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实验临床癌症研究杂志。2010; 29(1): 124.
2010年9月10日在线发布。 数字对象标识：10.1186/1756-9966-29-124
预防性维修识别码：项目经理2944817
PMID：20831794

缺氧诱导卵巢内皮样上皮癌细胞增殖、凋亡和侵袭

朱鹏飞,1,2 炎夏宁,三 姚良庆,通讯作者1 莫晨,1和徐从建1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景

卵巢上皮癌是女性最恶性的癌症之一，因为大多数患者在确诊时都会发生转移。肿瘤细胞具有强大的血管生成能力或血管生成拟态，在其恶性表型中起主要作用。血管生成拟态可能导致血管生成靶向治疗策略的失败。在肿瘤的微环境下，缺氧是最常见的现象，因为它消耗大量的能量和氧气。在本研究中，从SKOV-3和ES-2卵巢癌细胞中获取缺氧诱导的内皮样细胞，以研究其生物学行为的变化。

方法

采用激光捕获显微切割技术从SKOV-3和ES-2细胞中获取内皮样细胞。采用MTT、FCM、Transwell小室和TRAP-ELISA方法检测内皮样细胞的生物学行为，包括增殖、细胞周期、凋亡、侵袭和端粒酶活性。HIF-1α是缺氧条件下行为改变的最重要因素。其他一些与生物学行为相关的基因也随着HIF-1α的变化而改变。为了阐明缺氧引起这些变化的潜在机制，通过实时PCR检测HIF-1α、CyclinD1、Flk-1、VEGF、p53和V-src等相关基因的表达。

结果

SKOV-3和ES-2细胞通过增殖、凋亡、分化和侵袭等途径对抗缺氧。结合其他研究，癌细胞分化越差，细胞耐缺氧能力越强，越有可能形成血管生成拟态。HIF-1α、HIF-1依赖性VEGF、Flk-1、Cyclin D1和HIF-1非依赖性p53的表达变化参与了这一过程。

结论

HIF-1α在缺氧引起的SKOV-3和ES-2细胞行为改变中起重要作用。与此同时，其他机制也参与了这一进程。

背景

上皮性卵巢癌（EOC）的死亡率约为50%，是妇科癌症死亡的主要原因[1,2]. 大多数患者在确诊时腹膜内发生转移。虽然肿瘤生长和转移的细胞和分子机制尚未完全了解，但已确定新血管的形成和生长对肿瘤的生存、生长和扩张至关重要[三]. 大量研究表明，血管生成越多，肿瘤的恶性程度越高。因此，减少卵巢癌生长和扩散的努力最近集中于血管生成，因为它们在一定程度上依赖于足够血管支持的形成[4]这意味着从原有血管中形成或萌芽出新的内皮内衬血管[5].

传统上公认的肿瘤血管形成和灌注机制被认为是内皮细胞排列的血管网络[6]. 然而，最近的研究发现，一些侵袭性肿瘤细胞在没有内皮细胞或成纤维细胞的情况下产生血管生成样通道[7]. 模式化微循环的形成被称为血管生成拟态（VM），它表明侵袭性肿瘤细胞能够产生由细胞外基质分隔的非内皮细胞系通道的过程在体外[7-9]. 这就是为什么用血管生成靶向治疗策略难以控制卵巢癌的原因[9]对这种血管生成没有积极影响。

低氧是Folkman描述的血管生成的重要因素之一，因为它与化疗和放疗的耐药性有关。组织缺氧的发展特征是恶性肿瘤迅速增大。这种低氧条件对癌细胞产生选择性压力，肿瘤细胞在低氧微环境中生存的能力与预后不良和对治疗的抵抗有关[10]. 血管内皮生长因子（VEGF）的诱导是缺氧最关键、最具特征性的反应之一，低氧诱导因子-1（HIF-1）在这一过程中是一个公认的介质。我们以前的研究表明，卵巢癌细胞在缺氧条件下可以被诱导为内皮样细胞，具有内皮细胞的特异性体内和在体外[11-13]，其中HIF-1α起着至关重要的作用。

众所周知，来源于癌细胞的内皮样细胞（EL）不同于内皮细胞。然而，详细的区别和机制还不清楚。在本研究中，我们测定了两种恶性卵巢癌细胞系SKOV-3和ES-2中ELs的一些生物学行为，如增殖、细胞周期、凋亡、端粒酶活性和侵袭性。同时，我们将这些生物学行为与传统内皮细胞、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和原癌细胞进行了比较。此外，我们试图通过检测一些相关基因的表达来探索潜在的机制。

方法

细胞培养

人类上皮性卵巢癌细胞系SKOV-3和ES-2购自美国类型培养库（ATCC，Manassas，VA），并保存在McCoy的5a中。从脐静脉中分离出原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC），并按前述方法进行培养[14]

三维培养与低氧治疗

将30微升Matrigel（B&D，Bedford，MA）滴在12孔培养板中的每个玻璃盖玻片上，并在室温下聚合1小时，然后在37°C的加湿5%CO中培养30分钟2培养箱，如前所述[15]. 肿瘤细胞（1×104)将种子接种到三维凝胶上。每36小时更换一次含有15%FBS的培养基。通过冲洗5%CO创造缺氧条件2和95%N2通过改造后的腔室（日本三菱），直到O2浓度降低到1%，用微型氧气计测量。将培养系统密封并在37°C下培养[16]. 必要时，用DMSO中50 nM西罗莫司（西格玛，圣路易斯，密苏里州）处理细胞，以抑制缺氧条件下HIF-1α的作用。

增殖试验

对于增殖试验，1×104将SKOV-3、ES-2和HUVEC细胞接种到96个平底板中，并在37°C常氧或缺氧（1%O2)在加入20μL MTT溶液（在PBS中为5mg/ml）之前。在37°C下再培养4小时后，用多功能阅读器（瑞士苏黎世Tecan GENios）测量490 nm处的吸光度，以确定细胞活力。

细胞周期和凋亡检测

对缺氧处理前后的细胞进行细胞周期和凋亡检测（3天或7天），以确定缺氧是否调节卵巢上皮细胞的生长期和凋亡。将细胞胰蛋白酶化并在300×g（1000 rpm）下离心5 min，然后再悬浮（1×106细胞/ml），用70%冰镇乙醇固定30分钟，然后离心、洗涤，再悬浮在含有10μl脱氧核糖核酸酶的500μl PBS中（最终浓度为1‰）。培养30分钟后，将碘化吡啶（PI，0.05 mg/ml）添加到溶液中，在黑暗中再培养15分钟，并用尼龙网过滤以去除细胞团。使用FACS Calibur流式细胞仪（加利福尼亚州圣何塞市Becton-Dickinson）测量PI的荧光。根据DNA含量的差异，通过门控分析计算G0/G1、S和G2/M期细胞亚群和凋亡。每个样本至少分析20000个细胞。细胞增殖特性以S期比值为指标。

侵入试验

如前所述，侵入分析在24孔跨孔室（Costar，Bodenheim，德国）中进行[17]. 简单地说，用15μg Matrigel涂覆8μm孔插入物。细胞接种到涂层过滤器（5×104细胞/过滤器）置于200μL无血清培养基中，一式三份。在培养箱的下部再添加500μL无血清培养基。在缺氧条件下培养7天后，用棉签擦拭Matrigel涂层的上表面。通过滤镜迁移的细胞被固定，用Giemsa（Sigma，St.Louis，MO）染色，拍照并计数。

激光捕获显微切割

将15微升Matrigel装在乙烯-醋酸乙烯酯（EVA）膜上（德国威兹拉尔莱卡），用框架代替盖玻片，放在9厘米的盘子里，并按照上述方法处理以建立三维培养基。将接种在凝胶上的肿瘤细胞密度调整为1×1057天后，用PBS-DEP洗涤EVA膜上的样品并风干，通过显微镜选择由内皮样细胞（EL）形成的通道，并用激光捕获显微切割（LCM）系统（Leica）进行显微切割。从每个EVA膜中激光捕获约1500-2000个EL。将细胞浸入消化缓冲液中进行实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和端粒酶活性测定。

定量实时RT-PCR

从2×10提取总RNA4使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）的细胞（包括HUVEC，SKOV-3，SKOV-3 EL，ES-2，ES-2 EL，或经50 nM西罗莫司处理的SKOV 3或ES-2细胞）。使用超级订阅第一链合成系统（Invitrogen）将等分RNA反向转录到cDNA。通过Rotor-Gene3000 PCR系统（澳大利亚科贝特），使用SYBR-Green PCR Master mix（德国希尔顿市齐根），实时PCR分析定量HIF-1α、VEGF、Flk-1、Cyclin D1、p53和V-src的mRNA表达。PCR反应由12.5μl SYBR-Green PCR Master混合物、1.0μl正向和反向引物（最终浓度0.4μM）和2.0μl 1:10稀释模板cDNA组成，总体积为25μl。在50°C下启动扩增2分钟，95°C启动扩增70秒，然后在95°C下40次循环20秒，58°C启动20秒，72°C启动30秒。为了仅验证生成的单一产品，在热循环后添加了分离协议。该分析包括无模板对照，即cDNA混合物的四个系列稀释点（步长为10倍）的标准曲线。所有数据均由Rotor-Gene软件（6.0版）控制RNA输入量，内源性参考基因（β-actin）在相同的反转录反应中作为对照。数据表示为三个独立实验的平均值±S.E。本实验中使用的引物如表所示​表1。1所有引物均使用Primer3网络软件（马萨诸塞州剑桥市怀特黑德研究所）设计，并由Sangon生物工程技术与服务有限公司（中国上海）合成。

表1

实验中使用的引物序列

基因感觉反义产品（bps）
HIF1αTGCACAGGCCACATCACGT公司GTTCACAAAATCAGCACAAGC公司97
法兰-1ACAGTGTATGTTCTTGCCTCA公司GTAGCCTCTGTCTGGTTTGA公司140
血管内皮生长因子TCACCAGGCCAGCACATAG公司GGGAACGCTCCAGGACTTAT公司166
细胞周期蛋白D1GATGCCAACCTCTCCAACGACCTCCTCGCACTTCTCTTCTCTC（CTCCTCGC）171
V型钢CACTCGCTCAGCAGCAGGAGAG公司AGAGGCAGTAGGCACTTCG公司196
第53页GCTGCTCAGATAGCGATGGTCCTCCCAGGACAGGCACAACA公司298
β-肌动蛋白中央电视台数据211

端粒酶活性测定

使用华美生物科技有限公司（中国上海）提供的试剂盒，通过端粒酶重复序列扩增-酶联免疫吸附试验（TRAP-ELISA）检测所有细胞（包括HUVEC、SKOV-3、SKOV-3 EL、ES-2、ES-2 EL，或经50 nM西罗莫司处理的SKOV 3或ES-2细胞）的端粒酶活性根据制造商的说明。

统计分析

方差分析成对样品分析t检验使用SPSS11.5统计软件（Lead，US）进行差异识别。假设统计显著性为P<0.05，P值为双尾。

结果

卵巢癌内皮样细胞的形态与HUVEC内皮细胞相似

为了研究缺氧诱导卵巢癌内皮样细胞的形态，将SKOV-3和ES-2细胞在1%氧浓度的EVA膜上的三维Matrigel系统中培养2LCM收获前7天。通过显微镜观察缺氧诱导的内皮样细胞的形态，如图所示​图1。1如图所示，卵巢癌细胞在缺氧条件下孵育后，延伸和重塑，形成ELs并相互连接（A和B），最终形成网络结构和通道（C和D）。单个细胞的原始细胞和LCM显微切片如图所示。​图1A1安培和​和1B，1B年，图。​图1C1摄氏度和​和1D一维显示原始和显微解剖的成组细胞。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1756-9966-29-124-1.jpg

缺氧诱导卵巢癌ELs的形态学及LCM显微解剖卵巢癌细胞在采收前在EVA膜上的3-氨基酚醛-基质系统中缺氧培养7d。这些照片是在光学显微镜下拍摄的。A类和B用LCM对单个细胞的原始细胞和显微解剖后的细胞进行显微解剖。C和D类.分组细胞的原始细胞和LCM显微解剖后的细胞。放大倍数X200。箭头：显微切割后的细胞形态。

缺氧改变SKOV-3、ES-2和HUVEC细胞的增殖、细胞周期、凋亡和侵袭等生物学行为

为了阐明缺氧对SKOV-3、ES-2和HUVEC细胞生物学行为的影响，在缺氧诱导3或7d后，用MTT、FCM和transwell小室检测细胞增殖、细胞周期、凋亡和侵袭，如图所示。​图2A，2安培SKOV-3的增殖在第3天被显著抑制，而在第7天培养后无差异。对于ES-2细胞的增殖，缺氧培养后无显著差异。低氧孵育3d后HUVEC细胞增殖受到抑制，孵育7d后进一步受到抑制。

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缺氧诱导的SKOV-3、ES-2和HUVEC细胞的增殖、细胞周期、凋亡和侵袭将SKOV-3、ES-2和HUVEC细胞在常氧或缺氧条件下培养3或7天，然后用MTT、FCM（细胞周期和凋亡）和Transwell检测增殖、细胞周期（S噬菌体）、凋亡和侵袭，如方法所示。A类MTT法检测三个细胞的增殖。BFCM测量三个电池的S相比率。C流式细胞仪检测三种细胞的凋亡。D类和E类在孵育3天（D）或7天（E）后，通过Transwell指示的细胞侵入膜的数量。数据显示为三个独立实验的平均值±S.D.，结果相似。***表示与正常氧相比，P<0.05和P<0.01。

缺氧孵育3或7天后，S期细胞百分比和凋亡率如图所示。​图2B2B型和​和2C。2摄氏度如他们所示，在SKOV-3和ES-2细胞中，孵育3d后S期百分比下降，凋亡百分比增加，但两个细胞系孵育7d后S期和凋亡没有差异。另一方面，HUVEC细胞的S期百分率在孵育3天和7天后下降，凋亡百分率增加。

通过跨阱室基底膜迁移的细胞数量如图所示。​图3D三维（孵化3天后）和3E（孵化7天后）。与常氧对照组相比，低氧孵育3和7天后SKOV-3中的数量显著减少，而ES-2中的数量仅在孵育3d后才显著减少。孵育3天和7天后，HUVEC细胞数量显著减少。

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缺氧诱导肿瘤细胞SKOV-3、ES-2、ELs和HUVEC基因表达将SKOV-3、ES-2和HUVEC细胞在常氧或缺氧条件下培养7d，然后收获，通过实时PCR检测HIF-1a、VEGF、Flk-1、CyclinD1、p53和V-src基因的表达。A类通过实时PCR检测SKOV-3和相关细胞中的基因表达。B实时PCR检测ES-2和相关细胞中的基因表达。SKOV-3标高：SKOV-3细胞诱导的内皮样细胞；SKOV-3+Si：低氧条件下西罗莫司处理SKOV-3细胞；ES-2标高：ES-2细胞诱导的内皮样细胞；ES-2+硅：低氧条件下西罗莫司处理的ES-2细胞；*，^，并且&表示与HUVEC、SKOV-3（或ES-2）和SKOV-3+Si（或ES-2+Si）相比P<0.05；**，^^，与HUVEC、SKOV-3（或ES-2）和SKOV-3+Si（或ES-2+Si）相比，P<0.01。

缺氧改变SKOV-3、ES-2和HUVEC细胞端粒酶活性

为了研究卵巢癌细胞的恶性程度，采用TRAP-ELISA法检测低氧、常压或低氧条件下与西罗莫司孵育的SKOV-3、ES-2和HUVEC细胞的端粒酶活性。如表所示​表2，2端粒酶活性在所有SKOV-3内皮样细胞中均为阳性，在常氧或西罗莫司作用下均为阳性。在ES-2内皮样细胞和含西罗莫司的ES-2中端粒酶活性均为阴性，而在常压下ES-2中为阳性。正如我们所料，HUVEC细胞中端粒酶活性为阴性。

表2

端粒酶在不同细胞中的活性

细胞结果
HUVEC公司-
SKOV-3型+
SKOV-3标高+
SKOV-3+硅+
ES-2型+
ES-2标高-
ES-2+硅-

SKOV-3标高：SKOV-3细胞诱导的内皮样细胞；SKOV-3+Si：低氧条件下西罗莫司处理SKOV-3细胞；ES-2标高：ES-2细胞诱导的内皮样细胞；ES-2+硅：低氧条件下西罗莫司处理ES-2细胞。

缺氧培养后SKOV-3、ES-2和HUVEC细胞中HIF-1α、CyclinD1、VEGF、Flk-1、p53和V-src mRNA的不同表达

为了阐明缺氧引起ELs生物学行为改变的潜在机制，采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测缺氧、常压或低氧条件下培养的SKOV-3、ES-2和HUVEC细胞中HIF-1α、CyclinD1、VEGF、Flk-1、p53和V-src的mRNA表达。上述基因在SKOV-3和SKOV-2相关细胞中的表达如图所示。​图3A3A级和图。​图3B3B公司表明基因在ES-2和ES-2相关细胞中的表达。

如图所示。​图3，三HIF-1αmRNA在两种肿瘤ELs中的表达均显著高于正常氧和西罗莫司作用下的细胞，也高于HUVEC细胞。

VEGF mRNA在两种肿瘤ELs中的表达均显著高于正常氧和西罗莫司作用下的细胞，但显著低于HUVEC细胞。

Flk-1 mRNA在两种肿瘤细胞的ELs中的表达均显著高于正常氧环境下的细胞，但显著低于HUVEC细胞。另一方面，ES-2内皮样细胞中Flk-1mRNA的表达显著高于西罗莫司处理的细胞，但SKOV-3内皮样细胞和西罗莫斯处理的SKOV-2细胞之间的Flk-1 mRNA表达没有差异。

Cyclin D1 mRNA在两种肿瘤细胞的ELs中的表达均显著低于正常氧环境下的细胞，而在西罗莫司和HUVEC细胞中的表达无差异。

p53 mRNA在两种肿瘤ELs中的表达均显著高于正常氧环境下的细胞和HUVEC细胞，但西罗莫司治疗后无明显变化。

V-src mRNA在缺氧或常压下均不表达。

讨论

在本研究中，我们通过缺氧诱导两种卵巢癌细胞株SKOV-3和ES-2向内皮样细胞分化，并通过LCM获取ELs。在我们之前研究的基础上[11]ELs具有内皮细胞的特异性，如表达CD34、vWF和摄取acLDL。在这里，我们检测了ELs的生物学行为，并与HUVEC内皮细胞和原始癌细胞进行了比较。

结果表明，在缺氧条件下，癌细胞的生长在短时间内（3d）受到抑制，但在长时间缺氧（7d）培养后，细胞恢复生长。增殖试验、细胞周期和凋亡试验的结果证明了这些。另一方面，HUVEC不耐缺氧，在缺氧条件下表现为增殖抑制、S相比率降低、细胞凋亡增加。如先前研究所示[10,18]，癌症的侵袭性越强，细胞对缺氧的抵抗力就越强。在缺氧条件下，癌细胞可以将某些特征转化为ELs，形成VM，然后肿瘤可以独立于血管生成进行自身灌注。VM中的肿瘤与更具侵袭性的肿瘤生物学和肿瘤相关死亡率增加有关[19,20]. 侵袭基底膜是侵袭性肿瘤的特征之一。在缺氧条件下，SKOV-3和ES-2卵巢癌细胞的侵袭能力先降低，长期缺氧后恢复到正常水平。

端粒酶是一种结合染色体末端（端粒）并保持端粒长度和完整性的酶复合体，存在于生殖细胞、增殖颗粒细胞、生殖系干细胞和卵巢肿瘤细胞中，但在分化或老化的细胞中不存在。卵巢中端粒酶的激活支持良性和恶性细胞的增殖。正常情况下，端粒酶活性高是癌症的标志，包括卵巢上皮癌[21]. 累积数据表明端粒酶激活是卵巢癌发生的早期事件[22-25]. 正如预期的那样，SKOV-3和ES-2细胞中的端粒酶活性均为阳性，HUVEC中的端粒酶活性为阴性。同时，使用或不使用西罗莫司治疗的SKOV-3细胞的ELs中的端粒酶活性也为阳性，而使用或不采用西罗莫斯治疗的ES-2细胞的ELs中的端粒酶活性为阴性。两种ELs端粒酶活性的差异可能导致两种细胞的不同增殖行为。

为了探讨低氧处理后SKOV-3和ES-2转变为ELs的潜在机制，我们检测了SKOV-2、ES-2、SKOV-3ELs、ES-2 ELs、含或不含西罗莫司的ELs和HUVEC中一些相关基因的表达。如图所示。​图3三结果表明，与原癌细胞相比，ELs表现为HIF-1α、VEGF、VEGF-受体-2（Flk-1）和p53 mRNA表达升高，而Cyclin D1表达降低。我们和其他人的研究表明，缺氧条件下HIF-1α对血管生成和血管内皮生长起着重要作用[11,26-28]. 为了确定VEGF和Flk-1表达变化的来源，我们使用西罗莫司抑制HIF-1α的活性。西罗莫司，即雷帕霉素，被证明是HIF-1α的抑制剂[26,29,30]. 与其他研究一致，VEGF、Flk-1和Cyclin D1的表达变化是HIF-1α转录依赖性的[10,31]. 然而，p53表达的变化与HIF-1α转录无关。

结论

总之，低氧可将卵巢癌细胞诱导为与前体内皮细胞相似的内皮细胞。诱导后，ELs将获得内皮细胞的一些特征，并失去原癌细胞的一些恶性特征。HIF-1α和HIF-1α依赖性VEGF和Flk-1的表达增加可能有助于VM和血管生成。在过渡过程中，HIF-1α在分子机制中起着重要作用，而在这一过程中还存在其他HIF-1非依赖性机制。

缩略语清单

EL（s）：内皮样细胞；EOC：上皮性卵巢癌；EVA：乙烯-醋酸乙烯酯；HIF-1：低氧诱导因子-1；HUVEC：人脐静脉内皮细胞；LCM：激光捕获显微切割；逆转录聚合酶链反应；TRAP-ELISA：端粒酶重复序列扩增-酶联免疫吸附试验；VEGF：血管内皮生长因子。

相互竞争的利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

PZ进行了增殖、细胞周期和凋亡检测，参与起草了稿件。YN进行了入侵实验，参与了实验设计并起草了手稿。LY构思了这项研究，参与了其设计和协调，进行了统计分析，并帮助起草了手稿。MC进行端粒酶活性测定，参与草案编制。CX参与了研究的设计并进行了统计分析。所有作者阅读并批准了最终手稿。

作者信息

PZ，医学博士，复旦大学妇产科、妇产科医院医学硕士研究生；上虞市医院妇产科高级医师；YN，医学博士，复旦大学上海医学院生理与病理生理学系助理教授；LY，医学博士，复旦大学妇产科医院妇科副教授兼医学顾问；复旦大学妇产科、妇产科医院医学硕士研究生，医学硕士；CX，医学博士，教授兼高级医学顾问，复旦大学妇产科，妇产科医院。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金资助30471806、30470689和30900716，中国博士后科学基金资助20040350454，上海市科学技术委员会资助04JC14021。

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文章来自实验与临床癌症研究杂志：CR由提供BMC公司