世界胃肠病杂志。2010年9月21日；16(35): 4410–4415.
血清和肝脏中glypican-3对原发性肝癌的诊断价值
刘慧，张丽杰，首都医科大学北京友安医院病理科，北京100069
中国首都医科大学北京佑安医院肝肠病学系李鹏、翟云、谭玉芬、李宁、丁慧国
曲春凤，分子肿瘤学国家重点实验室，中国医学科学院肿瘤研究所/医院，北京协和医科大学，北京100021
作者贡献：Liu H和Li P对此项工作的贡献相同，并测量了血清和肝组织中的GPC3；Tan YF测定血清GPC3；翟毅参与了患者护理和临床数据收集；Liu H和Zhang LJ观察肝脏病理；李鹏、瞿CF和丁海刚进行了统计分析并撰写了论文；李恩和丁华设计了这项研究；丁浩还担任PI。通信地址：中国首都医科大学北京佑安医院肝肠病学系医学博士丁慧国，邮编：100069。nc.moc.liamdem@ougiughnid公司
电话：+86-10-83997155传真：+86-10-163295525
2010年5月1日收到；2010年5月27日修订；2010年6月3日接受。
版权©2010百色鼎出版集团有限公司。保留所有权利。 摘要
目的：探讨血清和肝脏中GPC3对原发性肝细胞癌（HCC）的诊断价值。
方法：测定75例原发性肝癌和32例肝硬化患者血清GPC3和甲胎蛋白（AFP）水平。用免疫组织化学方法检测58例肝癌和12例肝硬化组织中GPC3和AFP的表达。
结果：当血清GPC3的临界值为300 ng/L时，其对肝癌的敏感性和特异性分别为47.0%和93.5%。根据巴塞罗那临床肝癌分期系统，14例HCC分期患者中，50%（7/14）患者的血清GPC3水平高于300 ng/L，任何患者的血清AFP水平均不≥400μg/L。血清AFP和GPC3联合检测可显著提高HCC的诊断敏感性。GPC3在肝癌细胞的细胞质中表达，而在良性肿瘤的肝细胞和胆管中未表达。在58例HCC患者中，血清AFP水平≥400μg/L的患者中，GPC3表达率为100%（28/28），AFP水平<400μg/L的患者为90%（27/30）。GPC3在所有癌旁组织和肝硬化组织样本中均呈弱表达或阴性表达。AFP阳性的HCC细胞仅见于58例HCC患者中的1例。
结论：GPC3蛋白是诊断早期HCC的敏感而特异的血清标志物。其在肝组织中的表达可用于区分肿瘤细胞和良性肝细胞。
关键词：肝细胞癌，α-胎蛋白，Glypican-3，诊断
简介
原发性肝细胞癌（HCC）患者的预后通常很差，5年生存率低于10%-15%，因为大多数患者是在晚期使用当前策略诊断的[1,2]. 对于确诊的肝癌患者来说，手术切除仍是最常用的治疗方法[三]. 因此，早期发现和诊断HCC将具有巨大的临床效益。筛查策略是确定可以成功治疗的小肿瘤。目前，我国已建议肝硬化患者每隔6个月检测血清甲胎蛋白（AFP）和超声检查[4,5]. 由于血清AFP水平升高与HCC的发生有关，自20世纪80年代以来，人们提出通过定期检测AFP来筛查和监测高危患者中的HCC[5-7]. 根据中国肝癌学会2001年制定的原发性肝癌临床诊断和分期标准指南，中国肝癌诊断的临界值为400μg/L[8]. 然而，25%-30%的确诊HCC患者AFP水平正常（<20μg/L）或40%-50%的HCC患者血清AFP水平较低（>20μg/L-<400μg/L[1,2]. 另一方面，约20%-25%的慢性肝炎、肝硬化和其他肝病患者的AFP水平可达到2500μg/L[9-11]. 虽然超声检查已广泛应用于肝癌的临床筛查，但它高度依赖于操作者的经验[三,5]. 因此，由于甲胎蛋白（AFP）和超声在肝癌筛查中的作用有限，一些候选的生物标志物可用于肝癌的诊断，包括glypican-3（GPC3）。GPC3是一种硫酸乙酰肝素蛋白多糖，通过糖基磷脂酰肌醇锚定（GPI）结合到细胞表面，在胎儿中高度表达，但在成人肝脏中不表达。已有研究表明GPC3与HCC密切相关[9,12]. 据报道，在AFP阴性的HCC患者中GPC3的表达频率高达90%，这表明它可以用于HCC的诊断[13,14]. 然而，肝癌患者不同阶段血清GPC3及其在肝组织中的表达尚未得到充分研究。因此，本研究探讨了血清GPC3在肿瘤/癌旁组织中的表达对HCC诊断的价值。
材料和方法
患者
本研究招募了2006年1月至2008年12月在首都医科大学北京佑安医院住院的107名患者，并将其分为肝癌组(n个=75）和肝硬化组(n个=32），男女比例分别为55:20和24:8。根据中国肝癌学会2001年制定的原发性肝细胞癌临床诊断和分期指南中的以下至少一项标准对肝癌进行诊断[8]（1）肝占位性病变，血清AFP水平≥400μg/L；（2）血清AFP水平<400μg/L，但有新的肝脏占位性病变，CT或磁共振成像显示动脉期增强。根据巴塞罗那临床肝癌（BCLC）分期系统分期HCC[15]. 根据体格检查、实验室检查、B超或计算机断层扫描（CT）诊断为肝硬化。肝硬化组患者至少随访2年。该研究得到首都医科大学北京佑安医院伦理委员会的批准。研究人员向所有患者和/或其亲属详细解释了情况。招募时获得了所有患者的书面同意。
血清和肝组织样本
从患者身上采集血清样本。临床实验室检测HBV和HCV感染标志物。使用罗氏诊断公司（中国上海）的试剂和科华公司的HBV-DNA，通过HBsAg的存在来确定HBV感染。HCV感染是通过使用Diasorin有限公司（中国上海）的试剂和中山大学（中国广州）大安基因有限公司的HCV-RNA检测是否存在抗-HCV。血清样品储存在-20°C下，用于测量血清AFP和GPC3水平。58例HCC和12例肝硬化患者的肝组织标本和活检针均固定在4%聚甲醛中，并用石蜡包埋。
血清AFP和GPC3水平的测定
按照制造商的说明，分别通过电化学发光法（美国雅培公司）和酶联免疫吸附测定法（ELISA；美国BioMosaics公司）测量血清AFP和GPC3水平。使用分光光度计（瑞士Multiskan Ascent V1.24）检测光密度（OD）值。
免疫组织化学染色检测AFP和GPC3的表达
免疫组织化学（IHC）染色检测肝组织和肝穿刺活检标本中GPC3的表达。根据WHO标准指南，对载玻片进行审查，以确认HCC的诊断[16]. 在IHC染色中使用小鼠单克隆抗GPC3抗体（克隆号：sc-65443 1G12，Santa Cruz Inc.，USA）和小鼠多克隆抗AFP抗体（Neomarker Inc.，USA）。正常小鼠血清作为阴性对照。简言之，将组织切片脱蜡，再水化，并使用10 mmol/L柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中的热诱导表位回收抗原。用过氧化物酶封闭后，用1:50稀释的一级抗体孵育切片。使用的二级抗体是一种辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体（中国北京中山金桥）。结果由北京佑安医院的病理学家进行评估。观察到五个高视野，每个视野中不少于1000个细胞。细胞质中带有黄色或棕色颗粒的细胞被视为阳性。
统计分析
所有分析均使用SPSS for Windows（11.5版）进行。数据表示为平均值±SD。χ2测试和学生t吨测试分别用于比较两组中分类变量和连续变量的分布。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
结果
患者的临床数据
本研究招募的107名患者均为中国人。他们的临床数据如表所示患者分别被诊断为HBV相关HCC（84%）和HCV相关HCC（16%）或肝硬化（78.1%和29.1%）。两组HBV感染情况无显著差异。本研究未发现HBV和HCV双重感染患者。在75名临床诊断的HCC患者中，14名患者处于BCLC-A期，23名患者处于B期，16名患者处于C期，22名患者处于D期。
表1
| 诊断 | 数字一 | 年龄（年）一 | 乙型肝炎病毒感染一 | HCV感染一 | BCLC阶段A | BCLC阶段B | BCLC级C+D |
| 肝癌 | 75（男：55，女：20） | 55.4 ± 9.91 | 84.0% (63/75) | 16.0% (12/75) | 18.7% (14/75) | 30.7% (23/75) | 50.7% (38/75) |
| 肝硬化 | 32（男：24，女：8） | 53.3 ± 5.81 | 78.1% (25/32) | 21.9% (7/32) | |
血清AFP水平在早期HCC诊断中的局限性
AFP被广泛用作原发性肝癌诊断的生物标志物。根据中国肝癌学会2001年制定的原发性肝细胞癌临床诊断和分期标准指南，将临界值设定为400μg/L。所有肝硬化患者的血清AFP水平均低于400μg/L，只有28名HCC患者（37.3%）的AFP水平≥400μg/L（图). 在14例肝癌患者中，没有一例患者的血清AFP水平在BCLC-A期≥400μg/L，只有7例患者（30.4%）在BCLC-B期。在AFP水平≥400μg/mL的患者中，阳性率仅为18.9%，但在BCLC-C期和D期患者中阳性率增至55.3%（图). 比较肝硬化和肝癌患者在BCLC分期A和B时的AFP水平（图). 在32名肝硬化患者中，2名肝硬化进展为肝癌的患者的AFP水平高于未进展为肝癌者。在不同BCLC分期的HCC患者中，AFP对HCC诊断的敏感性没有显著增加。
107例肝硬化或肝癌患者在巴塞罗那临床肝癌晚期（A）和早期（B）阶段的血清甲胎蛋白水平。每个点代表一名患者。甲胎蛋白；HCC：肝细胞癌；BCLC：巴塞罗那肝癌诊所。
血清GPC3水平对早期HCC的诊断价值
通过受试者工作特性（ROC）曲线分析，将GPC3的截止值设置为300 ng/L。在此临界值下，血清GPC3诊断HCC的敏感性和特异性分别为46.7%和93.5%。在32名临床诊断的肝硬化患者中，9.4%（3/32）的患者的血清GPC3水平>300 ng/mL。在早期HCC患者中，7例（50%）患有BCLC A期HCC，9/23例（39.1%）患有BCLC B期HCC，其血清GPC3水平>300 ng/mL（图和). 在GPC3>300 ng/mL的16例患者中，只有3例患者的血清AFP水平≥400μg/L。
巴塞罗那诊所肝癌A期和B期32名肝硬化患者和37名肝癌患者的血清glypican-3水平：每个点代表一名患者；B： 巴塞罗那诊所A期和B期肝癌（HCC）患者中α-甲胎蛋白（AFP）≥400μg/L和glypican-3（GPC3）>300 ng/L的频率。
肝组织中GPC3的表达
所有检查标本均观察到肝硬化。用IHC染色法，即使HCC患者的血清AFP水平≥400μg/L，也很难检测到AFP阳性细胞（图)除1例肿瘤组织标本外。然而，GPC3在癌细胞的细胞质中特异表达，但在癌旁组织样本中不表达或弱表达（图-). GPC3在94.8%（55/58）的HCC组织标本中表达，在28例AFP≥400μg/L的HCC患者和30例AFP<400μg/L.的HCC病人中均过度表达。GPC3在肝癌组织标本中呈阳性表达，在所有肝硬化标本中呈阴性表达。
肝脏样本中glypican-3或α-fetoprotein的免疫组织化学染色。小鼠抗glypican-3（GPC3）（A-C）或AFP（D，4×）染色的肝癌切除标本代表性；B（10×）和c（40×）是A（4×）的放大图像。被黄色或棕色颗粒染色的细胞被视为阳性（箭头所示）。
在针活检样品中也检测到GPC3的表达。标本染色后，一些细胞GPC3阳性，AFP阴性（图-).
针吸活检中glypican-3的免疫组织化学染色。血清甲胎蛋白<400μg/L的肝占位性病变患者的三个组织切片（A-C，10×）Glypican-3在肝细胞癌中呈阳性表达（箭头所示）。
联合血清GPC3和AFP
联合血清GPC3和AFP显著提高了HCC诊断的敏感性。血清AFP对BCLC A+B期HCC诊断的敏感性从18.9%提高到54%，对BCLC C+D期HCC的诊断敏感性从55.3%提高到81.6%（图).
75例不同巴塞罗那临床肝癌分期的肝细胞癌患者血清α-甲胎蛋白≥400μg/L（剥离条）、α-甲蛋白≥400µg/L和glypican-3>300 ng/L（填充条）的频率。甲胎蛋白；GPC3:Glypican-3。
讨论
中国原发性肝癌的主要病因是HBV感染[17,18]. 然而，已有研究表明HCV感染在原发性肝癌的发病机制中起着一定作用[19,20]. 本研究纳入的75例临床诊断HCC患者中，63例为HBV相关HCC。由于HBV感染患者可能会发生HCC，因此中国的HCC筛查也包括慢性HBV携带者，每6个月检测一次AFP水平和超声检查[5].
肝硬化患者肝癌筛查具有成本效益，因为其年发病率超过1.5%[三]. 然而，大多数肝脏肿块/结节性病变是良性的，如肝硬化再生结节、腺瘤和局灶性结节增生，但它们可能与肝脏恶性病变相似[三]. 因此，HCC和良性拟态细胞之间的鉴别诊断是困难的。AFP是HCC筛查和诊断以及高危人群随访中最常用的指标。然而，其对HCC诊断的敏感性仅为30%-40%[2,21]. 在本研究中，血清AFP（≥400μg/L）对HCC的诊断率为37.3%，这与报道的结果一致[22,23]，但低于杨博士的报告（44.6%）[24]. 不同肿瘤大小、数目、分期和病因的HCC患者血清AFP水平存在显著差异[25]. 本研究结果证实，血清AFP（≥400μg/L）不能单独作为HCC，尤其是早期HCC的诊断标志物[26]. 因此，所有这些结果表明，血清AFP水平在HCC尤其是早期HCC的诊断中的作用有限。
最近有报道称，GPC3仅在HCC细胞中检测到，而在良性肝组织中未检测到，因此可以作为早期HCC诊断的潜在生物标志物[9,14,26,27]. 50%的早期HCC患者的血清GPC3水平高于300 ng/L，尽管在本研究中他们的血清AFP水平低于100μg/L，这表明血清GPC3水平在早期HCC的诊断中具有潜在的作用，可以用于HCC的筛查。因此，血清GPC3水平的测量结合B超检查有助于HCC的筛查和诊断以及高危人群的随访。
在本研究中，GPC3在HCC细胞的细胞质中过度表达，但在58例癌旁组织和12例肝硬化组织样本中未表达。90%血清AFP水平<400μg/L的患者中发现GPC3阳性细胞。仅10%的检测样本中GPC3呈阴性表达。由于本研究中的所有HCC患者都伴有肝硬化，因此GPC3的阳性表达率很高，这与报道的数据一致[14]表明GPC3蛋白的表达是诊断HCC的一个敏感和特异的组织学标志物，因此可以用于结节病变的活检。
本研究中肝癌患者的血清GPC3和AFP水平升高。早期HCC患者血清AFP水平<400 g/L时，GPC3蛋白仅在癌细胞中表达，血清GPC3水平升高。GPC3仅在肝癌细胞中检测到，而在良性肝细胞中未检测到。血清GPC3和AFP联合检测对HCC各期诊断的敏感性增加。
总之，GPC3是诊断早期HCC的一种敏感、特异的血清和组织标志物。肝组织中GPC3的过度表达可用于区分肿瘤细胞和良性肝细胞。在诊断HCC时应考虑AFP和GPC3的联合应用。
评论
背景
血清甲胎蛋白（AFP）在肝细胞癌（HCC）的检测和诊断中的作用有限。一些新的候选生物标志物已被研究用于肝癌的诊断。
研究前沿
自2000年以来，AFP阴性HCC患者的肝glypican-3（GPC3）表达频率已增加到90%。然而，血清GPC3及其在肝癌组织中的表达尚未得到充分研究。
创新和突破
GPC3是诊断早期HCC的敏感而特异的组织标志物。肝组织中GPC3的过度表达可用于区分肿瘤细胞和良性肝细胞。AFP和GPC3联合检测和诊断HCC应予以考虑。
应用
本研究结果表明，血清GPC3和AFP联合检测有助于HCC的筛查和诊断以及高危人群的随访。GPC3蛋白是区分肝癌和良性结节病变的敏感而特异的组织学标志物。
术语
GPC3是一种硫酸乙酰肝素蛋白多糖，通过糖基磷脂酰肌醇锚定结合到细胞表面，在胎儿中高度表达，但在正常成人肝脏中不表达。
同行评审
这是一项直接而有效的研究。结果表明，血清GPC3和AFP联合检测有助于HCC的筛查和诊断以及高危人群的随访，作者认为GPC3蛋白是区分HCC和良性结节病变的敏感而特异的组织学标志物，从而为早期肝癌的诊断做出贡献。
脚注
国家重点传染病专项（No.2008ZX10002-015）资助；北京市卫生局首都医疗发展重点项目2007-1021号
同行评审人：Emmet B Keeffe，医学博士，教授，肝病学主任，肝移植项目医学主任，斯坦福大学医学中心胃肠研究项目主任，地址：750 Welch Road，Suite 210，Palo Alto，CA 94304，United States
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