型的混合或部分特征。因此，我们将EMT相关基因的表达作为一种分类方法(图S2). 在这些基因中（参见图S2完整列表中）ZEB1转录因子最明显地与形态学对应，并与上皮标记物E-钙粘蛋白（CDH-1）的下调密切相关[6],[7],[8],[9]在间质样细胞中。ZEB1呈阴性或阳性的细胞明显存在明显的二分法，将细胞系分为6个间质样细胞和16个上皮样细胞。根据这一分类，上皮细胞中E-cadherin（CDH-1）的表达显著上调（p≤0.01），波形蛋白（VIM）的表达明显下调（p≤0.1）。Western blot证实了这两个基因的蛋白表达模式(图2). 因此，我们在随后的分析中使用了这种分类。

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选定胰腺癌细胞中E-cadherin和vimentin蛋白水平。

从所选细胞系中收集裂解物，用SDS-PAGE进行分离，并用Western blot进行检测。突出显示的条带的预期分子量为E-cadherin 110 kD，vimentin 57 kD，actin 42 kD。

我们检测了组间聚糖相关基因的差异是否高于所有其他基因(表1). 严格来说，由于我们的聚糖相关基因占Affymetrix U133 Plus 2.0唯一靶点总数的1.5%，因此我们预计在总变化基因列表中，相应的糖原代表性为1.5%。然而，在3675个显示间充质样细胞和上皮样细胞之间表达水平显著改变（p≤0.05）的探针中，87个（2.37%）是我们的目标列表中的糖原。齐方分析表明这些结果非常显著（X2 = 18.9，p≤0.005）。由于1212个独特的Affymetrix靶点显示出显著不同的表达水平（p≤0.01），这种趋势在更高的显著性水平上继续存在。在这些靶点中，有30个（2.48%）作为糖原基因在我们的列表中，通过卡方分析也存在显著差异（X2 = 8.12; p≤0.005）。该分析表明，糖相关基因在间充质和上皮细胞表型分化中的转录调控丰富。

该模型系统的基因表达变化总结如下表4和​和5。5与上述相似，蛋白多糖在间质样细胞中的过度表达最为显著，在本例中为VCAN（云芝），调节糖胺聚糖硫酸化的基因上调，包括SULF2、CHST7、SGSH和NDST2。基质修饰还表现为VIM（波形蛋白）和LAMA4（α4层粘连蛋白）的上调。与诱导的EMT模型不同，参与多糖链分支或延伸的基因在间质样细胞中上调，包括MGAT5B、ST3GAL2、ST6GALNAC4、POMGNT1和B3GNT1。间充质样细胞也在一些基因中表现出显著的下调，最显著的是启动O-糖基化的GALNT3。GALNT3在所有六个间充质样细胞中均下调，平均下调约1000倍。两种C型凝集素LY75和CLEC3A也下调。这些基因的表达模式清楚地区分了间质样细胞系和上皮样细胞系(图3).

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区分细胞系的基因的表达模式。

包含的基因在间质样（柱标为红色）和上皮样（柱标记为黑色）细胞系之间具有显著差异（p<0.01）的表达水平。表达值采用对数变换（以10为基数），中位数按行居中。每个方块的值由颜色栏指示。

表4

与上皮样细胞相比，在间充质样细胞系中具有更高表达的基因。
类别符号姓名1 入口IDp值2 折叠更改2
CBP：C型凝集素VCAN公司Versican公司14622.81E-03至4.16E-0320.75至39.03
EMT标记 ZEB1号机组 锌指电子盒结合同源盒1 6935 1.55E-10至7.44E-08 4.98至11.72
聚糖降解 硫酸钠2 硫酸酯酶2 55959 3.92E-03至5.77E-03 7.56至8.26
EMT标记振动波形蛋白74314.61E-05至1.44E-037.38至7.55
糖蛋白类MUPCDH公司粘蛋白和类钙粘蛋白538412.04E-03版7.14
糖蛋白类LAMA4型层粘连蛋白，α439102.85E-03至2.90E-033.70至3.87
聚糖转移酶瑞士标准7碳水化合物（N-乙酰氨基葡萄糖6-O）硫转移酶7565482.61E-03年3.43
甘氨酸转移酶5亿加元甘露糖基（α-1,6-）糖蛋白β-1,6-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶，同工酶B14666403年1月16日3.35
聚糖降解SMPD1公司酸性鞘磷脂酶66097.33E-04日2.97
甘氨酸降解CTSA公司组织蛋白酶A前体54763.45E-03年2.39
糖蛋白类SELPLG公司选择素P配体64046.93E-03号2.24
聚糖降解SGSH公司N-磺基葡萄糖胺磺酸水解酶（磺胺酶）64482004年1月15日2.10
聚糖转移酶ST3镀锌2ST3β-半乳糖苷α-2,3-唾液酰转移酶264833.12E-05日2.05
聚糖转移酶ST6GalNAc4型ST6（α-N-乙酰基-神经氨基-2,3-β-半乳糖基-1,3）-N-乙酰氨基半乳糖α-2,6-唾液基转移酶4270903.73E-03至8.64E-031.97至2.00
TGF–Pathway公司TIAF1公司TGFB1诱导的抗凋亡因子192201.00E-02号机组1.93
聚糖降解GALNS公司N-乙酰氨基半乳糖-6-硫酸酯酶前体25884.85E-031.85
聚糖转移酶NDST2型N-脱乙酰酶/N-硫转移酶（肝素葡糖胺基）285091.85E-04型1.81
聚糖转移酶POMGNT1公司β1,2-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶556243.70E-03（电子03）1.78
聚糖转移酶POFUT1型蛋白O-岩藻糖基转移酶1235094.00E-03（电子版）1.70
聚糖降解GBA公司葡萄糖苷酶，β；酸的26292.82E-03型1.70
聚糖转移酶B3GNT1型UDP-GlcNAc：βGalβ-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶1110419.61E-03号1.64

表5

与上皮样细胞系相比，间质样细胞系中表达较低的基因。
类别符号姓名1 入口IDp值2 折叠更改2
聚糖转移酶GALNT3号机组多肽N-乙酰氨基半乳糖基转移酶325912.17E-04日1116.29
CBP：C型凝集素LY75岁淋巴细胞抗原7540657.06E-03版22.82
糖蛋白类MUC4型粘蛋白4，细胞表面相关45852003年1月8日11.55
糖蛋白类CDH3型钙粘蛋白3，P-钙粘蛋白（胎盘）10014.49E-03号机组7.98
糖蛋白类 CDH1型 钙粘蛋白1，1型，E-钙粘蛋白（上皮性） 999 9.91E-04至9.74E-03 3.38至5.78
CBP：C型凝集素CLEC3A公司C型凝集素结构域家族3成员A101432003年2月21日4.76
聚糖转移酶太平洋投资管理公司磷脂酰肌醇聚糖锚定生物合成931837.42E-03年1.57
1仅包括表达变化显著（p≤0.01）且大于+/-50%的基因。粗体显示的基因与EMT诱导的癌细胞株有共同的趋势。
2由多个探针表示的基因具有p值和以范围表示的折叠变化。

迁移和静止胰腺癌细胞中糖原的表达

第三个模型系统是活跃迁移细胞与静止细胞的比较[36]将Panc-1和MiaPaCa-2细胞播种为1mm定义的周长，允许细胞迁移48h。观察到两个不同的形态群体。细胞簇外围的细胞远离高细胞密度区域（边缘），呈现典型的间充质表型，呈纺锤状突起，细胞间黏附丧失。保留在高密度中心（核心）的细胞表现出更大的细胞间粘附，外观更圆。通过选择性地从这两组中的每一组收集细胞，将其分为“边缘”组和“核心”组。

与静止的靶点相比，2778个独特靶点在迁移的MiaPaCa-2和Panc-1中的表达变化了至少+/-0.25倍(表1). 由于我们的聚糖相关基因占安捷伦全人类基因组微阵列试剂盒（4×44K探针）总独特量的3.0%，因此随机机会预测在改变的基因列表中相应的糖原代表性为3.0%。确实观察到了这种表达水平，因为2778个表达水平改变的基因中有84个（3.0%）是我们目标列表中的糖原基因。齐方分析表明，与预期值相比，糖原基因的观察变化之间的差异并不显著。这些结果并不表明聚糖相关基因的调控在表征活跃迁移细胞和静止细胞之间的差异方面有所丰富。

与上述模型相比，组间差异表达的基因更少(表6和​和7）。7). 在迁移的MiaPaCa-2和Panc-1中，8个靶基因的表达增加了1.5倍以上。在这两种细胞类型中，没有基因增加超过两倍。在表达增加的基因中，没有明确的糖原功能主题。在MiaPaCa-2和Panc-1中，9个靶基因的表达水平都降低了1.5倍以上。其中两种与N-聚糖MAN1A2和MANBA生物合成中甘露糖的去除有关。黏蛋白MUC12是两种细胞类型中唯一表达量减少两倍以上的基因。

表6

细胞迁移中高表达的基因。
类别符号姓名1 入口IDPanc-1移植折叠更改2 MiaPaCa-2迁移褶皱变化2
聚糖转移酶镀锌3ST3半乳糖-3-O-硫转移酶3897923.881.54
槽口通道槽口4缺口同源物448552.931.83
聚糖转移酶FUT4（功能表4）岩藻糖基转移酶4（α（1,3）岩藻糖基转移酶，髓系特异性）25261.802.12
聚糖转移酶GALNT13号机组ppGalNAc T13；UDP-N-乙酰-α-D-半乳糖胺：多肽1148052.281.61
糖蛋白类MCOLN1型粘蛋白1571921.801.84
糖蛋白类CDH15型钙粘蛋白15，1型，M-钙粘蛋白（肌管）10131.681.93
糖蛋白类ITGA2公司整合素，α2（CD49B，VLA-2受体的α2亚单位）36731.941.50
CBP：C型凝集素REG4（寄存器4）再生胰岛衍生家族，成员4839981.511.64

表7

细胞迁移中表达较低的基因。
类别符号姓名1 入口IDPanc-1迁移折叠更改2 MiaPaCa-2迁移褶皱变化2
糖蛋白类粘液12粘蛋白12，细胞表面相关100712.313.45
甘氨酸降解MAN1A2公司甘露糖苷酶α1A类成员2109051.892.59
转化生长因子β途径TGFBR3型转化生长因子，β受体III70491.792.50
努克。糖SLC35A3型溶质载体家族35（UDP-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）转运体），成员A3234431.882.33
聚糖降解GALC公司半乳糖神经酰胺酶前体25811.531.92
聚糖转移酶CHST1号机组碳水化合物（硫酸角质蛋白Gal-6）硫转移酶185341.831.59
CBP：C型凝集素ATRN公司吸引力84551.591.82
聚糖降解曼巴甘露糖苷酶，βA，溶酶体41261.571.56
CBP：C型凝集素REG3A型胰腺炎相关蛋白50681.541.54
1仅包括两种细胞系表达变化大于+/-50%的探针。
2多个探针代表的基因表示为平均值。

共享基因和功能主题

接下来，我们研究了某些基因表达变化在两个或多个模型系统之间是否常见。这样的分析有助于提供更多的指导，了解哪些基因在EMT的多个方面是重要的，哪些基因在与EMT相关的过程中是重要的。模型系统之间的重叠很小。在比较TGFβ诱导的EMT和细胞系面板时，只有三个基因是共同的：ZEB1和SULF2在两种模型中都上调，CDH1在两种模型中都降低。仅使用TGFβ诱导和迁移细胞模型中Panc-1细胞系的数据，所有模型系统中ST6GALNAC4增加，PIGM减少。这些结果表明，虽然糖原基因在每个模型中都发生了改变，并且在诱导的EMT和细胞系面板中特别丰富，但每个系统中涉及的特定基因是不同的。

虽然诱导-EMT模型和细胞系面板之间的许多改变基因不同，但两者都存在一些功能主题。最主要的共同主题是细胞外基质的糖胺聚糖（GAG）成分的调节。SPOCK1和VCAN（versican）都是携带GAG链的基质蛋白，这两个系统都显示出对添加和从这些链中去除硫酸盐的基因的调节，包括SULF2、CHST3、CHST11、HAS2、CHST7、SGSH，和NDST2。为了进一步表征上皮细胞和间充质样细胞系之间的整体硫酸化水平，以及TGFβ在Panc-1中诱导EMT后，进行了Alcian Blue分析(图4). 间质样细胞系的整体硫酸化显著增加（p=1.29×10−5). TGFβ在Panc-1中诱导EMT，使硫酸化总体水平显著增加（p=0.027）。这些结果证实了基因表达提示的两种模型系统的细胞硫酸化变化。

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选定胰腺癌细胞株微阵列数据的RT-PCR和Western blot验证。

（A） 对所示细胞系的裂解产物进行RT-PCR，并量化每个基因预期大小的条带强度。进行学生t检验（由p值给出的结果），比较间充质样细胞系（粗体）和上皮细胞系之间的条带强度。此外，计算RT-PCR结果和微阵列数据之间的相关性（结果由r值给出）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为cDNA负载对照。（B） 通过Western blot比较选定胰腺癌细胞系中GALNT3蛋白水平。从所选细胞系中收集裂解物，用SDS-PAGE进行分离，并用Western blot进行检测。间充质样细胞标记为粗体。突出显示的条带的GALNT3和肌动蛋白的预期分子量分别为73 kD和42 kD。（C） 通过Western blot测定TGFβ处理和未处理细胞中MRC2蛋白水平。细胞株在细胞裂解前暴露于5 ng/mL TGFβ或未经处理的血清饥饿状态下72小时。突出显示的条带的预期分子量为MRC2的～167 kD和肌动蛋白的42 kD。

诱导-EMT模型和细胞系小组之间的另一个共同主题是甘露糖受体家族凝集素样受体的改变。该家族的四个成员MRC1、MRC2、LY75和CD302是具有多个碳水化合物结合域的跨膜内吞受体。在诱导的EMT模型中，MRC2上调，CD302下调，LY75在细胞系中下调。这两个EMT模型还共享了N-乙酰氨基半乳糖（GalNAc）转移酶家族成员的改变，该家族催化在粘液型O-连接的糖基化中GalNAc最初添加到丝氨酸或苏氨酸残基。GALNT2和GALNT10在诱导的EMT中上调，GALNT3是细胞系中上皮样和间充质样细胞的最强区分因子，间充质细胞的表达降至可测量水平以下(图4).

基因表达差异的验证

利用RT-PCR和Western Blot证实了某些基因在间质样和上皮样细胞系中的差异表达(图5). RT-PCR和微阵列结果之间的相关性基本一致，GALNT3的相关性最强，为0.912；ZEB1，0.774；GMPPA，0.735；和MAN2B2，0.713；ST3GAL6的相关性较弱，为0.509；和PMM1，0.415。蛋白质水平的变化通过GALNT3和MRC2的Western Blot证实。GALNT3在上皮细胞系BXPC-3、HPAF II和SU86.86中检测为阳性，而在间质样细胞系MiaPaCa-2、MPanc-96和Panc-1中未检测到。MRC2仅在A549、Panc-1和MiaPaCa-2中检测到，并且在这三种细胞系中用TGFβ处理后显示出水平升高。在存在或不存在TGFβ的情况下，BXPC-3或HS766t未检测到MRC2水平。

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Alcian Blue试验用于比较选定胰腺癌细胞株的整体硫酸化水平。

对来自所示细胞系的裂解物进行阿尔西安蓝测定，并通过测量染料在600nm处的吸光度来量化每个细胞系的总硫酸化。对间充质样细胞系（粗体）和上皮细胞系之间，以及TGFβ治疗72小时后的Panc-1和未治疗的Panc-1之间的吸光度进行了学生t检验（结果由p值给出）。肝素用作硫酸化GAG对照。（A） 硫酸化聚糖沉淀和随后的再悬浮后，阿尔西安蓝染料保留的照片。第二列代表间质样细胞系，并保留更多染色，表明细胞裂解液中存在较高水平的硫酸化聚糖。（B） 显示细胞系在600 nm处吸光度差异的条形图。间充质样细胞系（粗体）的吸光度显著高于其余上皮细胞系（p=1.29×10−5). （C） 显示Panc-1在暴露于5 ng/mL TGFβ或未经血清饥饿处理72小时后600 nm处吸光度差异的条形图。TGFβ治疗后的Panc-1的吸光度水平显著高于未治疗的Panc-1（p=0.027）。

讨论

在胰腺癌中检测或控制EMT的能力可能会导致治疗策略的改进。与EMT相关的分子改变的表征是揭示驱动这一过程的一些机制的第一步。鉴于已知聚糖参与其他细胞分化过程，定义与EMT相关的聚糖变化对理解这一过程可能特别重要。全基因组表达谱结合587个糖基化相关基因的目标基因列表是研究该生物系统中糖基化的实用方法。此外，三种体外模型系统的使用被证明有助于检查上皮和间充质状态的互补方面，即状态之间的主动转换、最终分化状态和迁移行为。

糖基化相关基因的变化频率支持了糖基化改变在EMT中的重要性(表1). 糖相关基因的改变比两个模型系统（TGFβ诱导的EMT和细胞系面板）中预测的更频繁，但在细胞迁移模型中没有。聚糖重塑是细胞分化过程的一个主要方面，这一发现将与先前的工作一致，表明聚糖改变在干细胞生物学和免疫激活中的重要性[27],[31],[37]细胞迁移过程中缺乏主要的糖原变化，这可能表明迁移的细胞实际上并没有分化，而只是改变了迁移机制的表达。因此，聚糖的变化可能作为细胞类型和状态的指标而不是作为迁移的功能因素更为重要。然而，值得注意的是，细胞系模型中糖基转移酶活性的改变对迁移能力有不同的影响在体外 [38],[39],[40]在Panc-1和MiaPaCa-2的情况下，它们可能已经拥有增强迁移能力所必需的聚糖机器；可能没有必要进行进一步的转换。这一研究领域也仅限于两种非常特异的胰腺癌细胞系在体外条件。未来使用更多细胞系和不同方法分离迁移细胞和静止细胞的分析可能会产生新的发现。

诱导EMT模型和细胞系小组共享的功能主题为糖基化在EMT中的作用提供了一些见解。蛋白多糖和硫酸化酶的变化表明，在EMT中控制GAG硫酸化的重要性。这一发现与之前的研究一致，该研究表明，云芝等基质成分发生了改变[41]GAG硫酸化的改变[42]与癌症相关，尤其是侵袭性癌症。云芝的致癌功能可能通过调节生长因子活性以及与免疫细胞和基质细胞的相互作用发挥作用[43]，功能可以通过改变硫酸化进行修改。SPOCK1可能通过类似的机制发挥作用，但研究较少。SULF2在两个系统中都被强烈上调，并能从某些GAG链中清除硫酸盐，也与肺癌的发生有关[44]以及胰腺癌细胞的致瘤性[45]SULF2的致癌功能似乎通过激活Wnt信号或从细胞外基质释放生长因子发挥作用，这也可能具有促血管生成作用。这些功能与癌症EMT的相关性表明，接受EMT的癌细胞利用细胞外空间的修复来达到高度侵袭性。如果是这样，干扰GAG的硫酸化和脱硫，或修饰硫酸化诱导的相互作用，是有吸引力的干预目标，特别是因为这些分子位于细胞外空间。

使用Alcian Blue染色评估总的硫酸化水平显示，间充质样细胞系的总硫酸化增加，以及TGFβ处理后Panc-1硫酸化增加。这种影响可能是由于GAG承载蛋白（如SPOCK1或VCAN）的增加，如诱导的EMT和间质样细胞系面板中所示。另一种可能是每个GAG链上的硫酸盐增加，这可能是由硫转移酶水平增加引起的。我们观察到诱导EMT模型中CHST3和CHST11水平较高，间质样细胞板中CHST7和NDST2水平较高。这些预硫化活动必须大于增加的硫酸亚硫酸盐硫酸酯酶的影响，该酶可以去除硫酸盐。因为SULF2对肝素和硫酸肝素具有特异性[46]CHST3、CHST11和CHST7作用于硫酸软骨素，一个有趣的可能性是硫酸化从硫酸乙酰肝素转变为硫酸软骨素。进一步的研究将解决硫酸化水平增加的性质以及这些变化的生物效应。

甘露糖受体家族成员的改变可能会影响细胞与修复后的局部环境的相互作用。甘露糖受体家族成员对各种基质成分如胶原蛋白和硫酸化具有特异性[47]根据质谱分析（数据未显示），A549和Panc-1培养基中的胶原蛋白均上调，如上文所述，多种其他基质成分被癌细胞改变。考虑到这些因素，甘露糖受体（如MRC2）的调节改变可能是调节细胞对新基质环境的反应或调节自分泌循环的一种手段。此外，MRC2参与趋化和侵袭[48]并且对于癌细胞获得这些特性可能很重要。

UDP-N-乙酰-d-半乳糖胺：多肽UDP-N-乙酰半乳糖氨基转移酶（GALNTs）通过将GalNAc连接到靶蛋白上的丝氨酸或苏氨酸上，启动O-糖基化。目前在GALNT家族中有15种同工酶在底物特异性方面存在差异[20]许多GALNT在人体组织中普遍表达，但有几个表现出组织表达受限[49],[50]这种多样性允许根据细胞来源和细胞状态改变各种蛋白质的糖类[51]。通过调节GALNTs，尤其是GALNT3，改变O-聚糖的起始，也可能通过改变目标蛋白的糖型，从而改变与细胞环境的相互作用，影响癌细胞的行为。值得注意的是，GALNT3的表达仅限于正常组织中的腺上皮细胞[49]和腺癌[52]与我们在这里的观察结果一致，GALNT3的丢失以前与间充质表型相关[51]以及癌症预后较差[52],[53],[54]GALNT3作用于特定蛋白质的鉴定将是未来的研究目标。

模型系统之间常见的基因可能会引起进一步研究的特别兴趣。ST6GALNAC4的表达变化在所有胰腺细胞实验（不包括A549肺癌细胞系）之间共享。ST6GALNAC4对糖蛋白和糖脂上受体基序Neu5Ac-alpha-2,3-Gal-beta-1,3-GalNAc的N-乙酰氨基半乳糖（GalNAc）的6′碳上唾液酸（Neu5Ac）的加成进行催化，形成末端双唾液酸化聚糖结构[20]值得注意的是，功能相关基因ST3GAL2在细胞系板的间质样细胞中也上调。ST3GAL2催化α2,3键中Neu5Ac与受体基序Gal-beta-1,3-GalNAc中半乳糖的加成[20],[55]，可能形成ST6GALNAC4的受体基序。研究表明，癌相关聚糖唾液酸化增加，导致转移潜能增加[50],[56]和肿瘤生长[57]唾液酰基转移酶的诱导EMT模型中出现了一个意外的结果：ST8α-N-乙酰基-神经氨酸α-2,8-唾液酰基转移酶4（ST8SIA4）。这种酶是能够通过神经细胞粘附分子（NCAM）形成聚唾液酸（PSA）的几种家族成员之一，PSA是已知的神经细胞粘附调节剂[58]对PSA在胰腺癌中作用的研究表明，PSA-NCAM抑制E-cadherin介导的细胞间粘附，PSA的去除导致细胞聚集增加和迁移减少[59]ST8SIA4的丢失将有利于迁移的减少。然而，还应注意的是，在我们的研究中没有在转录水平上检测到NCAM（数据未显示）。

所有胰腺实验中的第二个基因表达变化是下调PIGM（磷脂酰肌醇聚糖锚生物合成，M类）。PIGM对糖基磷脂酰肌醇（GPI）膜锚的形成中的初始甘露糖基化进行催化。GPIs是一种糖脂，参与许多细胞表面蛋白的锚定依赖性栓系[60]由于启动子突变导致PIGM表达减少已被证明会导致严重的GPI锚定缺陷[61]由于基因下调导致PIGM水平降低也可能导致细胞表面GPI锚定蛋白的流行率降低。

这些对与间质样胰腺癌细胞的发育和维持相关的基因和糖基化模式的见解可以以多种方式应用于未来的研究。应将使用质谱表征聚糖结构的未来工作与这些基因表达结果进行比较，以拼接生物合成途径与EMT中最普遍的聚糖变化之间的联系。如果这些分子改变被证明对间质样癌细胞具有高度选择性，那么基于此信息的治疗策略可能会非常有效，尤其是针对参与癌症进展和耐药的细胞。在炎症、转移和病原体侵袭的关键点选择性调节糖基化或蛋白-聚糖相互作用的方法已经被研究[62],[63],[64],[65]这项研究的信息也可能有助于开发检测间质样癌细胞的生物标记物。我们之前的研究表明，由于癌症中蛋白质丰度和糖基化都会发生改变，因此与仅测量蛋白质丰度相比，测量特定蛋白质上的聚糖可以提高生物标记物的性能[66],[67]未来的研究将旨在确定酶在此作用的蛋白质，以便可以使用抗体-凝集素三明治阵列（ALSA）有效探测这些蛋白质的糖基化水平[66],[67]使用早期开发的高通量抗体阵列方法，我们可以快速表征各种糖类与临床状态之间的关联。

本研究初步探讨了癌症EMT中聚糖变化的性质，并支持聚糖在向间充质状态过渡和维持中的重要性这一概念。基质成分的改变、GAG的硫酸化、甘露糖受体、O-糖基化和特定唾液酸化结构是胰腺癌EMT的特征。控制这些修饰的特定基因可能是预防或逆转EMT的靶点，这些基因产生的聚糖结构，再加上发现它们的蛋白质，可以提供分子钩来特异检测间质样癌细胞。聚糖结构分析将提供关于这些基因活性的进一步细节。这些发现为未来研究检测和靶向特别具有侵袭性或耐药形式的胰腺癌细胞提供了具体线索。

材料和方法

细胞培养和RNA提取

转化生长因子β诱导的EMT和迁移模型中使用的细胞系购自美国型培养物收集中心（ATCC，Manassas，VA）。胰腺癌细胞系小组中使用的22种细胞系由Martin McMahan博士和Stephan Gysin博士（加利福尼亚大学旧金山分校）慷慨提供。所有细胞均按照ATCC推荐的每个细胞系的培养条件生长。对于诱导的EMT模型，将Panc-1和A549生长到70%的汇合处，在无血清条件下培养一天，并用含有5nM TGFβ（R&D系统）的新鲜培养基或普通培养基培养48小时。细胞在1×磷酸盐缓冲盐水中漂洗三次，然后添加TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）进行溶解，然后重复通过18-G针头并在室温下培养5分钟。将溶解液与氯仿强烈混合，并在4°C下在12000×G下旋转20分钟。将水层转移到异丙醇溶液中，剧烈混合，并在4°C下以12000×g离心30分钟。用75%乙醇清洗含RNA颗粒，干燥，并将其溶解在无RNase水中。使用分光光度计（生物光度计，Eppendorf，Westbury，NY）测定RNA的数量和质量，并将其储存在−20°C下，直到所有细胞系准备好进行cDNA合成和聚合酶链反应（PCR）。对于细胞系面板模型，在使用上述方案进行裂解和RNA提取之前，所有细胞在正常培养条件下生长到70%的融合。

如前所述进行径向迁移分析[68]如前所述，分离固定和迁移细胞亚群[36]简而言之，为了模拟迁移前沿（边缘）和增殖核心，使用细胞沉降歧管（CSM，Inc.，Phoenix，AZ）在胶原IV涂层的10孔载玻片上将5000个胰腺细胞接种为融合的圆形单层。接种16小时后，通过移除歧管开始迁移，并允许细胞径向扩散24小时。在倒置显微镜下（Axiovert 100，Zeiss，NY）使用P20移液管在四个独立的生物复制品中采集固定（核心）和迁移（边缘）细胞。根据制造商的方案（Mirvana Total RNA Kit，Ambion，Austin，TX），收集40个个体分散测定（4个10孔载玻片）并立即分离RNA。用裂解结合缓冲液分别裂解核心细胞和边缘细胞。使用NanoDrop 2000c（Thermo Scientific，Wilmington，DE）评估总RNA数量，使用生物分析仪RNA 6000 Nano LabChip Kit（Agilent Technologies，Palo Alto，CA）评估质量。

微阵列数据采集与分析

所有微阵列数据都符合MIAME标准，并保存在GEO数据库中。A549细胞系数据的登录号为GSE17708；GSE21654用于电池线路板；和GSE21566用于迁移单元模型。分别在密歇根大学和Van Andel研究所的Affymetrix人类基因组U133 Plus 2.0芯片上分析了诱导的EMT和细胞系面板模型。

使用Microsoft Excel和Xenobase分析所有模型系统的结果基因表达数据（26）。587个感兴趣的基因列表（参见表S1)除项目特定信息外，还使用功能糖组学联合会的信息进行组装。这些基因包括糖转移酶（199个基因）、糖蛋白（101个基因），凝集素（112个基因）和糖苷酶（62个基因）。核糖转运（35个基因）；核糖合成（23个基因）。这些基因中96.7%在Affymetrix人类基因组U133 Plus 2.0上有代表性，92.2%在4×44K的安捷伦全人类基因组微阵列试剂盒上有代表性。采用卡方检验确定该列表中的基因表达变化是否比所有其他变化更频繁。

为了分析PANC-1的TGFβ诱导的EMT，在每种条件的三次重复实验之间进行了配对、双尾t检验，p值小于0.05被认为是显著的。排除了两种情况下平均绝对信号水平均低于100的探头。TGFβ处理A549的分析使用0小时和72小时时间点之间转录水平的成对比率。对于22个细胞系的分析，采用了非配对双尾t检验，p值小于0.01被认为是显著的。对于迁移性Panc-1和迁移性MiaPaCa-2细胞系的分析，排除了从边缘到核心表达变化小于±25%的探针，并排除了具有多个探针分别显示阳性和阴性变化的基因。其余探针的结果是每个基因的平均值。本出版物中讨论的数据保存在NCBI的基因表达总览中，可通过GEO系列表达号访问：GSE17708和GSE23952（分别为A549和Panc-1 TGFβ治疗试验）、GSE21654（22胰腺癌细胞系小组）、GSE11566（放射迁移试验）。

RT-PCR验证基因表达

第一链cDNA模板的合成严格遵循了SuperScript II逆转录酶的使用协议（Invitrogen，Carlsbad，CA）。cDNA在RT下以20µl的反应合成。第一步使用5µg RNA、随机六聚体、dNTP混合物和ddH2O至最终体积12.5µl，在65°C下培养5分钟，然后在冰上快速冷冻。冷冻后，添加5×第一链缓冲液、核糖核酸酶抑制剂、DTT和SuperScript II RT，并在RT下培养10分钟。初始培养后，在42°C下进行反应1小时，然后在70°C下灭活10分钟。

与Affymetrix U133 Plus 2.0芯片中所选基因相对应的基因特异性引物是使用MacVector（MacVector Inc.，Cary，NC）设计并合成的（Integrated DNA Technologies，Inc.，Coralville，IA）。使用了以下序列。GALNT3（加仑3）：EX-S公司：5′-ACAGTGTGCTCTATTCTCACCTGC-3′.EX-AS公司：5′-TTACGACAGCCGTGTAGTTCTCAG-3′.ST3GAL2：EX-S公司：5′-CCTGCTGGTTCATCATGTCC-3′.EX-AS：5′-GCACCTCATTGTGGTGTGAC-3′.ST3GAL6：EX-S公司：5′-cagcttttgccctctgctgag-3′.EX-AS公司：5′-TCTCCAACTTCTTTCATGTCC-3′.PMM1：EX-S公司：5′-CAAGCAGACACACTCCAGAACACC-3′.EX-AS：5′-AGAGACCTCAGCCCTTGCCAG-3′.MAN2B2：前妻：5′-CCTAAAACAGCAGGAGTCATC-3′.EX-AS：5′-TGTCGTTCAGCGTGGAGGTTGTAG-3′.GMPPA：EX-S公司：5′-TCCTTGGCACTACCTGAACAG-3′.EX-AS公司：5′-GGGCTGAAAACACATCCTGCTC-3′.ZEB1：EX-S公司：5′-AATCCACAAGAGTCCAACCA-3′.EX-AS公司：5′-CATTCCATTTTCTGTCTTCCGC-3′根据制造商的报告，这些引物的Tm范围为54.5至61.5°C。

每个50µl反应管包含0.5µg cDNA模板、4µM引物和Qiagen试剂1×PCR缓冲液、1×Q溶液、0.2 mM dNTP和HotStar Taq DNA聚合酶。放大程序包括一轮95°C的激活15分钟，然后进行25次94°C的循环，保持50秒，55°C保持1分钟，72°C保持50秒。让反应在72°C下持续10分钟，并在4°C下保持。PCR产物使用1.5%琼脂糖凝胶在1×Tris碱、乙酸和乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液（TAE）中进行分析。使用软件程序Chemidoc和Quantity One（Bio-Rad，Hercules，CA）对凝胶条带进行成像和分析。

西方印记

细胞在含有蛋白酶抑制剂（Roche）的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中进行裂解。将溶液离心以除去颗粒。然后使用microBCA分析（Thermo Scientific）对含蛋白上清液进行定量，并在加载到4-12%聚丙烯酰胺凝胶（标准，BIO-RAD）之前调整到等效浓度。凝胶中的蛋白质电泳转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，该膜在5%的牛奶中封闭，并在4°C下与一级抗体孵育过夜。用含0.5%吐温的Tris-Buffered Saline洗涤20次，每次10分钟后，用辣根过氧化物酶（HRP）结合二抗孵育膜1小时，然后再次洗涤。将膜与底物（SuperSignal West Pico，Thermo Scientific）孵育5分钟，并使用BIO-RAD ChemiDOC XRS进行可视化。一级抗体靶向E-钙粘蛋白（研发系统，mAb 1838）、波形蛋白（研发系统，AF2105）、MRC2（Abcam ab70132）和肌动蛋白（1-19）（圣克鲁斯，SC-1616）。GALNT3抗体由Henrik Clausen博士的实验室生产并慷慨捐赠[51],[69].

硫酸化氨基多糖测定

阿尔西安蓝试验严格遵循了先前制定的方案[70]有一些小改动。细胞在含有蛋白酶抑制剂（Roche）的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中进行裂解。将溶液离心以除去颗粒。然后，使用microBCA分析（Thermo Scientific）对含蛋白上清液进行定量，并在分析之前调整至等效浓度。以下所有试剂均购自Sigma，样品最初在3.3 M尿素中变性，0.1%H2SO公司4和0.25%辛基苯氧基聚醚氧基乙醇（Triton X-114）在室温下保持30分钟。阿尔西安蓝染色液（0.07%阿尔西安兰/0.1%H2SO公司4/然后添加0.25%Triton X-114），得到0.05%Alcian Blue、0.56 M尿素、0.1%H的最终浓度2SO公司4和0.25%Triton®声波风廓线仪X-114。然后将样品在4°C下放置过夜，以使阿尔西安蓝结合物种沉淀。H的浓度2SO公司4使用时pH值应在1.5到2.0之间，以允许大多数带负电荷的物种成为硫酸盐残留物，以便与阳离子染料进行特定结合。第二天，将样品在12000×g下离心15分钟，并丢弃含有未结合染料的上清液。将含有染料结合分子的颗粒重新悬浮在1 mL 40%二甲基亚砜（DMSO）和0.07M MgCl的溶液中2然后在12000×g下离心15分钟，再次丢弃上清液。将剩余的颗粒重新溶解在500µL的5M尿素、33%正丙醇和0.25%Triton X-114溶液中，以测量吸光度。使用生物光度计（Eppendorf）对600 nm处的吸光度进行三次测量。使用5M尿素、33%正丙醇和0.25%Triton X-114的溶液作为空白。肝素（H3393，Sigma）用作阳性对照。在Microsoft Excel中进行统计分析和绘图。

支持信息

表S1

除了项目特定信息外，还使用功能糖组学联合会的信息汇编了587个感兴趣的基因列表。这些基因包括糖转移酶（199个基因）、糖蛋白（101个基因），凝集素（112个基因）和糖苷酶（62个基因）。核糖转运（35个基因）；核糖合成（23个基因）。

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图S1

TGFβ诱导PANC-1的EMT。PANC1细胞在无血清培养基中培养24小时，然后用（A）对照培养基或（B）5 nM TGFβ处理。72小时后以10倍放大率拍摄显微照片。

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图S2

胰腺癌细胞系中EMT相关基因的表达谱。细胞系根据形态特征进行分组。每个基因的表达水平均为对数转换（以10为基数），中位数以行为中心。每个方块的值对应于顶部的颜色栏。ZEB1基因的水平与形态学最明显相关。

（0.47 MB畅通节能法）

致谢

我们感谢吴一美博士在数据解释和细胞培养实验方面的协助。我们还感谢Martin McMahan博士和Stephan Gysin博士（加州大学旧金山分校）提供了本研究中使用的人类胰腺癌细胞系。

脚注

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

基金：这项工作得到了国家癌症研究所的支持(网址：www.cancer.gov)（R03CA139225至B.H.，美国国立卫生研究院[R01 CA132571至V.K.，以及美国国立卫生研究院R01 CA130940 NT），美国癌症协会(网址：www.cancer.org)（CSM-116801至V.K.），国家神经疾病和中风研究所(网址：www.ninds.nih.gov)（NIH R01 NS042262转M.B.）和范安洛研究所(网址：www.vai.org). 资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

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文章来自PLOS ONE系列由以下人员提供多环芳烃