VEGFR1阳性造血骨髓祖细胞启动转移前生态位

摘要

骨髓源性细胞（BMDC）有助于恶性转化¹、肿瘤血管化^2,三和肿瘤细胞迁移⁴以前，我们发现了表达VEGFR1的造血祖细胞（HPCs），这些细胞位于骨髓的特定生态位内。在血管生成转换过程中，这些细胞与表达VEGFR2（也称为Flk1）的骨髓源内皮祖细胞一起增殖并向血流移动，并促进特定原发性肿瘤的血管化和生长^2,5这些骨髓单核细胞VEGFR1⁺细胞定位于血管周围，从而稳定肿瘤新生血管²这些和其他肿瘤相关细胞促进原发性肿瘤新生血管生成和生长，但它们对转移的确切贡献尚不清楚^6–8因此，本研究的目的是确定VEGFR1的作用⁺HPC在转移的时间和功能生成中的作用。

骨髓间充质干细胞在肿瘤细胞之前定植转移前部位

我们分析了β-半乳糖苷酶阳性（β-gal）的命运⁺)绿色荧光蛋白阳性（GFP⁺)小鼠皮内注射原发性肿瘤后的骨髓间充质干细胞。动物接种Lewis肺癌（LLC）细胞（转移到肺部，偶尔转移到肝脏）或B16黑色素瘤细胞（具有更广泛的转移潜能）。照射后，但在肿瘤植入前，我们观察到最小的β-半乳糖⁺骨髓间充质干细胞（平均值±s.e.m.，细胞β-gal的0.01%±0.01⁺每×100目标场）或GFP⁺肺部的BMDC。(图1a、b，左侧面板）。在肿瘤植入后第14天，但在肿瘤细胞到达之前，β-半乳糖的外渗和聚集形成⁺BMDC（3.2%±1.2，P（P）<0.05（学生）t吨-测试）或GFP⁺在终末细支气管和远端肺泡附近检测到BMDC，这两个部位都是未来肿瘤转移的常见部位(图1a、b，左侧中间拼接和镶嵌）。第16天，建立β-gal⁺细胞簇决定了未来转移病灶的轮廓(图1a，右中面板）。在第18天可以看到单个DsRed标记的肿瘤细胞，与预先存在的BMDC簇相关(图1b，右中面板）并在第23天进展为微转移(图1a、b，右侧面板）。β-加仑⁺骨髓间充质干细胞维持在肿瘤转移灶内(图1a，右侧面板和插图）。

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图1

骨髓源性细胞形成转移前生态位

一，β-加仑⁺照射后和LLC细胞植入前，肺中很少观察到骨髓细胞（左图）(n个= 6). 第14天，β-gal⁺骨髓衍生簇出现在肺实质中（左中面板和箭头区域放大插图；n个=25），在第23天与微转移相关（右图，箭头），在总转移中相关（右表，插图；n个= 12). 图中还显示了一簇位于终末细支气管和支气管静脉之间的相关基质，这是一个常见的转移部位（右中幅）。B、 终末细支气管；五、 支气管静脉。b条、GFP⁺照射后和DsRed标记的B16细胞植入前肺部的骨髓（左面板；n个= 6). 第14天，GFP⁺（绿色）BMDC没有DsRed⁺（红色）肿瘤细胞（左中面板和插图；n个= 12). 从第18天开始，几个DsRed⁺B16细胞粘附于GFP⁺骨髓簇（右中面板），第23天，DsRed⁺肿瘤细胞在簇状部位增殖（右幅；n个= 8). DAPI染色（蓝色）显示细胞核。c（c），显示骨髓衍生GFP流式细胞术数据的图表⁺BMDC和DsRed⁺肺中的B16细胞，以及第14天（左侧面板）和第18天（右侧面板）的两个流程图(n个= 30; 错误条显示s.e.m.）。d日，绿色荧光粉⁺用B16条件培养基动员的BMDCs，然后与单独接受培养基的动物（左图；P（P）< 0.01). 插图显示四天后肿瘤细胞成簇增殖（右侧插图；n个= 6).e（电子），皮内LLC或B16肿瘤动物中每×100目标场的簇数(n个= 12). 左上方面板上的比例尺应用于面板一（左、左中、右中，80µm；左中插图，8µm，右中插图，20µm。右插图，47µm），b条（左中，左中，80µm；左中插图，8µm，右中，40µm）和d日（40µm；右侧插图，20µm）。

为了进一步确定肿瘤细胞到达的时间，对肺部进行了流式细胞术研究。第8天之前，最低GFP⁺在该组织中观察到BMDC；然而，从第12天开始，骨髓间充质干细胞开始迁移到肺部(图1c图和左侧流式细胞仪面板）。这些GFP⁺细胞数量增加，并在第18天与DsRed标记的肿瘤细胞结合(图1c、图表和右流程图）。流式细胞术或显微镜在第16天之前未检测到肿瘤细胞，并且随着时间的推移，肿瘤细胞的数量不断增加(图1b，右侧面板；图1c;补充图1a). 95%以上的肿瘤细胞与GFP共同聚集⁺骨髓间充质干细胞（97%±1.1；图1b，右侧面板）。

虽然使用这些方法可能无法检测到一些肿瘤细胞，但在小鼠中进行的进一步实验表明，仅使用B16-甲基调节培养基（MCM）就可以动员能够形成转移前生态位的骨髓基质细胞。我们通过静脉将DsRed标记的B16肿瘤细胞引入预先建立GFP的小鼠体内⁺MCM激发后肺部BMDC簇(图1d，右侧面板）或单独介质(图1d，左侧面板）。与单独培养基相比，注射肿瘤后一天，MCM增加了肺部肿瘤细胞的数量（每节肺组织141.3±10.2个肿瘤细胞，P（P）< 0.01). 肿瘤注射4天后，MCM增加了肺结节的频率和大小（207±5.6对14±1.7，P（P）< 0.01;图1d，右侧面板插图）。GFP与DsRed标记的肿瘤细胞共扩增⁺BMDC簇在两个时间点均>93%，表明BMDC有助于肿瘤细胞粘附和增殖。因此，原发性肿瘤提供的因子诱导BMDC进入血液并转移到器官特异性转移前部位，并且这种转移先于肿瘤细胞的到来。

BMDC簇的位点具有肿瘤类型特异性

我们检查了肿瘤细胞的类型是否决定了BMDC在特定转移前部位的分布。LLC细胞的真皮内注射导致BMDC簇的形成，仅限于肺（每×100目标场47.5±2.6簇）和肝（10.8±1.1），其他器官中没有簇(图1e，左侧面板）。相反，B16黑色素瘤细胞在多个组织中诱导BMDC簇的形成，如肺（103.8±6.9）、肝（41.8±2.4）、睾丸（36.6±3.1）、脾（25±3.2）和肾（20.6±1.8），这些都是该肿瘤的常见转移部位(图1e，右侧面板）。此外，黑色素瘤细胞与其更具侵袭性的转移性质相一致，比LLC细胞诱导更多的簇集(P（P）< 0.01).

招募的BMDC由造血祖细胞组成

我们对合并的BMDC簇的细胞和分子组成进行了表征。由任一肿瘤类型表达VEGFR1诱导的簇(图2a，右侧面板）和GFP⁺BMDC簇共表达VEGFR1(图2b，左侧面板），与单独照射后肺部中的VEGFR1相比(图2a，左侧面板和插图）。进一步的特征分析显示VEGFR1的亚群⁺骨髓间充质干细胞共表达干/祖细胞抗原CD133(图2b，右侧面板），CD34(补充图1b和补充表)和CD117（也称为c-Kit；图2c)表明这些细胞可能包含表型标记的VEGFR1⁺HPC和前体细胞。原发性肿瘤植入后，CD117阳性祖细胞在流式细胞术检测GFP标记的肿瘤细胞之前到达肺部(补充图1c)，概述了上述BMDC的招募。存在一定程度的成熟异质性，骨髓单核细胞标记CD11b存在于某些合并细胞上（数据未显示）。早期VEGFR1⁺骨髓簇缺乏VEGFR2和CD31的表达（也称为PECAM1；补充图1d、左侧和左侧中间面板）。VEGFR2阳性循环内皮祖细胞迁移至完全形成的BMDC簇(补充图1d，右侧面板），与肿瘤细胞的到来相吻合(补充图1e，图）。因此骨髓源性VEGFR1⁺HPC启动并维持转移前生态位。

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图2

转移前簇由VEGFR1组成⁺造血祖细胞

一，肿瘤植入前照射肺中的VEGFR1染色（左图和插图；n个=10）和LLC细胞植入后14天，显示肺中的簇（右图，箭头；n个=18,3.9±0.2%细胞，VEGFR1染色每×100目标场，P（P）< 0.05).b条,c（c），第14天LLC肿瘤动物肺部的双重免疫荧光。b条，VEGFR1⁺（红色）和GFP⁺（绿色）骨髓细胞（左侧面板），VEGFR1⁺（红色）和CD133⁺（绿色）（右侧面板）。c（c），VEGFR1⁺（红色）和CD117⁺（绿色）。d日，VEGFR1⁺出生第40天和肿瘤发生前c-Myc转基因淋巴结中的簇（中间面板和插图显示VEGFR1⁺细胞（红色）），与未转基因的野生型窝友淋巴结（左侧面板）和120天c-Myc转基因淋巴结淋巴瘤（右侧面板）进行比较。在右侧面板的插图中，箭头指示VEGFR1⁺簇状（红色）被淋巴瘤包围（绿色）(n个= 6). 右下角的比例尺应用于面板一（80µm；左侧插图，40µm），b条（20微米），c（c）（20µm）和d日（80µm；插图，8µm）。

自发性肿瘤模型中出现BMDC簇

我们将这些结果与使用c-Myc转基因小鼠的自发肿瘤模型中的结果进行了比较。在生命的第40天，显著的VEGFR1⁺淋巴瘤发病前，这些动物的淋巴结中只检测到簇（145.1±16.4簇/×100客观视野；图2d，中间面板和插图），在野生型同窝雌鼠中没有观察到集群（0.4±0.3，P（P）< 0.001;图2d，左侧面板）。120天后，VEGFR1⁺在已建立的淋巴瘤中，集群持续存在（c-Myc小鼠与室友之间为67.8±9.5对0.7±0.5，P（P）< 0.001;图2d，右侧面板和插图）。环绕VEGFR1的淋巴瘤细胞⁺HPC不表达VEGFR1(图2d，右侧面板插图）。

BMDC簇被招募到转移前人类组织

验证显示VEGFR1肿瘤特异性形成的小鼠数据⁺细胞簇，我们分析了恶性肿瘤患者的人体组织。血管内皮生长因子受体1⁺在原发性肿瘤和转移性组织中都观察到集群(图3，显示腋窝淋巴结中的乳腺癌、肺癌和食道癌）。在肿瘤扩散之前，常见转移部位的细胞簇增多，表明该组织有可能成为未来的转移部位(图3显示腋窝淋巴结（21±5簇/×100目标视野）、肺（19±4）和胃食管交界处（25±4））。在无恶性肿瘤的患者中，淋巴结和肺组织未显示VEGFR1⁺集群(图3b、d，插图）。血管内皮生长因子受体1⁺细胞簇表达造血祖细胞标记c-Kit(图3e、f，插图）。

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图3

VEGFR1在转移前人类组织中的表达

a–f、乳腺癌患者恶性和非恶性组织中VEGFR1染色的细胞簇(n个=15），肺(n个=15）和胃肠道(n个=3）癌症。淋巴结有乳腺癌转移的证据(一，红色箭头表示肿瘤）和同一患者无恶性肿瘤的淋巴结(b条). 原发性肺腺癌(c（c）)和邻近的“正常”肺没有肿瘤(d日，红色箭头表示VEGFR1⁺单元格）。无VEGFR1⁺淋巴结内可见簇状物(b条，插图；n个=6）和肺组织(d日，插图；n个=3）来自非癌症患者。图示为胃食管交界处的原发性腺鳞癌(e（电子）)和一个无癌的肝淋巴结(（f）). 插入（英寸）e（电子）,（f），显示VEGFR1（红色）和c-Kit（绿色）的共同免疫荧光。右下角的比例尺适用于所有面板（40µm；插图，40µm.）。

VEGFR1的功能作用⁺骨髓间充质干细胞在指导转移中的作用

我们评估了纯化的VEGFR1的潜力⁺骨髓细胞通过选择性地将这些祖细胞移植到受辐射的小鼠中来启动转移前簇。LLC肿瘤细胞植入后第24天，接受野生型骨髓的对照小鼠出现明显的肺转移并建立血管(图4a，左侧面板和插图）。然而，用纯化的VEGFR1移植小鼠⁺细胞在整个肺部形成大量微转移（25±9个微转移/×100靶区；图4a，中间面板）具有异常血管(图4a，中间面板插图）。相反，骨髓中VEGFR1的缺失⁺细胞未能产生转移前簇(图4a，右侧面板；P（P）方差分析（ANOVA）显示<0.01）。这些结果表明VEGFR1⁺启动转移前簇的HPC可以吸引肿瘤细胞。

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图4

抑制骨髓细胞归巢防止转移

一，VEGFR1⁺-所选骨髓（R1-pos）允许微转移（红色箭头，中图），但可防止野生型（左图）在LLC植入24天后出现血管充足的大转移。插图显示CD31（内皮标记物）表达。骨髓VEGFR1缺失⁺细胞（非R1）消除簇和转移（右侧面板）(P（P）方差分析结果<0.01）。该表显示了每个×100目标场的簇和微转移数量*表示转移瘤充满肺部。（R1-pos，n个= 4; 非R1，n个= 4; 野生型，n个= 6; 非R1加野生型，n个= 4).b条，在LLC肿瘤小鼠中使用VEGFR1（抗R1）和VEGFR2（抗R2）抗体治疗可防止肿瘤聚集和转移(P（P）方差分析结果<0.01；对于所有组，n个= 5). 野生型肺中的箭头表示LLC的大转移。反R2中的箭头显示一个簇，插图显示簇内的微转移。T、 肿瘤细胞。该表显示了每×100物镜视野中肺中集群和LLC微转移的数量*表明转移充满了组织。右下角的比例尺应用于面板一（20µm；野生型嵌入，26µm，R1-pos嵌入，32µm）和b条（40µm；抗R2嵌入，20µm）。

解决VEGFR1是否中断⁺细胞簇的形成可以阻断肿瘤的转移，接种LLC或B16肿瘤细胞的小鼠用抗VEGFR1和/或VEGFR2的单克隆抗体治疗。这种方法允许选择性靶向BMDC，因为肿瘤细胞不表达VEGFR1或VEGFR2。到第24天，肺中LLC肿瘤未经治疗的小鼠出现广泛转移(图4b，左侧面板）或B16脾脏肿瘤(补充图2，左侧面板和插图）。抗VEGFR1抗体治疗消除了起始簇并完全阻止了转移(图4b，左中面板；补充图3;P（P）<0.01（方差分析），而抗VEGFR2抗体不能阻止VEGFR1的形成⁺集群，但转移进展有限（15±11个微转移/×100靶区；图4b，右中面板和插图；补充图3). 这两种抗体结合在一起，在某种程度上阻断了簇形成，类似于抗VEGFR1治疗；然而，我们确实在一只动物的肺部观察到了一个孤立的LLC病变(补充图3b，插图）。总之，这些结果表明靶向VEGFR1⁺细胞簇可以阻止肿瘤细胞的粘附、增殖和转移扩散。

VLA-4、MMP9和Id3介导转移前生态位

我们研究了迁移HPC通过与微环境的相互作用形成允许的转移前生态位的细胞和分子机制。VLA-4（整合素α）的相互作用₄β₁)纤维连接蛋白及其配体对骨髓内造血细胞的迁移至关重要^9,10和循环白细胞^4,11。我们评估了VEGFR1是否⁺细胞表达整合素，这可能促进这种细胞类型与转移前生态位的相互作用。我们发现VEGFR1⁺转移前簇的HPC表达VLA-4(图5a插图显示与VEGFR1共表达），表明VLA-4允许形成转移前生态位的BMDC粘附。在团簇形成之后，α₄β₇和α₆β₄整合素在转移灶内显著表达（数据未显示）。由造血细胞产生的包括基质金属蛋白酶9（MMP9）在内的蛋白酶可以分解基底膜，从而通过释放可溶性Kit配体和VEGF-A来支持新引入的表达c-Kit的细胞，从而改变局部微环境^12,13此外，金属蛋白酶的表达可以通过α₄β₁纤维连接蛋白结合后的信号传递^14,15MMP9在转移前簇中表达，MMP9表达上调可能是VEGFR1整合素结合和激活的结果⁺高性能混凝土(图5b). 这些发现进一步证实了VEGFR1介导的MMP9诱导肺转移⁷.

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图5

VLA-4/纤维连接蛋白途径介导簇形成

a–c在肿瘤植入14天后，野生型小鼠形成表达VLA-4（插图，VEGFR1（红色）和VLA-4，MMP9和Id3（插图，血管内皮生长因子R1（绿色）和Id3）的簇。d日，给予VEGFR1的LLC肿瘤Id3敲除（KO）小鼠的肺组织⁺GFP公司⁺BMDC(P（P）方差分析结果<0.01；n个= 6). 绿色箭头显示上部插图中的区域。红色箭头（下插图）显示GFP的转移部位⁺血管内皮生长因子受体1⁺细胞。e（电子），野生型肺的基线纤维连接蛋白表达(n个=6）（左侧面板）。转移前肺的支气管周围区域在第三天基质纤维连接蛋白增加（中图，箭头），在第14天最大表达（右图）。插图中，PDGRFα的表达表明常驻成纤维细胞分泌纤维连接蛋白。（f）定量RT-PCR显示与野生型相比，LLC肿瘤小鼠肺部纤维连接蛋白表达增加(*P（P）方差分析<0.05；n个=6），B16黑色素瘤动物肺部的早期趋势相似。右上角的比例尺应用于面板一,b条,c（c）（40µm；插图，8µm），d日（80µm；右上插图，20µm，右下插图，80µm）和e（电子）（40µm；插图，20µm）。

我们之前的研究表明，上调Id基因表达对于动员有助于原发性肿瘤生长的祖细胞至关重要¹⁵.Id3在簇内也有表达(图5c，插图显示与VEGFR1共表达）。Id3可促进VEGFR1的动员⁺细胞转移到转移前的生态位。此外，特定整合素的表达受Id基因调控，可能与骨髓基质细胞和基质细胞的相互作用、运动和募集有关¹⁶.

为了证实这些蛋白在建立转移前生态位中的功能作用，我们要么抑制VLA-4的表达（使用抗整合素α4抗体），要么研究VEGFR1⁺MMP9和Id3基因敲除小鼠的细胞簇形成。在这些模型中，我们发现簇的形成减少了(补充图3a–c)肿瘤植入后三周转移扩散。我们还发现VEGFR1的动员受损⁺与野生型相比，Id3基因敲除小鼠的HPC进入循环（654对3283 VEGFR1⁺CD11b型⁺电池µl⁻¹)作为对肿瘤接种的反应(P（P）<0.01（按学生）t吨-测试；补充表). HPC动员减少可能解释了这些动物的转移表型减少^2,17.

正式检查野生型VEGFR1的潜力⁺修复Id3基因敲除小鼠转移缺陷的细胞⁺血管内皮生长因子受体1⁺将HPC静脉注射到Id3基因敲除的荷瘤小鼠体内。血管内皮生长因子受体1⁺在肿瘤植入后第21天，仅HPC重新建立了簇形成和微转移(图5d，和上部插图；补充图3c). 值得注意的是，LLC转移病灶与GFP相关⁺BMDC(图5d，下部插图）。这些发现进一步强调了VEGFR1的功能作用⁺骨髓间充质干细胞的聚集和转移。

纤维连接蛋白上调支持VLA-4粘附⁺BMDC

接下来，我们研究了组织特异性配体支持BMDC簇的粘附和形成的潜力。LLC肿瘤细胞植入后，但在VLA-4归巢之前⁺血管内皮生长因子受体1⁺BMDCs，从第3天起观察到纤维连接蛋白表达增加(图5e，中间面板；图5f)到第14天(图5e，右侧面板；图5f)与野生型肺中纤维连接蛋白表达的基线水平相比，在未来转移生态位附近(图5e，左侧面板；图5f). 此外，常驻成纤维细胞样基质细胞(图5e，左侧面板插图），其在原发肿瘤的反应下增殖(图5e，右面板插图），可能有助于纤维连接蛋白的局部沉积。黑色素瘤细胞也以与LLC细胞相似的方式诱导肺中纤连蛋白的表达(补充图3d). 此外，在暴露于MCM的多个组织中，如肠和输卵管中，纤连蛋白表达显著增加，这与B16细胞更具侵袭性的转移性质一致（纤连蛋白表达：P（P）<0.05第3-5天和P（P）输卵管中7-9天<0.001（方差分析）(图6a)和肠道(图6b)与使用LLC条件培养基（LCM）或野生型小鼠治疗的小鼠相比，使用MCM治疗。

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图6

LLC转移到非典型部位的重定向

一,b条，通过定量RT-PCR分析，发现输卵管中纤维连接蛋白表达增加(一)和肠道(b条)给予MCM的小鼠与野生型和LCM治疗的小鼠进行比较。对于输卵管*P（P）在第3-5天和**P（P）与野生型相比，第7-9天<0.001，肠道*P（P）通过方差分析，与野生型相比，第7-9天<0.001(n个= 6).c（c）条件培养基中VEGF和PlGF水平的ELISA检测（一式三份）(*P（P）与L-LCM相比<0.05**P（P）通过方差分析，与单独培养基相比，<0.01）。d日，Transwell迁移分析（一式三份）显示VEGFR1的迁移增强⁺连接LCM和MCM的电池(**P（P）<0.001（方差分析）。e（电子），MCM治疗将LLC的转移转移转移至B16黑色素瘤转移部位，如脾（左面板）、肾（左中间面板）、肠（右中间面板）和输卵管（右面板）。箭头表示转移边界的区域，如插图所示(n个= 6). T、 LLC肿瘤细胞。右下角的比例尺应用于面板e（电子）（200µm；插图，20µm）。

血管内皮生长因子受体1⁺细胞促进肿瘤粘附和生长

确认VEGFR1⁺我们分离并用红色荧光标记（PKH26-Gl）VEGFR1⁺恶性肿瘤小鼠的细胞(补充图4). 一小时内在体外与绿色荧光标记（PKH2-GL）B16或LLC细胞共同培养，HPC聚集、增殖（增加150%）并促进肿瘤细胞的附着和增殖。相反，预培养VEGFR1⁺含有抗VEGFR1或抗VLA-4抗体的HPC阻断了这种结合亲和力和扩张(补充图4a、中间和右侧面板）。使用transwell迁移分析，肿瘤细胞对骨髓源性VEGFR1的反应表现出增强的移动性⁺与不表达VEGFR1的细胞（11.2±0.4）和单独培养基（9.9±0.9，P（P）方差分析结果<0.001；补充图4b). SDF-1/CXCR4趋化因子轴参与骨髓中HPC的归巢和滞留¹⁸表达CXCR4的特定肿瘤细胞类型也可能以这种方式迁移，以响应局部趋化因子梯度^19–21在含有VEGFR1的完全形成的转移前簇内⁺细胞、成纤维细胞和纤维连接蛋白(图1a，左中面板），SDF-1（也称为CXCL12）高度表达(补充图4c). 我们还观察到CXCR4在B16黑色素瘤和LLC肿瘤中的表达(补充图4d). 这些数据表明，SDF-1可能为吸引CXCR4提供了一条途径⁺肿瘤细胞转移前的生态位。

肿瘤衍生的条件培养基决定了转移模式

为了阐明LLC和B16细胞器官特异性转移潜能的机制，我们收集了培养衍生的条件培养基。类似地，腹腔注射LCM可产生纤维连接蛋白表达（可能来自于常驻成纤维细胞），并形成BMDC簇，但比原代LLC细胞更快(补充图5a)与媒体相比(补充图5a，插图）。MCM在肝脏中刺激纤维连接蛋白表达的程度高于LCM(补充图5b). MCM在广泛器官中引起了成纤维细胞增殖增强（数据未显示）和纤维连接蛋白表达，并形成簇状结构，如肠道所示(图6a、b;补充图5b)与媒体相比(补充图5b，插图）。我们分析了LCM和MCM中生长因子的变化，以解释LLC和B16的不同转移潜能和特征(图6c). 我们发现两种条件培养基中的VEGF水平都很高，高于荷瘤小鼠的血浆(补充图5c). 然而，与LCM和LLC衍生血浆相比，我们在MCM和黑色素瘤衍生血浆中专门检测到较高水平的胎盘生长因子（PlGF），该因子通过VEGFR1单独发出信号(图6c,补充图5c). 此外，在低转移型LLC中，条件培养液（L-LCM）和血浆中VEGF和PlGF的水平均低于其侵袭性更强的对应物(图6c,补充图5c). 在跨孔分析中，LCM和MCM增强了VEGFR1的迁移⁺与其他生长因子条件（LCM 55%±0.4，MCM 68.1%±5，培养基10.8%±1.7，P（P）方差分析结果<0.001；图6d). 考虑到这些结果，我们质疑MCM中存在的细胞因子（如PlGF）是否能够将LLC转移转移到该肿瘤的非传统转移部位。在皮内LLC植入之前和之后每天给予MCM，导致LLC转移从肺转移到黑色素瘤中经常观察到的部位，包括肾、脾、肠和输卵管(图6e). 我们的结果表明，肿瘤特异性趋化因子和/或细胞因子与VEGFR1一起存在于条件培养基中⁺细胞簇是推动转移扩散的多维计划中的另一个决定因素。

决定特定肿瘤转移到预定转移位置的确切细胞和分子机制尚不清楚。许多肿瘤倾向于转移到特定器官。根据目前的教条，转移倾向被认为反映了肿瘤细胞本身固有的分子差异以及周围基质细胞（包括血管系统、结缔组织和免疫细胞）的潜在影响^22–26我们的结果引入了这样一个概念，即肿瘤转移是由一系列明确的事件启动的，这些事件依赖于通过VEGFR1的定点递送实现的细胞“书签”⁺细胞在靶器官内形成允许的生态位。我们的数据表明，肿瘤分泌的体液因子的差异会促进特定远处器官的转移扩散。在肿瘤植入后的几天内，靶器官内的常驻成纤维细胞和成纤维细胞样细胞会在特定位置上调纤维连接蛋白，这些器官是传统的转移部位，与特定的原发肿瘤相对应。同时，如前所述，HPC退出骨髓进入外周循环¹¹由于纤维连接蛋白VEGFR1的小生境特异性方向提示⁺表达VLA-4和Id3的HPC可以在CXCR4到来之前穿过已建立的内皮细胞，形成转移前生态位⁺肿瘤细胞与VEGFR2⁺内皮细胞。这些簇群中MMP9的产生改变了微环境，SDF-1的表达增强，形成了趋化因子梯度，从而吸引肿瘤细胞并将其并入小生境，从而形成完整的转移病灶。我们发现VEGFR1抗体的抑制或VEGFR2的缺失⁺骨髓中的细胞可以防止形成转移前的细胞簇，从而防止转移。此外，阻断VEGFR1或VLA-4可抑制造血细胞簇和肿瘤细胞的结合和建立。引入野生型VEGFR1恢复转移前生态位和转移⁺Id3基因敲除小鼠的细胞表明，Id3的表达诱导了必要元素的表达，包括MMP9、整合素和可能的趋化因子，为VEGFR1的归巢提供了路线图⁺建立转移前生态位所必需的细胞。

炎症细胞在帮助肿瘤粘附和侵袭远处器官中的作用已成为人们关注的焦点^27–30VEGFR1⁺本研究中发现的HPC通过提供必要的粘附分子、蛋白酶、趋化因子和生长条件，为肿瘤细胞植入创造有利的微环境，从而显示出炎症生理途径的共同特征^12,20,31然而，转移前的生态位是独特的，引入了VEGFR1所示的未分化状态⁺HPC人群。这是第一个直接证据，表明非肿瘤细胞群可以预示未来的转移部位。此外，在肿瘤扩散证据出现之前，对人体组织中造血簇的鉴定证明了靶向VEGFR1和VLA-4在临床环境中识别和预防转移的适用性。这一概念将对肿瘤分期产生巨大影响，并可能改变辅助化疗的前景。

方法

补充材料

致谢

脚注

工具书类