近年来，用于复杂组织研究的遗传方法的开发和使用显著增加。例如，大脑由许多结构组成，每个结构都由多种神经元类型组成，它们的轴突和树突紧密交织在一起。在这样的组织中，每个细胞类型都有独特的功能作用，由于很难将一种细胞类型与其他细胞类型分开进行监测或操作，因此通常很难独立评估。遗传方法已被证明对这种复杂组织的研究非常有效，因为有可能产生在特定细胞类型中选择性表达Cre重组酶等基因的小鼠系。然后，这些小鼠可以与基因的有条件表达相结合，从而监测或控制受影响细胞的活动。例如，最近开发的用于大脑研究的基因工具允许选择性地分析或改变神经元活动，并允许识别特定细胞类型的连接性(1).
尽管这些工具在小鼠研究中非常有用，但还需要开发有效的遗传策略，以针对除小鼠以外的物种中的特定细胞类型进行表达。例如，对灵长类复杂行为的电路机制的研究将受益于大脑中的细胞类型靶向(2)如果针对特定的细胞类型，基于病毒载体的人类基因治疗将减少副作用，提高疗效。将特定启动子并入病毒载体的成功率有限，部分原因可能是难以确定相关的调控元件。我们还没有发现任何使用特定启动子元件实现选择性表达的例子，而且也已经证明，选择性并没有产生，至少部分是因为病毒载体的内源性取向。例如，α-CAM激酶启动子被认为限制兴奋性皮层神经元的表达，但这种限制仅在慢病毒载体的背景下观察到(三,4)对兴奋性神经元有极强的向性(5); 同一启动子不能限制AAV载体的表达，而AAV载体可以感染抑制性神经元(5). 虽然有改进方法的希望，但也有可能许多基因受到表观遗传机制的调控，因此，控制其表达的调控元件无法在成人中实现细胞类型特异性基因表达。此外，许多基因产物受到翻译后修饰的影响，从而改变其功能特性，包括受体与其各种配体的结合。因此，根据表面受体的差异表达，将载体靶向细胞也可能是有用的，无论研究的是何种物种。
基因表达转录控制的另一种选择是“转导靶向”，即利用病毒载体的工程来选择性感染感兴趣的细胞类型。已经开发了几种这样的方法，并在细胞培养中进行了证明（有关综述，请参阅参考文献。6和7)最近，以血液中的B淋巴细胞为靶点(8)或皮下注射肿瘤细胞(9). 然而，我们还没有发现在体内注射到复杂的实体组织（如大脑）后有任何成功的演示。在这里，我们使用Snitkovsky等人首次在培养细胞中描述和证明的靶向系统和载体，将基因表达靶向大脑皮层中抑制神经元的特定亚群(10). 他们产生了一种由a亚群（TVA）禽病毒（ASLV-a）受体组成的桥接蛋白，该受体与神经调节蛋白β1（TVA-NRG1）的EGF-like区域融合，以靶向表达神经调节蛋白受体的细胞（称为ErbBs）的病毒感染。我们选择使用B亚组（TVB）的ASLV-B受体–NRG1桥蛋白(10)以大脑皮层中表达ErbB4的神经元为靶点，因为一些证据表明，有可能将基因表达靶向表达ErbB4受体的特定神经元亚群，并且因为ErbB5及其配体（NRG）都与精神分裂症有关(11). 使用基于TVB的桥蛋白是因为，与TVA-桥蛋白不同，它们在首次加载到病毒粒子而不是细胞表面时可以支持病毒进入(12).
一些证据表明精神分裂症患者的抑制性皮层回路紊乱(13). 同时，最近的证据表明精神分裂症与NRG和ErbB4受体的突变有关(11). 艾伦脑图谱中ErbB4新皮质表达模式的可视化(http://mouse.brain-map.org/brain/Erbb4.html)海马区抗体染色(14,15)和皮层(16,17)表明该受体的表达仅限于抑制性神经元，但不一定局限于数十种不同抑制性新皮质细胞中的特定类型(18). 此外，皮层脑片的功能研究表明，NRG1增强了小白蛋白（PV）阳性抑制神经元释放GABA的能力，增强了它们对突触后锥体神经元的影响(19,20). 尽管NRG和ErbB4信号在其他皮质抑制细胞类型中的作用尚不清楚，但似乎不同类型的ErbB4-表达抑制神经元对NRG的反应方式存在差异(16). 可能与NRG的功能相互作用在表达ErbB4的抑制性神经元类型之间有所不同。
我们的目的是通过使用EnvB假型病毒和TVB–NRG1桥接蛋白，靶向皮层ErbB4表达神经元进行体内转基因表达(10). 有了这样一个系统，病毒感染可能会偏向于与NRG有特定功能相互作用的细胞。（请参见图S1用于示意图。）我们发现TVB–NRG1桥蛋白成功地将病毒感染靶向ErbB4表达的皮层神经元。随后对这些细胞的表征表明，它们实际上是皮层抑制性神经元的一个高度选择的亚群。这些细胞具有多种树突状形态，既有多极又有双极，但其特征性神经化学标记物的表达受到限制。尽管经典标记物PV、生长抑素（SST）和钙调素（CR）都与皮质中ErbB4的表达重叠(16,17)通过TVB–NRG1桥接蛋白感染的细胞SST阴性，PV很少阳性，而CR和/或血管活性肠肽（VIP）大多数阳性。因此，这些结果证明了病毒载体桥接蛋白靶向在体内复杂组织中的选定细胞的成功应用。这种靶向策略对于靶向其他类型的细胞具有普遍的实用性，尤其是TVB–NRG1桥蛋白为进一步研究其他脑区的皮层抑制神经元和NRG敏感细胞的选定子集提供了独特的工具。
结果
这里的结果是基于对小鼠或大鼠大脑皮层注射TVB–NRG1混合物后3d的皮层组织的分析(10)和EnvB假分型、G-缺失狂犬病病毒（RV）（参见方法和参考。21)以及相关的控制条件。通过狂犬病基因组中GFP或mCherry的表达评估G缺失狂犬病病毒感染细胞的鉴定。之所以使用G-缺失狂犬病，是因为它是一种高度敏感的感染监测方法，可以用GFP或mCherry完全填充感染细胞，从而进行详细的形态学观察(22). 重要的是，与野生型狂犬病病毒不同，G-缺失狂犬病不会从直接感染的细胞传播到附近或远处的其他细胞(22,23).
TVB–NRG1和EnvB伪型RV感染的皮层细胞的形态和分布。
为了测试由TVB–NRG1桥蛋白介导的病毒感染是否能够在体内靶向特定的神经元类型，我们将EnvB假型RV与TVB-NRG1桥蛋白混合作为接种物，并将其注射到成年小鼠皮层。注射后三天，对动物进行灌注，并对大脑进行切片和染色。我们假设这可能导致报告基因（GFP或mCherry）在皮层抑制神经元亚群中选择性表达。为了评估这种可能性，我们首先观察了在TVB–NRG1存在和控制条件下感染的神经元的分布和形态。这些实验使用了一种表达GFP的病毒（EnvB-GFP-RV）。在注射部位附近和距离>2mm的周围区域，检测到许多GFP阳性细胞，如和图S2A类——C类正如之前的研究所预期的那样，神经元感染了表达GFP的G-缺失狂犬病病毒(22)，GFP完全填充了细胞的过程，允许对形态细节进行视觉评估(). 在注射的附近（≈300μm），标记细胞有时具有胶质细胞和神经元的形态特征(图S2B类). 因此，我们将更详细的分析重点放在大于300μm的细胞上，从注射的侧面最多2 mm，那里胶质样标记很少（例如。，图S2C类). 在这些位置，GFP填充的细胞分布在整个皮质层，具有不同组皮质抑制神经元的形态特征(). 特别是，标记的神经元是黏液性和非锥状的，强烈表明它们是唯一的抑制性神经元。这种优先标记并非偶然，因为在小鼠中只有≈15-20%的皮层神经元具有抑制性(5). 在第1层外，大多数标记细胞具有双极树突状形态（只有两个初级树突状突起从细胞体延伸）(). 这种形态学强烈表明这些神经元可能表达钙调素和/或VIP(18). 此外，多极神经元也相对常见(). 第1层神经元为多极神经元(). 每24个切片对GFP阳性神经元的定量分析显示，尽管细胞分布在整个皮质层，但46%（189/415个GFP阳性细胞位于第1层/所有层的GFP阳性神经细胞）的GFP-阳性细胞位于第一层。在向大鼠大脑皮层注射TVB–NRG1和EnvB-GFP-RV后3天，观察到类似的定性结果(图S3)，表明神经元的高选择性转导并非小鼠皮层所独有。
感染EnvB伪型狂犬病病毒和NRG1-TVB桥蛋白后，皮层神经元表达GFP。(A类)低倍镜显示感染GFP标记神经元的整体位置和形态。珊瑚表面位于顶部。(B类)与相同A类用DAPI复染（蓝色）显示皮层。照片顶部第1层的边界显示为L1。(C类——F类)高倍镜显示皮质板神经元更详细的形态学特征(C类和D类)和第1层(E类和F类). 请注意，所有表达GFP的细胞都是黏液性和非锥状的。（比例尺：A类和B类150微米；C类和E类，75微米）条形图输入C类也适用于D类.Bar输入E类也适用于F类.
以前的研究使用TVA或TVB桥蛋白和EnvA或EnvB假型逆转录病毒感染培养细胞(10,12)提示该策略的实用性可能扩展到许多包膜病毒载体，包括慢病毒。由于慢病毒对长期稳定的基因表达非常有用，我们还使用TVB–NRG1桥蛋白和EnvB假型慢病毒（EnvB-LV-GFP）评估了小鼠皮层神经元在体内的感染情况。皮质注射两周后，GFP表达神经元稀疏地散布在皮质层中，其分布与注射狂犬病后观察到的类似(图S4). 然而，正如预期的那样，复制能力强的狂犬病病毒产生非常高的基因表达水平，慢病毒的基因表达可能较低，并且取决于融入宿主细胞基因组的位置，标记的细胞较少，GFP表达水平可变但相对较低，对于大多数感染细胞，无法观察到详细的形态。然而，标记质量足以表明受感染的细胞不是兴奋性锥体神经元，几乎所有细胞都有抑制性皮层神经元典型的小圆细胞体。这种罕见的细胞内充满了GFP，具有清晰的两极形态，与狂犬病标记后观察到的细胞相似。虽然可以看到一些具有胶质形态的细胞（例如。，图S4A类)，注射部位附近的此类标记远低于狂犬病病毒。因此，就使用这些方法标记的质量而言，TVB–NRG1桥接蛋白介导的EnvB-LV-GFP感染主要针对皮层抑制神经元，类似于感染EnvB-GFP-RV的神经元。
我们将剩下的描述重点放在使用狂犬病病毒感染小鼠皮层神经元上，因为这种病毒可以更好地显示受感染细胞的详细形态，并通过使用在选定细胞类型中表达GFP的小鼠系（见下文）更明确地识别皮层细胞类型。
NRG1介导的神经感染选择性靶向表达NRG1受体ErbB4的细胞，需要ErbB4TVB–NRG1桥蛋白介导。
支持材料和图表中详细记录的其他几行证据表明：(我)观察到的报告基因表达是由于TVB–NRG1桥蛋白特异性介导的病毒感染，而不是其他一些非特异性相互作用；和(ii（ii）)TVB–NRG1介导的感染需要ErbB4受体（在ErbB4基因敲除小鼠中不存在）。支持材料还详细说明了TVB–NRG1介导的狂犬病病毒感染后表达GFP的神经元比例的定量分析，其中原位杂交显示ErbB4 mRNA的表达TVB–NRG1介导的感染对ErbB4表达神经元具有高度选择性。量化可检测到ErbB4 mRNA的GFP阳性细胞百分比显示，72%（331/459）明显为双标记。由于采用了严格的标准和使用的标签方法的局限性，这是一个保守的估计(SI方法).
GFP表达的双重标记和ErbB4原位杂交。GFP表明细胞感染了EnvB假型病毒和TVB–NRG1桥蛋白，并用热变性抗GFP抗体染色。用ErbB4反义RNA探针标记后，黑色反应产物显示抗地高辛染色。(A类——C类)显示GFP阳性细胞分布的低倍视图(A类)，ErbB4原位标记(B类)、和覆盖(C类). 许多GFP阳性细胞也呈ErbB4阳性。ErbB4阳性细胞用方框标记(B类,C类,E类、和F类)所有GFP阳性细胞都可以在覆盖层中看到双重标记(C类). 在某些情况下，表达GFP的细胞也没有明显的ErbB4标记(D类——F类，圆圈单元格）或明显未标记(G公司——我，圆圈单元格）。（比例尺：A类，50μm，对应于A类——C类;F类，50μm，对应于D类——F类;我，50μm，对应于G公司——我.)
选择性感染TVB–NRG1桥蛋白的神经元类型的特征。
上述形态学分析()强烈提示TVB–NRG1介导的EnvB-RV感染选择性地靶向大脑皮层的抑制神经元。为了更明确地评估感染的细胞类型，使用了表达EnvB-RV的mCherry（EnvB-mCh-RV）代替EnvB-GFP-RV。这种病毒通过使用一系列GAD67 GFP敲除小鼠来促进抑制性神经元的鉴定，其中绝大多数抑制性皮层神经元表达GFP(24). 将TVB–NRG1和EnvB-mCh-RV注射到这些小鼠的皮层后，mCherry表达细胞的分布和形态()与上述使用EnvB-GFP-RV的情况无明显区别(). 如所示在第1层检测到mCh表达细胞，其中所有神经元都受到抑制，而皮层深层的细胞都具有典型的抑制性皮层神经元的形态。定量分析显示，91%（311/343=mCh+和GFP+双标记细胞/所有mCh+细胞）的mCh表达细胞也呈GFP阳性。这一比例远高于偶然预计的≈15%抑制神经元的值(5). 大多数mCh阳性/GFP阴性细胞位于第1层，具有胶质细胞或上皮细胞的外观，上述分析表明这些细胞是非选择性感染的。狂犬病感染和/或机械损伤也可能降低GFP的表达，导致一些受感染的抑制神经元检测不到GFP，或者GAD67 GFP敲除小鼠中的少数抑制神经元可能不表达可检测的GFP。
感染EnvB假型狂犬病病毒和TVB–NRG1桥接蛋白后，皮层神经元表达mCherry，该桥接蛋白在皮层抑制神经元中表达GFP。(A类)低倍视图显示感染的mCherry标记神经元的整体位置和形态。伯爵面位于顶部。(B类)与相同的部分A类图示GAD-67 GFP敲除小鼠系中表达GFP的抑制神经元。(C类)的覆盖A类和B类显示有许多双标记（黄色/橙色）细胞。双标记细胞用方框标记，而表达mCherry但不表达GFP的细胞用圆圈标记(D类——F类). (D类——F类)皮质板（第1层外）中单（圆形细胞）和双标记细胞（装箱）的高倍视图。（比例尺：A类，75μm，对应于A类——C类;D类，75μm，对应于D类——F类.)
皮层抑制神经元可进一步分为至少十几种不同类型(18). 在小鼠皮层中，根据PV、SST和VIP的免疫染色，这些类型可以分为三个不同的非重叠组(25). 另一个非常有用的标记CR主要与VIP重叠，但也与SST部分重叠(26). 因此，我们使用PV、SST、CR或VIP和GFP的双重免疫染色来进一步表征被TVB-NRG1和EnvB-GFP-RV感染的抑制性神经元。因为第一层的神经元对我们使用的标记物通常不具有免疫反应性(27)，分析仅限于深度超过1层的皮层。图示GFP和CR的双重标签()或PV()在注射了EnvB-GFP-RV和TVB–NRG1的动物的皮质组织切片中。尽管39%（68/176）的GFP阳性细胞也对CR阳性，但只有4%（4/112）的PV阳性，无一（0/56）的SST阳性。如果所有抑制细胞类型都被感染，则根据其在皮层内的总体分布，PV和SST的百分比远低于预期。相同染色条件下PV和SST的预期值分别约为所有抑制神经元的30%和20%(25). 因此，TVB–NRG1似乎优先感染PV阴性和SST阴性抑制神经元。SST细胞感染的缺失也表明，CR阳性人群不太可能包括同时表达CR和SST的细胞(26). 相反，CR-阳性细胞可能包括那些也表达VIP的细胞；≈35%的VIP细胞共表达CR(25).
GFP表达和抑制细胞类型特异性标记物的双重标记。绿色标签表示感染了EnvB假分型病毒和TVB–NRG1桥蛋白的细胞的抗GFP染色，而红色标签表示针对CR的抗体染色(A类——C类)或PV(D类——F类). GFP表达A类和D类图示了感染的GFP标记神经元的整体位置和形态。珊瑚表面位于顶部。B类和E类对应于其左侧的相同部分，并用防CR标记红色标签(B类)或PV(E类).C类和F类是GFP和抗体染色图像的叠加。一些双标签单元格用箭头标记。请注意，GFP表达细胞被标记为CR是常见的，而用PV标记的细胞则很少（选中的照片突出显示在这种细胞上）。（比例尺：A类，100μm，并且对应于所有图像。）
我们对VIP表达的定量分析也清楚地显示，许多感染TVB–NRG1和EnvB-GFP-RV的细胞表达VIP(图S5). 总的来说，在23%（54/230）的GFP表达细胞中检测到VIP抗体染色，表明这些群体之间存在明显重叠。然而，与其他抗体相比，VIP染色质量相对较差（相比之下具有图S5)导致抗体/GFP双重染色定量的不确定性，表明真实百分比可能更高。特别是，VIP不仅存在于细胞体中，而且也存在于轴突末端，导致高水平的“背景”（轴突）组织染色，有时很难识别清楚的细胞标记(图S5). 也有可能在某些表达细胞的胞体中未检测到VIP，因为VIP定位于轴突。最后，感染狂犬病病毒也有可能降低VIP免疫染色，导致假阴性。这种解释与之前的研究一致，在狂犬病感染后神经肽表达似乎降低(28).
鉴于狂犬病感染后神经肽表达降低可能导致我们无法检测到感染神经元中的SST和PV，我们还分析了“GIN”小鼠和“G42”小鼠中感染的神经元，它们分别在SST阳性和PV阳性抑制性皮质神经元中选择性表达GFP(29——31). 方法与GAD-67 GFP敲除小鼠的方法类似（见上文）。与针对SST或PV的抗体染色一样，在GIN小鼠中未检测到双标记细胞（0/1047），在G42小鼠中仅检测到2%（6/329），进一步支持了TVB–NRG1不易介导SST或PVC阳性抑制神经元感染的解释。
讨论
遗传工具为复杂组织的研究和治疗创造了强大的机会，例如大脑皮层，它包含多种细胞类型，每种细胞类型都具有独特的功能作用。本文的结果证明了TVB–NRG1桥接蛋白在体内复杂组织中选择性病毒转导的有效性。这是首次在大脑中进行靶向选择性转导的实验，表明通过使用其他桥接蛋白来靶向不同的细胞类型，这种方法也可能成功。此外，大脑皮层中TVB–NRG1桥蛋白的结果为进一步研究ErbB4和NRG在神经回路功能中的作用提供了工具，并基于使用这些工具的初步观察提供了独特的见解。
相对于广泛使用转基因小鼠实现细胞型特异性基因表达，这里描述的策略既有优点也有局限性。优点包括能够针对转基因动物（如灵长类动物）生产不可行或用于人类治疗目的的物种的细胞类型。与受转录机制调控的方法相比，转导靶向可能允许更具选择性的靶向。例如，许多mRNA受到选择性剪接，基因产物受到翻译后修饰。因此，有可能设计桥接蛋白，以处于特定功能状态的受体为靶点，从而使其与呈现的配体特异结合。在我们的实验中，通过使用TVB–NRG1桥蛋白，可能已经赋予了这种选择性。尽管皮层神经元的感染强烈偏向于表达PV和SST的细胞，但有充分证据表明，在海马和新皮质中，这些细胞类型都表达ErbB4和/或ErbB4mRNA蛋白(14——17). TVB–NRG1桥蛋白更具选择性的感染可能是由于靶向在特定功能状态或细胞隔室中存在ErbB4受体的细胞（例如，暴露在细胞表面）。这种选择性的另一方面是，从mRNA分布分析中可能无法完全预测转导的细胞类型。尽管桥接蛋白靶向方法显示出巨大的前景，但相对的缺点还包括：由于注射参数的变化，感染细胞的数量或密度会发生变化，注射过程中可能发生机械损伤，与动物繁殖相比，载体注射的困难。
除了观察到特异性NRG1介导的抑制神经元感染外，注射部位附近也存在非特异性感染。非特异性感染的主要形式涉及具有胶质形态的细胞。考虑到EnvB介导的病毒进入的低pH依赖性(32)我们推测，这些事件是由于伪型狂犬病病毒的非特异性摄取水平较低，随后被输送到酸性内体室，在那里发生病毒-细胞膜融合。
因为TVB–NRG1应该能够通过使用广泛的包膜病毒载体，如慢病毒，选择性地将遗传物质传递给ErbB4中间神经元(10)，这一方法将为研究这些神经元提供全面的新兴遗传技术(1). 例如，应该可以确定这些细胞的突触输入来源(21)并用光学和遗传方法选择性地操纵它们的活动(1). 如图所示，用GFP标记这些神经元的能力将有助于它们在脑切片和体内双光子靶向修补的电生理研究中的靶向性(33). TVB–NRG1桥接蛋白可能被证明在促进非家畜物种（包括非人类灵长类）的实验方面特别有价值。由于灵长类大脑皮层的组织比老鼠更接近人类，因此在灵长类动物模型中对ErbB4中间神经元的研究可能会提供有用的见解。在小鼠和灵长类动物模型中进行的此类研究也可能有助于开发针对NRG/ErbB系统的治疗策略。
方法
EnvB-伪型狂犬病病毒和慢病毒的制备。
描述了EnvB-RV-GFP或mCherry的产生和效价，但使用细胞系BHK-EnvBGCD代替BHK-EnvAGCD，使用质粒pAB6代替pAB7(12)和293T-TVBS3单元(34)代替293T-TVA800(21). 这些研究中使用的病毒滴度如下：3×107EnvB-GFP-RV的转换单位（tu）/mL（通过FACscan评估）；和4×107EnvB-mCh-RV的tu/mL（通过手动计数评估）。EnvB-LV-GFP是使用所述方法生成的(22)除了pCI-EnvB质粒而不是pHCMV-RabiesG。
TVB-脯氨酸连接子和TVB质粒的构建。
为了在pCI质粒（Promega）中构建TVB脯氨酸连接子和TVB，用引物CACTATAGGCTACGCCTCGAGAGGCCT分别与TTATTACGGTACCTTACCCGTCCCCCCTCAGGAGTT和TAATGCGGTACCTTAGCGGCCGTGTGGAGGAGCTG配对产生PCR产物，用NheI和KpnI消化，并用pCI中的TVBS3-NRG1基因替换(35).
TVB–NRG1、TVB-脯氨酸连接子和TVB蛋白的产生。
用携带TVB-脯氨酸连接蛋白-Herb1基因的12μg pCI质粒转染细胞（293T）(35)（此处称为TVB–NRG1）、TVB-脯氨酸连接剂或使用脂质体（Invitrogen）的TVB。转染后5 h更换培养基，转染后3 d收集培养基。经过短暂离心后，上清液被用作蛋白质的来源。
立体定向动物注射和灌注。
所有使用活动物的程序都得到了索尔克研究所动物护理和使用委员会的批准。成年小鼠，ICR，GAD67-GFP敲除，ErbB4−/−ht（高温）+（文中称为“ErbB4基因敲除”）、GAD67-GFP转基因（GIN）或G42小鼠和成年Long Evans大鼠通过肌肉注射氯胺酮和木聚嗪混合物（分别为3.6 mg/kg和0.36 mg/kg）进行麻醉。将约9μL病毒与含有TVB–NRG1、TVB-脯氨酸连接物或TVB的上清液（体积1:10，病毒：狂犬病上清液和慢病毒上清液1:1）的混合物立体定向注射到额叶皮层的三个相邻位置（坐标：前1–2 mm，前角侧2–3 mm；深度，小鼠软脑膜以下0.7、0.5和0.3mm，前角2.5mm，外侧4mm；深度，软脑膜下1.5、1.0和0.5 mm）。注射狂犬病病毒3天后或慢病毒2周后，给动物注射过量的戊巴比妥（100 mg/kg IP），灌流，并在冷冻切片机上将大脑切片至40μm厚(21).
原位杂交结合抗热变性GFP免疫组织化学。
参考文献中描述了使用DIG标记RNA的原位杂交和自由漂浮切片的免疫染色。36简单地说，用变性反义DIG标记的RNA探针（Allen brain Atlas中的核糖体ID:RP_050428_03_A12；http://developingmouse.brain-map.org/data/Erbb4/69672126.html)然后使用羊抗DIG-AP-Fab（Roche）和兔抗热变性GFP抗体(36)在4°C下过夜。清洗后，用驴cy2-结合抗兔抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories）孵育脑切片，然后用NBT/BCIP底物溶液孵育。然后将大脑切片安装在载玻片上，盖上AquaMount（勒纳实验室）。
荧光免疫组织化学和图像采集。
使用相同的程序和所述抗体对脑切片进行免疫化学处理(25,26). 用Olympus BX51显微镜和MicroFire数码相机（Optronics）获取原位杂交结合免疫组化抗热变性GFP的图像。在尼康Optiphot II显微镜和MicroFire数码相机（Optronics）上获取GFP标记结合免疫化学的抑制性神经元特异性标记的图像。其余图像用Leica共焦显微镜（Leica TCS SP2 AOBS）采集。
