甲型流感病毒（IAV）仍然是国内外导致死亡和发病的主要原因。深入了解IAV的宿主免疫对于改进治疗方法和设计疫苗以应对IAV快速抗原进化至关重要。对IAV的免疫反应一直是数千项研究的焦点。虽然已知IAV可激活交感神经系统（SNS），但很少有研究检测SNS对IAV免疫和致病性的贡献(1).
SNS是负责战斗或飞行反应的自主神经系统的手臂。交感神经与血管一起进入几乎所有的组织。刺激交感神经会释放含有神经递质的颗粒，包括去甲肾上腺素（NE）、神经肽Y和ATP。交感神经递质可能在组织中广泛扩散，因为释放似乎是非突触性的，NE的组织半衰期约为7小时(2)。重要的是，许多免疫细胞（包括巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞）表达肾上腺素能受体并能接收来自SNS的信号(三–5).
研究SNS对宿主免疫反应影响的经典模型是基于NE类似物6-羟基多巴胺（6-OHDA）介导的化学交感神经切除术。6-羟多巴胺通过去甲肾上腺素受体主动选择性地运输到交感神经末端，在那里被氧化生成自由基，破坏末端(6)。腹膜内给药后，6-OHDA迅速分布到组织中，中枢神经系统除外，中枢神经系统受到血脑屏障的保护(6)。神经再生至少需要一个月的时间，这为在缺乏功能性外周SNS的情况下检查宿主抗病毒免疫提供了一个窗口。
众所周知，SNS可以调节对病毒的免疫反应(7–9)。Hunzeker等人和Hermann等人(10–12)已经证明，激活SNS和下丘脑-垂体轴的行为应激源调节了小鼠对IAV反应的许多方面。在本研究中，我们使用6-OHDA选择性地检测SNS在C57/B6（B6）小鼠对致死性肺IAV感染的免疫反应中的作用。
材料和方法
老鼠
从Taconic Farms（Germantown，NY）购买6至8周龄雌性C57BL/6小鼠。小鼠被安置在国家变态反应和传染病研究所的动物护理设施中，在特定的、无病原体的条件下，饲养在标准的啮齿动物饲料中，自由饮水，14:10小时光照：黑暗循环。小鼠在使用前至少1周被允许适应。
病毒和免疫
A/波多黎各/8/34（PR8）在10天龄的鸡胚中繁殖，并用作感染性尿囊液。病毒滴度由马丁达比犬肾细胞中50%的组织培养感染剂量和LD测定508周龄B6小鼠。小鼠经鼻（i.n.）感染1 LD50PR8在PBS中稀释，体积为25μl。
化学交感神经切除术
将100 mg/kg 6-OHDA（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）加入0.9%NaCl和10–7第7天和第5天服用M抗坏血酸，第3天服用200 mg/kg。对照小鼠注射0.9%氯化钠加10–7M抗坏血酸。交感神经切除术在脾脏冰冻切片中通过蔗糖-磷酸-聚乳酸反应得到证实（参考文献。9)识别交感神经。
细胞浸润分析
小鼠因过量服用阿维汀而死亡。用1 ml PBS通过气管将空气空间灌洗三次，以收集支气管肺泡灌洗（BAL）细胞。然后通过心脏向小鼠灌注PBS，以清除肺组织中的循环血。取出肺组织，并在37°C下用I型胶原酶和DNA酶消化2 h。用Fc受体阻断抗体（克隆2.4G2）阻断单细胞悬浮液，并用抗CD11b-ACP-Cy7（BD Biosciences，San Jose，CA）、抗CD11c-647（BD-Bioscinces）、抗-GR-1-太平洋蓝（BD bioscience）、抗-NK1.1-FITC（BD Biosciences）和抗-Mac3-PE（BD生物科学）染色。
细胞因子和趋化因子测量
根据制造商的规范，使用生物复合细胞因子珠阵列测定法（Bio-Rad，Hercules，CA）在BAL液中测量细胞因子和趋化因子。
结果和讨论
化学性交感神经切除术可提高肺部IAV感染的存活率
为了研究SNS对小鼠适应A/波多黎各/8/34（H1N1）（PR8）IAV感染B6存活率的影响，我们在1周的间隔内用6-OHDA治疗小鼠三次。最后一次6-OHDA治疗三天后，我们在麻醉下通过静脉注射感染了小鼠，导致整个呼吸道感染。感染1LD的15只小鼠组50每天监测PR8的体重减轻和其他发病迹象。值得注意的是，6-OHDA治疗的小鼠在致死性IAV感染后体重减轻和死亡率降低()。我们之前的研究表明，在相同的实验条件下，6-OHDA治疗不会改变肺部的病毒滴度(13)这表明存活率的差异是由于免疫反应发生了更直接的改变。
6-OHDA治疗可提高致死性IAV感染的存活率。6-OHDA或对照小鼠（每组15只）感染1个LD50PR8 i.n.实心灰色线条：6-OHDA治疗的PR8感染。实心黑线：控制PR8感染。灰色虚线：6-OHDA模拟感染。虚线黑线：控制模拟感染。左侧，生存。赖特，体重减轻。该实验重复10次，结果相似。
SNS支配小鼠肺部
虽然很明显，小鼠肺是由SNS支配的(14)，神经支配的程度尚未确定。因此，我们通过酪氨酸羟化酶染色鉴定了正常肺组织切片中的SNS(补充图1)。这表明，SNS神经束与主支气管和中支气管上的血管一起走行，并延伸至支气管平滑肌和肺腺（健康小鼠没有淋巴组织的组织区域）。重要的是，我们未能检测到SNS纤维伸入肺实质。因此，SNS对肺泡功能的影响很可能是由具有足够稳定性的化合物在远离其释放位置的地方起作用而从远处介导的。
生存率的增加不是由于CD8增强+T细胞反应
我们最近报道了6-OHDA治疗可以提高Kb条-和Db条-限制CD8+T细胞（TCD8（CD8）+)对IAV的响应(13)。作为TCD8（CD8）+已知可提高小鼠感染IAV的存活率(15–17)，我们调查了是否增强TCD8细胞+通过使用靶向缺失两种K的小鼠，6-OHDA介导的对致死性IAV感染的耐药性是必要的b条和Db条基因。尽管缺乏经典的I类限制性免疫监测，但敲除小鼠表现出6-OHDA介导的对IAV的耐药性，其程度与野生型小鼠相似(补充图2)。这些数据表明，在缺乏钾的情况下，6-OHDA可以对抗致死性IAVb条-或Db条-限制TCD8（CD8）+因为6-OHDA不会增加抗病毒抗体反应(13)这些数据有力地表明，交感神经切除术通过调节先天免疫系统而不是适应性免疫系统来保护小鼠免受致命感染。
化学性交感神经切除小鼠肺部病理学降低
为了了解6-OHDA对先天性免疫反应的影响，我们首先检查了IAV诱导的肺组织病理学。对照组或6-OHDA治疗组小鼠的肺部在感染后5天取出，固定、切片并用H&E染色()。正如预期的那样，IAV感染与细胞浸润有关，导致对照小鼠出现支气管炎和肺泡炎。在高倍镜下，炎症细胞可以被识别为淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。6-OHDA治疗减轻炎症(和补充表一)：与对照感染小鼠相比，实质和血管周围区域的淋巴细胞较少，支气管炎减轻，通气增加。
6-OHDA治疗可减少IAV诱导的组织病理学。A–DH&E染色的小鼠肺部低倍（原始放大×25）视图[标记有代表性血管（V）和支气管（B）]。未感染小鼠肺(A类)或使用(B类)治疗显示肺组织学正常。用生理盐水感染PR8五天后(C类)或使用6-OHDA处理(D类; 两组均出现支气管炎、支气管炎症和肺泡炎，但经6-OHDA治疗后有所减少）。生理盐水肺的高倍视图（原始放大倍数×400）(电子)或6-OHDA(F类)治疗组。与6-OHDA治疗组相比，生理盐水组存在更多的淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞，6-OHDA处理组保持了更好的通气性。这个实验重复了两次，结果相似。
化学性交感神经切除小鼠肺部炎症细胞减少
为了扩大6-OHDA治疗降低免疫浸润的组织病理学发现，我们通过流式细胞术定量了感染后3d BAL或肺实质中存在的固有免疫细胞。中性粒细胞（识别为GR1你好CD11b型+染色）在6-OHDA处理小鼠的肺组织和BAL中都减少了约3倍()。炎性单核细胞（Mac3你好CD11c公司+)可能由肺泡巨噬细胞和炎性树突状细胞组成，也同样减少。6-OHDA处理的小鼠也表现出NK细胞减少（NK1.1+)细胞渗入肺部，但BAL不渗入。
6-OHDA治疗可减少IAV诱导的细胞向肺实质和BAL的浸润。6-OHDA处理或对照小鼠感染1LD50感染后5天定量PR8静脉注射和细胞浸润。灰色条代表对照组，黑色条代表6-OHDA治疗组。右侧图形显示渗入肺实质左图显示浸润到BAL中。此实验重复两次，结果相似*第页< 0.05; **第页< 0.005.
6-OHDA减少即刻肺部炎症细胞因子的产生
6-OHDA介导的炎症反应减少表明SNS消融改变了即刻的细胞因子反应。因此，我们在感染后8天收集的BAL液中测量了一些细胞因子和趋化因子。微量样品需要使用基于珠的分析来测量每个时间点单个小鼠中的多种细胞因子/趋化因子().
6-OHDA治疗可降低BAL中IAV诱导的细胞因子和趋化因子的产生。6-OHDA处理或对照小鼠感染1个LD50在感染后第0、1、2、3、4、6和8天测定PR8静脉注射、细胞因子和趋化因子。实线代表对照组小鼠，虚线代表6-OHDA治疗组小鼠。这个实验重复了两次，结果相似。
在对照组小鼠中，IL-1β和IL-6均表现出双相反应，在感染后2或3天达到峰值，急剧下降，然后在感染后第8天再次下降之前持续几天增加。值得注意的是，6-OHDA治疗几乎消除了IL-1β（第2天减少了30倍以上），并且在感染过程中大大减少了IL-6的产生。6-OHDA治疗导致IL-12p40、GMCSF、IFN-γ和MIP-1α降低，但程度较轻，但仍具有统计学意义。然而，并非所有的细胞因子和趋化因子反应都发生了改变。例如，6-OHDA治疗组和对照组之间TNF-α和RANTES的生成相似，这表明SNS并不是简单地减少全球细胞因子或趋化因子的生成。这些发现表明，由于缺乏SNS神经支配，对IAV感染的肺细胞因子反应大大减弱。
α-阻断剂而非β-阻断剂延长了IAV肺炎的生存期
由于肾上腺素能阻滞剂是处方最多的药物之一，因此研究其对IAV诱导的致死率的影响显然很有意义。我们之前报道过β-阻断剂能增强小鼠TCD8（CD8）+对IAV的响应(13)。小鼠植入渗透泵，持续供应β-受体阻滞剂那多洛尔或α-受体阻遏剂酚妥拉明。等效剂量低于人类通常使用的剂量。虽然那多洛尔对IAV的致死率没有显著影响，但酚妥拉明明显将死亡率推迟了约5天().
α、 但β受体拮抗剂可提高致死性IAV感染后的存活率。小鼠（每组10只）感染1个LD50PR8静脉注射并监测存活率。右侧图形：小鼠接受纳多洛尔（β-阻滞剂）或生理盐水治疗。左侧图形：用酚妥拉明（α受体阻滞剂）或生理盐水治疗小鼠。重复这个实验，得到了类似的结果。
这些发现支持了6-OHDA通过调节SNS而不是通过另一个未定义的机制发挥作用的结论。此外，他们认为6-OHDA介导的保护作用有两个阶段，早期阶段包括通过α-肾上腺素能受体阻断天然免疫机制的正常激活。
这些发现表明SNS对致死性IAV感染后的存活率有明显影响。6-OHDA治疗小鼠的存活率增加与炎症细胞因子（尤其是IL-1和IL-6）的减少以及先天性细胞浸润有关。我们表明6-OHDA介导的生存不需要Kb条-或Db条-限制性抗IAV TCD8（CD8）+，但我们还没有排除CD4可能的作用+T细胞中的现象。然而，鉴于交感神经切除术对感染后早期细胞浸润的明显影响，当抗IAV CD4+T细胞的数量仍然相对有限。相反，我们的工作假设是，6-OHDA治疗小鼠肺部细胞因子的减少有助于其生存致命IAV的能力。这与IAV感染的TLR3相似–/–与野生型小鼠相比，肺部炎症细胞因子生成减少，存活率增加(18).
康斯坦蒂诺斯和谢里丹(19)已经证明，在PR8-诱导的肺炎期间，与未受束缚的小鼠相比，受到束缚应激的B6小鼠表现出肺部IL-1水平降低，IL-6水平不变。由于束缚应激增加了SNS刺激，这一发现与我们的发现相反，即SNS消融降低了IL-1和IL-6水平。这种差异突显了免疫系统和神经系统之间相互作用的复杂性，其结果可能取决于神经系统受到干扰的确切程度。束缚应激也会激活下丘脑-垂体轴，这可能会深刻影响肺免疫状态。6-OHDA介导的SNS消融可能通过全鼠和肺特异性适应影响免疫状态。
似乎最有可能的是，6-OHDA介导的IAV病理学下降的关键事件是IL-1和IL-6的即时分泌减少，从而影响其他细胞因子/趋化因子的分泌和炎症细胞的募集。这与SNS增强肺泡巨噬细胞IL-1和IL-6分泌相一致(20)。IL-1和IL-6的减少可能是由血液传播的信使介导的，或者更直接地由肺交感神经元介导的。虽然IL-1和IL-6几乎可以由任何类型的细胞分泌，但先天免疫细胞相对于交感神经细胞的巨大优势使得神经元细胞因子的分泌不太可能解释6-OHDA介导的IL-1和IL-6的深度降低。虽然肺的SNS神经支配似乎没有从支气管延伸到肺实质，但已知SNS神经递质在组织中持续存在数小时，因此肺泡细胞释放的细胞因子仍可能由肺SNS控制。
最后，我们的发现强调了免疫系统在应对病毒感染时必须实现的微妙平衡。IAV和其他细胞病变病毒在短短几天内不加检查地快速复制，将压倒宿主替换死细胞的能力。另一方面，过于强大的主机响应可能会导致附带损害，足以提高杀伤力。我们表明，SNS在先天性自身免疫免疫病理学中发挥重要作用，并提高了α-肾上腺素能拮抗药治疗高致病性IAV感染的可能益处。
