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人类基因治疗。2008年10月；19(10): 979–990.
2008年10月7日在线发布。 数字对象标识：10.1089/hum.2008.107
预防性维修识别码：项目经理2940541
PMID：18774912

Leber先天性尿尿症的治疗RPE65型视网膜下注射腺相关病毒基因载体致突变：一期试验的短期结果

威廉·豪斯沃思,1,,2 托马斯·S·阿莱曼,三 沙利什·考沙尔,1 阿图尔·西德西扬,三 莎朗·施瓦茨,三 王丽丽（Lili Wang）,4 托马斯·康隆,1 桑福德·L·博伊,1 特伦斯·R·弗洛特,5 巴里·J·伯恩,1,,2和塞缪尔·雅各布森通讯作者三
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关联数据

补充资料

摘要

Leber先天性黑蒙（LCA）是一组无法治愈的常染色体隐性致盲性视网膜疾病。一种分子形式是由RPE65型（视网膜色素上皮特异性65-kDa）基因。重组腺相关病毒血清型2（rAAV2）载体，改变后携带人类RPE65型基因（rAAV2-CB某人-小时RPE65型)，恢复RPE65缺乏动物模型的视力。设计了一项临床试验来评估rAAV2-CB的安全性某人-小时RPE65型在具有RPE65型-生命周期评价。三名年轻人（21-24岁）RPE65型-LCA接受单眼视网膜下注射5.96×1010对150μl的载体基因组进行研究，并随访90天。主要结果是眼部安全性，通过临床眼部检查进行评估。视力和暗适应全视野敏感度测试（FST）检测视功能；光学相干断层扫描（OCT）监测视网膜中央结构。未检测到载体相关的严重不良事件或全身毒性。视力与基线无显著差异；一名患者在OCT检查中发现中心凹处视网膜变薄。所有患者自我报告，与对照眼相比，研究眼的视觉敏感性增加，尤其是在环境光照减少的情况下更为明显。比较基线检查和治疗后30-90天的暗适应FST结果。对于研究眼睛来说，与平均基线相比，敏感性增加非常显著(第页 < 0.001); 然而，对于对照眼，敏感性变化并不显著(第页 = 0.99). 本研究与其他两项眼部基因治疗的研究进行了比较RPE65型-同期进行并报告的生命周期评价。

介绍

我慢性遗传性视网膜失明当眼部基因治疗的早期结果在两项临床试验中被报道时，首次成为可治疗的，每项试验治疗三名患有Leber先天性黑蒙（LCA）的成人受试者，该黑蒙是由眼部基因突变引起的RPE65型基因（班布里奇等。,2008; 马圭尔等。,2008). RPE65（视网膜色素上皮特异性65-kDa等。,2007). 这些临床试验公告是在多年的基础科学和应用科学研究RPE65型-LCA（例如，雷蒙德等。,1998; 阿克兰等。,2001,2005; 德尼卡等。,2004; 庞等。,2005; 雅各布森等。,2005)、剂量-疗效和安全性研究（雅各布森等。,2006年a,b条)和视网膜功能-人类疾病的结构和视觉通路研究（雅各布森等。,2005,2007,2008; 阿吉雷等。,2007).

尽管在两项已发表的临床试验中，受试者的疾病诊断和年龄有相似之处，但结果及其解释存在重大差异（Miller，2008). 本研究报告了一项独立的视网膜下基因治疗临床试验，试验对象为三名患有RPE65型-与上述两项已发表研究同时进行的生命周期评价。对这三项试验的结果进行了比较，为这些通过体细胞基因疗法治疗罕见常染色体隐性遗传眼病的早期举措增加了数据和前景。

材料和方法

监管批准和监督

该临床试验正在宾夕法尼亚大学Scheie眼科研究所（宾夕法尼亚州费城UP）和佛罗里达大学/Shands儿童医院（佛罗里达州盖恩斯维尔）进行。试验以符合ICH-E6良好临床实践指南文件的方式进行，并已由美国食品和药物管理局（新药研究申请BB-IND 12824）和美国国立卫生研究院重组DNA咨询委员会（协议号0410-677）审查。获得了UP和UF机构审查委员会（IRB）和机构生物安全委员会（IBC）、UP副院长研究审查委员会、西部IRB和UF普通临床研究中心的批准。由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）任命的数据和安全监测委员会（Data and Safety Monitoring Committee）负责监测该试验。正在遵循《赫尔辛基宣言》的原则。获得知情同意，受试者与决策监督员交谈，以确保参与的自愿性质。由于严重的视觉异常，所有患者在正式登记前至少2周收到书面和记录版本的知情同意书，以加强对试验的详细了解，并允许形成和提出所有问题。

研究资格和方案

三名年轻成人受试者被诊断为LCA。RPE65型这些突变是由爱荷华大学（爱荷华州爱荷华市）约翰和马西亚·卡弗非营利基因检测实验室测定的。纳入和排除标准列于补充表1（请参见www.liebertonline.com/hum). 协议研究访问摘要见补充表2（请参见www.liebertonline.com/hum).

cGMP载体的生产、纯化和滴度

重组腺相关病毒（rAAV）载体AAV2-CB某人-小时RPE65型（雅各布森）等。,2006年a). 载体按照临床良好生产规范（cGMP）进行包装和纯化。简单来说，HEK-293细胞（腺病毒血清型2[Ad2]，E1A+E1B公司+)与pDG包装质粒共转染，该质粒编码包装所需的其他三个腺病毒基因（E2A、VA和E4）和AAV2代表和帽子基因，以及之前发表的AAV载体质粒（Grimm等。,1998). 通过全柱纯化方法（Snyder和Flotte，2002; 斯奈德和弗朗西斯，2005; 佐洛图金等。,2002). 载体的滴度表示为载体基因组（VG），通过斑点试验（Zolotukhin）测定等。,2002).

病媒管理

每个受试者均选择视觉功能较差的眼睛进行媒介管理。在轻度静脉镇静后，手术眼接受球后麻醉，然后以标准无菌方式进行准备和覆盖。进行标准的三端口23号核心和外围玻璃体切除术。用Westcott剪刀和.3把镊子解剖右侧巩膜切开术上的结膜。止血是通过橡皮擦头烧灼来维持的。用20号MVR刀片扩大巩膜切开术，以便将视网膜下插管轻松插入眼睛。将载体吸入一个39 g的注射套管（密苏里州奥法伦市Synergetics），并导入视网膜下间隙。手术结束时，用7.0条Vicryl缝合线固定巩膜切开部位，用间断缝合线闭合结膜。使用结膜下抗生素和类固醇。术后20天使用局部抗生素和类固醇。

安全参数

在两次基线检查时，即在治疗后的前10天每天，以及在第14、20、30、60和90天，通过标准眼科检查评估眼部安全性。为了量化炎症反应的严重程度，使用了标准分级系统（Hogan等。,1959; 努森布拉特等。,1985; 拉扎斯等。,2005). 为了记录眼底外观，在基线检查和治疗后就诊时拍摄眼底照片（使用红外相机避免过度可见光照射）。在两次基线评估时，每天给药10天后，以及给药后30天和90天，通过体检评估系统安全性。常规血液学、血清化学、凝血酶原时间（国际标准化比值[INR]）、部分凝血活酶时间和尿液分析作为基线评估的一部分，在载体给药后1、3、10、30和90天进行。

抗-AAV2抗体滴度

在基线检查时以及第14天和第90天，对患者的血清样本进行AAV2衣壳蛋白循环抗体检测。简单地说，96块钢板涂有1.2×109在4°C下过夜，每个孔的AAV2颗粒。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）–吐温清洗，然后用10%胎牛血清在37°C下封闭2小时（Cellgro；Mediatech，Herndon，VA）。在用PBS–Tween进行1次洗涤后，将样品和已知阳性人类标准物稀释至1:10至1:10240之间，并在4°C下过夜粘合。每种样品均一式两份。洗涤后，在37°C下以1:50000的稀释度添加检测抗体（山羊抗人免疫球蛋白，与辣根过氧化物酶结合[HRP]；Biosource International/Invitrogen，Camarillo，CA）2小时。最后，清洗平板并将其暴露于四甲基-联苯胺（TMB）过氧化物酶检测底物（马里兰州盖瑟斯堡KPL）中，并使用酶联免疫吸附测定（ELISA）平板阅读器（加利福尼亚州桑尼维尔Molecular Devices）在450 nm处读取。然后根据来自同一平板的人类标准曲线读取样本抗AAV2滴度。我们没有对载体转基因的抗体进行检测。由于没有人RPE65的人抗体可用作阳性对照，用以在ELISA中构建针对载体转基因抗体的相关校准曲线，因此患者样本的阴性结果不能可靠解释。

抗原特异性反应

如前所述，评估抗-AAV2抗原特异性淋巴细胞增殖反应（Hernandez等。,1999). 从血液中分离纯化后，在1×10596周圆底培养板中200μl RPMI 1640培养基（10%人血清）每孔的细胞数。将淋巴细胞分为四组，每组有三个（对照）和六个（未知）培养物：未刺激（作为阴性对照）、用AAV2刺激（5000个粒子/细胞）、用AA V2（500个粒子/电池）刺激和用AAV2（50个粒子/电子）刺激。孵育5天后，刺激指数（SI）定义为：（每分钟平均计数[三H] 来自刺激细胞的胸腺嘧啶）/（每分钟平均计数[三H] 来自未刺激细胞的胸苷）。根据另一项（非眼科）研究的抗原特异性淋巴细胞增殖反应（ASR）基线结果，SI值大于2.0（Branty等。,2006)或3.0（埃尔南德斯等。,1999)被认为是重要的。每种淋巴细胞培养物的活性均由阳性对照物证实，阳性对照物对植物血凝素（PHA）（10、1.0和0.1μg/ml）和丝裂原诱导的增殖有反应白色念珠菌。

外周血中的AAV DNA

描述了生物分布研究的程序（Song等。,2002). 简言之，在所有定量聚合酶链反应（PCR）中使用1μg提取的基因组DNA；反应条件遵循Applied Biosystems（加利福尼亚州福斯特市）推荐的条件，包括50个循环，94°C 40秒，37°C 2分钟，55°C 4分钟，68°C 30秒。引物对设计用于巨细胞病毒（CMV）增强子/鸡β-肌动蛋白启动子（Donsante等。,2001)和标准曲线是通过携带相同启动子的质粒DNA（CBAT）和α1-抗胰蛋白酶cDNA（Song等。,2002). DNA样品分为三份进行分析。第三个复制品以100拷贝/μg基因组DNA的比率加入CBAT DNA。如果检测到至少40个DNA尖峰拷贝，则认为DNA样本可用于报告载体DNA拷贝。当该样本中发现的载体DNA拷贝数>100拷贝/μg时，该样本被视为阳性，并报告了每微克的测量拷贝数。如果存在<100拷贝/μg，则认为样品为阴性。当分析少于1μg的基因组DNA以避免PCR抑制剂与提取组织中的DNA发生共铜化时，插入拷贝数按比例减少，以保持100拷贝/μg DNA的比率。在第一次基线检查以及注射后第1、3和14天测定血液中的生物分布。

干扰素-γ酶联免疫斑点试验

血液样本通过静脉穿刺采集，使用肝素作为抗凝剂，然后隔夜运送（基线和第14天样本）或立即运送（第90天样本）到UP的测试实验室。通过Ficoll-Paque梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMC）（GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ）。所有样本在收到时进行处理，并在酶联免疫斑点（ELISpot）分析中作为新鲜样本进行评估（见下文），或在液氮中冷冻保存以供稍后测试。如果冷冻保存，PBMC样品在分析之前在37°C的完整R10培养基（RPMI 1640和10%FBS）中培养过夜。

根据之前描述的方案（Fu）进行干扰素（IFN）-γELISpot分析等。,2007). 以2×10的密度添加PBMC5每孔细胞数，并在37°C下用源自2μg/ml浓度的AAV2 VP1蛋白的肽库刺激18–20小时。单独培养基作为阴性对照，PHA作为阳性对照。此外，对CEF（瑞典斯德哥尔摩Mabtech）的反应作为参考，CEF含有23种MHC类I限制性肽（Mabtech），代表人类常见病毒（巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒和流感）的T细胞表位，并且能够与广泛的HLA分子结合。肽库合成为15个单体，与前一肽有10个氨基酸重叠（Mimotopes，Clayton，Victoria，Australia）。AAV2 VP1肽库分为三个池，其中池2A包含AAV2 VPN1的前50个肽，池2B包含肽51–100，池2C包含肽101–145。使用ELISpot阅读器（AID Diagnostika，Strassberg，德国）计算斑点数。肽特异性细胞表示为每10个斑点形成细胞（SFC）6PBMC。对任何肽库的阳性反应被任意定义为背景值的三倍（单独培养基对照），反应超过55个SFC/106PBMC。

视觉功能和视网膜结构

使用ETDRS视力（Ferris等。,1982)和暗适应全场灵敏度测试（FST；Roman等。,2005,2007年b). 简言之，在受试者暗适应1小时后，用蓝色刺激进行FST。在每个患者中，在手术前6个月的窗口期内，在不同的日子获得了四次预处理访视的基线数据。术后3个月内获得治疗后数据。对于每个疗程，平均FST敏感性被定义为四个最高记录敏感性的平均值。FST敏感度变化定义为每次治疗之间的符号差异和每只眼睛的平均基线敏感度；积极的变化意味着进步。通过t吨合并后和预处理会话之间的测试。当治疗前后的总体差异具有统计学意义时，对每个患者进行进一步的事后配对比较。

使用光学相干断层扫描（OCT）通过横断面成像评估视网膜结构。使用傅里叶域OCT仪器（RTVue-100；加利福尼亚州弗里蒙特Optovue），通过超高速和高分辨率OCT成像获取数据。FD-OCT系统的高清线路协议（HD线路）用于获得4.5 mm长的重叠水平扫描，由每秒26000次A扫描获得的4096次A扫描组成。线扫描的横向采样密度通过对八组相邻的A扫描进行平均来降低，以提高信噪比，并使用动态互相关算法（Huang等。,1998)和数字缝制（阿勒曼等。,2008). 按照所述进行中心凹厚度测量（桑德伯格等。,2005).

结果

研究人群

这三名受试者的年龄从21岁到24岁不等，都有LCA的临床诊断。分子研究表明，有两名受试者是RPE65型基因和一个受试者是复合杂合子(表1). 此前曾报道这些突变与LCA（Morimura）有关等。,1998; 汤普森等。,2000; 洛伦兹等。,2000; 西莫维奇等。,2001; 费利乌斯等。,2002; Yzer公司等。,2003; 布依等。,2005)并且通过在体外研究（雷蒙德等。,2005; 高桥等。,2006).

表1。

的结果比较RPE65型-LCA临床试验

 基线年龄（岁）/性别RPE65突变随访（月）麻醉载体剂量输送体积（ml）喷射位置全身免疫抑制眼部并发症报告进入视力（研究眼）治疗后视力视为视力显著变化昏暗灯光下的患者视力（自我报告）
当前研究
 第1页24小时/月第417页/第417页三L（左）5.96 × 10100.15M（M）不英尺20/240一20/317不+
 第2页23楼R44Q/R91W型三L（左）5.96 × 10100.15装货单不不20/195一20/138不+
 第3页21个月Y368H/Y368H三L（左）5.96 × 10100.15T型不不20/283一20/191不+
班布里奇等。(2008)
 患者123/M月年368小时/年368小时12克1.0 × 10111M（M）是不20/28620/145不数控
 患者217楼IVS1+5G>A/G40S12克1.0 × 10111M（M）是不20/66220/662不数控
 患者318/M月E6X/D167Y系列6克1.0 × 10111M（M）是不20/11520/115不+
马奎尔等。(2008)
 患者1b条26楼E102K/E102K4.75克1.5 × 10100.15序号是不<20/2000年20/1050是+
 患者2b条26/M月E102K/E102K2.75克1.5 × 10100.15M（M）是MH公司<20/200020/710负极是+
 患者319楼R234X/R234X1.25克1.5 × 10100.15M（M）是不20/64020/290是+

缩写：LCA、Leber先天性黑蒙；五十、 局部；G、 全身麻醉；M、 黄斑，包括中央凹；ST，颞上视网膜；SN，上鼻视网膜；T、 颞视网膜；MH，黄斑裂孔；FT，中央窝变薄；NC，无变化；NM，未测量； +, 患者报告病情好转。

一两个基线测量值的平均值。折射误差：P1=-0.25+1.50×090；P2=−1.50+0.50×075；P3=−2.70+1.75×100。
b条兄弟姐妹。

病媒管理和安全

显示了正常眼底的红外视图，主要的视网膜标志物包括视神经头、中央凹和黄斑，定义为视网膜的中心5.5–6毫米（直径）（霍根等。,1971)，已指示(图1). 图中还显示了每个受试者视网膜下注射造成的视网膜脱离的位置。治疗眼为P1的左眼，P2和P3的右眼；允许比较图1，所有图像都显示为左眼。P1尝试了两次注射：第一次，在上黄斑区附近进行视网膜切开术，没有引起视网膜脱离；第二种方法是在黄斑区进行颞下视网膜切开术，达到了输送150μl载体的目的。视网膜脱离累及下黄斑区（包括中央凹）并向下延伸。P2在黄斑上方和颞侧进行了一次视网膜下注射。视网膜脱离从中央凹延伸到颞上视网膜，不包括中央凹。P3有三次尝试注射：两次尝试在黄斑外颞上视网膜的同一视网膜切开部位注射，均未能导致视网膜脱离；第三个注射点低于原始注射点，几乎是直接注射。视网膜脱离从中央凹延伸到颞部黄斑外视网膜。P2对远周边上视网膜的玻璃体视网膜标记进行激光治疗。P3对视网膜切开部位进行了非常轻的激光治疗，但没有产生视网膜脱离。

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正常受试者和P1、P2和P3的近红外眼底图像RPE65型-生命周期评价。黄斑由正常图像上的一个圆圈定义；指示了中央凹（F）和视神经头。个别患者图像上的圆点表示手术时从图纸上估计的视网膜脱离面积。白色“注射器”表示视网膜切开术产生脱离的部位。所有图像都描述为左眼，以便进行比较。

所有三名患者在术后5-6小时吸收了大部分视网膜下液。手术中没有视网膜撕裂或其他并发症。检眼镜检查至少1个月后仍能看到视网膜切开部位。没有任何患者出现眼内炎症的临床证据；结膜炎症在第一个月内缓慢减轻，研究人员在60天及之后进行评估时眼睛保持安静。

所有受试者在视网膜基因转移后的血液学、血清化学、凝血参数和尿液分析均未出现临床显著异常。

免疫应答分析和外周血的载体生物分布

通过测量基线时、治疗后第14天和90天AAV血清2型衣壳的循环抗体水平来监测体液免疫应答(图2A). 对于P1和P3，所有时间点的AAV2抗体滴度均无显著变化。与基线检查或第14天相比，P2在第90天的滴度增加了4.5至7.5倍，但她的第90天滴度（168700 mU/ml）与同时从79个独立样本中测定的P3基线值（118861 mU/ml）和平均滴度（1042089 mU/m1）的16%相似。

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术前（基线）和术后14天和90天进行免疫检测。(A类)通过测定每个受试者手术前后抗AAV2衣壳的循环血清抗体滴度，检测对AAV2血清型（AAV2）的体液免疫应答。垂直轴上的箭头表示正常参考人群的平均水平(n个 = 79). (B类)在存在与不存在AAV2衣壳抗原的情况下孵育的外周血淋巴细胞中测定抗原特异性淋巴细胞增殖反应（ASR）。刺激指数（[三H] 手术后，将每个研究对象在有抗原时的胸腺嘧啶核苷摄取量与无抗原时的摄取量进行比较。(C类)外周血单个核细胞（PBMC）对AAV2衣壳的T细胞免疫应答。用三个AAV2衣壳肽池（2A、2B和2C）刺激术前和术后从每个研究对象分离的PBMC，并用ELISpot检测IFN-γ分泌。每10个斑点形成细胞（SFC）的数量6将手术前后PBMC与阴性对照组（单独培养基）进行比较；对CEF池的响应作为参考。

在基线检查时以及治疗后第14天和第90天，还监测了外周血淋巴细胞（ASR）的AAV2衣壳特异性反应(图2B). P1和P3在任何时间点的刺激指数（SI）均无显著升高。第90天的P2显示，从基线SI 1.89略微增加SI 2.10（SI的最小显著性水平为2至3）。

用IFN-γELISpot检测法监测T细胞对AAV2衣壳的免疫应答。在基线检查时以及治疗后第14天和第90天，用AAV2肽库刺激受试者的PBMC，并检测IFN-γ分泌。三名受试者在任何时间点对AAV2肽库均无阳性反应(图2C).

通过定量PCR（Poirier）监测载体在外周血中的生物分布等。,2004)在基线检查时以及治疗后第1、3和14天。所有患者在所有时间点均未检测到载体基因组拷贝。

视觉功能和视网膜结构

所有三名患者都注意到研究眼睛的光敏感度增加，但程度不同。这些观察结果在低环境光照条件下以及使用对照眼作为对照时最为明显。P1描述了研究眼睛视觉中心周围具有较高光敏度的小区域，也报告了这只眼睛的清晰度下降。P2注意到研究眼睛的注视点下方有一个光敏度增加的区域。P3描述了研究眼睛鼻部视野的宽区域的光敏感度显著改善。

绘制了所有患者的研究眼和对照眼的视力(图3A和C). P1是唯一一个注射了包括中央凹在内的药物的受试者，术后视力恢复时间最长。90天时，结果仍比基线测量值的最低值低三个字母。P1已恢复到基线水平，使用3行（对应15个字母）的传统统计限值，视敏度损失或增加显著（筛选等。,2006). P2显示视力恢复更快，并恢复到基线。P3术后视力几乎没有下降，仍保持在基线水平(图3A). 所有对照眼在术后90天内保持不变(图3C).

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中央视力和视网膜结构RPE65型-LCA患者。(A类)在P1、P2和P3的研究眼睛中，视力是手术前（基线）和手术后（0）时间的函数。(B类)OCT在手术前和手术后90天对研究眼睛进行水平经线扫描。(C类)视力和(D类)对照眼OCT扫描进行比较。箭头、视网膜前膜（在所有扫描中均可检测到）。

OCT研究了所有受试者视力测量的视网膜解剖学基础(图3B和D). 所有受试者的对照眼在治疗前和治疗后90天的中心凹厚度差异从1.1到6.2μm不等，均在视网膜变性人群访视间变异性的98%可信限内（±16.7μm；桑德伯格等。,2005). 在P2和P3的研究眼睛中，治疗前和治疗后90天之间也没有显著差异（P2，4.1μm；第3页，8.2μm）。然而，P1在治疗前和治疗后的中心凹厚度之间显示出80.3μm的研究眼睛的显著差异。扫描检查显示，P1研究眼手术前的中央凹结构没有显示出典型的正常凹陷。这种异常可能是由于视网膜前膜引起的，或如在其他视网膜变性中所观察到的那样，中央穆勒胶质细胞可能肿胀所致（雅各布森等。,2006年c). 然而，有证据表明，所有患者术前和术后的所有眼睛都有视网膜前膜（箭头，图3B和D). 术后90天，P1的中央凹有更典型的凹陷，但总体厚度减少。

为了量化患者观察到的研究眼睛（在弱光条件下）光敏感性增加的情况，我们用FST测量了暗适应视觉敏感性(图4)，一种专为严重失明患者设计的心理物理测试（罗马等。,2005,2007年b). 在早期的研究中，未经治疗RPE65型-LCA受试者对全场光刺激的反应显示出视觉敏感性，与正常受试者相比，全场光的反应降低了3-4个对数单位（Aguirre等。,2007); 当前研究中的三名患者显示出类似的预处理结果(图4A). 基因治疗后，对照眼没有表现出一致的敏感性变化；研究眼睛在手术后立即表现出敏感性降低，并在第一周内恢复正常（数据未显示）。将第30天、第60天和第90天获得的敏感性进行汇总，并与预处理获得的汇总敏感性进行比较。与基线相比，研究眼睛的敏感性持续增加；对照眼的变化不一致(图4A). 为了使眼睛之间的预处理差异正常化，根据平均预处理基线计算灵敏度变化。敏感性变化非常显著(第页 < 0.001）作为一个组的所有研究眼睛(图4B，右）；在第30天到第90天之间，敏感性没有明显的变化趋势。对于对照眼(图4B，左），敏感性变化不显著(第页 = 0.99). 个别患者的事后分析显示，三名患者的对照眼无明显变化；然而，P1和P2的研究眼睛显示出显著的(第页 = 0.04和第页 = 分别为0.002）治疗后平均基线敏感性的阳性变化；P3变化不显著(第页 = 0.07).

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对三名患者的研究和对照眼进行术前和术后30至90天的暗适应全视野敏感性试验（FSTs）。(A类)研究组和对照组患者术前四次就诊与术后三次就诊的平均FST敏感性及其变异性（误差条，SD）。FST的正常范围沿水平轴显示（罗马等。,2007年b; 阿吉雷等。,2007). (B类)术后平均基线敏感性的变化显示，与对照眼或预处理的阳性和阴性变化相比，研究眼的所有阳性数字。每个患者术后显示的三组条形图表示第30天(顶部), 60 (中间的)、和90(底部).第页值参考t吨显示了术前和术后合并结果之间的测试统计数据。

讨论

九点后学到了什么RPE65型-代表三项不同研究的LCA年轻成人患者接受了单眼视网膜下基因治疗，并接受了至少1.25个月的监测（Maguire等。,2008)最多1年（班布里奇等。,2008) (表1)? 迄今为止，还没有证据表明任何患者的载体视网膜注射具有全身毒性。基因治疗试验中对免疫反应的关注度很高（在Zaiss和Muruve，2008). 所有三个RPE65型-LCA试验进行了研究，以确定对AAV2的体液免疫反应，并通过ELISpot检测T细胞介导的反应。在每种情况下都没有明显的阳性结果。在AAV2衣壳刺激淋巴细胞增殖的ASR试验中，一名患者在90天的时间点表现出的刺激指数刚刚超过先前确定的显著水平之一（Brantly等。,2006)但不是另一个（埃尔南德斯等。,1999). 该值仅略高于基线值，其相关性目前尚不清楚。该患者的ASR刺激指数将在随访时重新评估（见补充表2)更好地理解这些结果及其随时间的变化。然而，总的来说，考虑到每项研究中视网膜下注射的小剂量与非眼部基因治疗试验中常用的rAAV2载体剂量相比，几乎没有任何患者的免疫反应是可测量的，这一事实可能并不奇怪；这些通常高出2-4个数量级。此外，后眼空间的相对免疫特权也得到了很好的认可（斯特雷林，2003)并可能进一步限制对视网膜下rAAV2载体的任何潜在免疫反应。

未来的关键问题RPE65型生命周期评价临床试验关注当前三项试验的结果如何与每种情况下递送的载体的各自滴度相关。不幸的是，在这种分析中，至少有四种与向量直接相关的不确定性，这在很大程度上排除了任何明确的结论。首先，每项研究都在不同的设施中使用不同的方案制作、纯化和滴度载体，而不参考共同的标准或彼此的载体。因此，每种规定的滴度与其他两种滴度之间不存在置信度。第二，在所有三项研究中，RPE/神经视网膜暴露于注射滤泡内载体的面积并不相同，甚至是不可知的，这对于估计每个RPE细胞载体颗粒的有效“感染多重性”是必要的。本次试验以及马奎尔和同事(2008)提供了150μl的容量，可以进行比较（但请参阅前面和后面的信息）。在班布里奇和同事(2008)将1ml载体输送至视网膜下，然后通过气体操作将产生的滤泡移到一个未知的、也许是未知的视网膜区域，以使每个患者的中心凹暴露于载体。注射后对载体滤泡的这种操作实际上会将任何重新定位滤泡内的载体滴度降低未知量，因为载体与初始分离区域中的RPE细胞和感光细胞结合。此外，当最初的气泡被重新定位到其最终位置时，当气泡在它们之间转移时，向量将与新暴露的RPE和感光体结合。因此，很难估计气泡最终位置的矢量有效量。第三，三种载体中的每一种都是用控制人类RPE65 cDNA表达的不同调节元件构建的。马奎尔和同事(2008)与本试验一样，使用了CBA启动子，但在RPE65 cDNA（Bennicelli等。,2008)不同于本试验中使用的自然起始序列。虽然声称可以优化转基因表达，但使用包含自然起始序列的类似载体进行的并行实验没有报道。Bainbridge及其同事使用了一种短的RPE65启动子，尽管该启动子主要靶向RPE细胞表达，但相对于RPE细胞中CBA启动子驱动的表达，其转录强度未知。因此，三种载体在全载体基因组基础上的相对表达强度无法可靠评估。第四，如前所述，每项试验中各组患者在基线检查时的视觉功能存在巨大差异，这可能表明RPE细胞与感光细胞与视网膜下载体滤泡中载体相互作用的相对可用性在不同队列之间可能存在显著差异，尤其是当RPE细胞与感光细胞的比率随着视觉功能的丧失而逐渐变化时。因此，目前尚不可能可靠地评论载体的交付量与三个试验之间临床结果的任何差异之间的关系。

视网膜并发症确实发生。其中包括Maguire患者2及其同事的全层黄斑裂孔(2008)以及根据当前研究P1中的高分辨率光学成像定义的中央窝变薄。这两名患者都将载体注射到包括中央凹在内的区域；两个视网膜切开位置都在中心凹区域的1–1.5 mm范围内（Maguire等。,2008;图1). 其他视网膜下注射伴视网膜脱离，包括中央凹(n个 = 4） 在视网膜上血管拱廊附近的进一步偏心处进行视网膜切开术。然而，在这些注射之前和之后，没有测量中央窝厚度的报告（班布里奇等。,2008; 马圭尔等。,2008). 根据目前的证据，中央凹附近的视网膜切开术似乎是一种不明智的策略，可能会导致中央凹结构的破坏。尽管视网膜下注射是一项复杂而复杂的显微手术，但该手术目前有许多无法控制的变量，可能会影响手术结果。这包括在从小规格针头进行载体注射期间，流体流相对于中央凹的排列，流体流的确切轨迹，以及中央凹光感受器和RPE的脆弱程度，这些光感受器和RPE因退行性视网膜病变而长期受到压力。即使在正常视网膜中，在视网膜中央凹脱离的解剖修复成功后，中央凹视力也可能不完全恢复（伯顿，1982; 罗斯和科齐，1998; 肖科特等。,2006). 在中央凹附近进行视网膜下注射预计将导致神经视网膜和视网膜色素上皮之间最大的分离，这是视网膜脱离并中央凹受累后视力恢复的相关因素之一（罗斯等。,2005). 视网膜上膜收缩，视网膜退化的常见特征（Milam等。,1998)被认为是马奎尔2号患者及其同事黄斑裂孔的可能原因(2008)但不太可能是这种并发症的唯一决定因素（莫什菲吉等。,2003).

这些早期安全性研究的疗效虽然是次要结果，但对基因治疗领域和那些寻求治疗其他无法治愈的遗传性视网膜变性的患者来说，是非常重要的（Bok，2004). 眼科研究的标准结果是视力（Ferris等。,1982). 高分辨率视力由中央凹提供，中央凹是灵长类特有的视网膜中央区域，具有最大密度的锥体光感受器和独特的神经连接（Provis等。,2005). 未证明有增加中央凹尽管九名患者中有六名患者的视网膜下注射包括了中央凹，但这九名患者的视力都很好。唯一报告视力提高的研究是马奎尔及其同事的研究(2008)但这三名患者的视力在所有研究的基线检查时都是最低的，即使在其他两项研究中，视力的改善也没有提高到基线检查时的水平。黄斑裂孔是手术造成的，但视力不明显，这一事实证实了这样一个结论：治疗后的任何积极变化都是从极严重的视力丧失到较轻的视力丧失。在较低的分辨率下（通常低于20/200），中心凹外视网膜也可能影响视力。马奎尔和同事(2008)结果表明，尽管由于被测视力水平较低，这可能是一种安慰剂效应（Miller，2008)更可能是真实的，并归因于视敏度的中央窝旁或中央窝周增加。

另一种有效性测量方法，暗适应敏感度，针对的是第65页-LCA患者：该疾病在人类和动物模型中的光敏感性降低>4-log单位（雅各布森等。,2005; 阿吉雷等。,2007; 古罗马的等。,2007年a). 马奎尔及其同事研究中的所有三名患者(2008)自我报告“在昏暗的环境中改善了视力”，但没有报道暗适应视觉测量。班布里奇和同事(2008)对所有三名患者进行了暗适应视野检查，发现只有3名患者的功能增强。在本研究中，所有患者也都报告了在昏暗光线条件下的视力增加，与基线相比，治疗后测量的暗适应敏感度在统计学上显著增加。迄今为止，没有一项研究确定敏感度的增加是由视杆或视锥感光器介导的，还是两者兼而有之。视觉周期下的视杆和视锥感光器似乎不同（Travis等。,2007)目前尚不确定如何RPE65型基因替换将对视锥细胞和视杆细胞中这一慢性异常的关键维甲酸途径产生不同的影响。

这项临床研究的下一步是什么？前两项研究的结论表明，任何疗效的缺乏都是由于基线时视网膜疾病的晚期，因此需要在中心凹内使用更高剂量，并对患有视网膜病变的儿童及时给予治疗RPE65型-LCA（班布里奇等。,2008; 马圭尔等。,2008). 然而，最近的研究表明，年龄与视网膜结构或功能之间没有密切关系，直到生命的第四个十年（雅各布森等。,2007,2008). 本研究表明，需要进一步了解视网膜下注射对视网膜结构和视觉功能的积极和消极影响。在已经接受治疗的九名患者中，值得注意的事项包括：确定任何积极治疗效果的准确视网膜位置，测量整个治疗区的效果大小，确定视杆和视锥感光器对观察到的治疗效果的贡献，建立对光感受器和RPE完整性的基线测量的任何影响的大小之间的关系，并充分解释在这个复杂的高分辨率眼科成像时代，敏感的非侵入性测试揭示的任何治疗失败。

补充材料

补充数据：
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致谢

作者感谢Richard Snyder博士指导临床载体生产，并感谢鲍威尔基因治疗毒理学核心和普通临床研究中心的成员的合作和关键帮助。该临床试验得到了国家眼科研究所（国家卫生研究院、卫生与公众服务部）U10 EY017280的资助。

作者披露声明

B.J.B.、W.W.H.和佛罗里达大学在AAV疗法的使用中拥有财务利益，并拥有一家公司（AGTC Inc.）的股权，该公司可能在未来将这项工作的某些方面商业化。宾夕法尼亚大学、佛罗里达大学，康奈尔大学持有所述基因治疗技术的专利（美国专利20070077228，“治疗或延缓失明发展的方法”）。

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文章来自人类基因治疗由以下人员提供玛丽·安·利伯特公司。